| (6) | Die folgenden Kapitel C.31 bis C.46 werden angefügt:„C.31. WACHSTUMSTEST BEI LANDPFLANZEN: UNTERSUCHUNG VON AUFLAUF UND WACHSTUM VON KEIMLINGEN
EINLEITUNG
| 1. | ¹¹⁶⁶Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 208 (2006). ¹¹⁶⁷Die Prüfmethoden werden regelmäßig unter Berücksichtigung des wissenschaftlichen Fortschritts und der Anwendbarkeit in Rechtsvorschriften überarbeitet und aktualisiert. ¹¹⁶⁸Diese aktualisierte Prüfmethode dient zur Beurteilung potenzieller Auswirkungen von Chemikalien auf das Auflaufen und das Wachstum von Keimlingen. ¹¹⁶⁹Insoweit erstreckt sie sich weder auf chronische Wirkungen noch auf Wirkungen auf die Reproduktion (d. h. Samenansatz, Blütenbildung, Reifung der Früchte). ¹¹⁷⁰Die Expositionsbedingungen und die Eigenschaften der zu prüfenden Chemikalie müssen berücksichtigt werden, um sicherzustellen, dass geeignete Prüfmethoden verwendet werden. ¹¹⁷¹(Bei der Prüfung von Metallen/Metallverbindungen sind die Wirkung des pH-Wertes und entsprechender Gegenionen zu berücksichtigen) (1). ¹¹⁷²Diese Prüfmethode ist nicht für Pflanzen vorgesehen, die Chemikaliendämpfen ausgesetzt sind. ¹¹⁷³Sie ist anzuwenden bei allgemeinen Chemikalien, Bioziden und Pflanzenschutzprodukten (auch als Pflanzenschutzmittel oder Pestizide bezeichnet). ¹¹⁷⁴Die Methode wurde ausgehend von bestehenden Methoden entwickelt (2)(3)(4)(5)(6)(7). ¹¹⁷⁵Außerdem wurden verschiedene weitere Quellen im Zusammenhang mit Prüfungen an Pflanzen berücksichtigt (8)(9)(10). ¹¹⁷⁶Definitionen der verwendeten Begriffe sind Anlage 1 zu entnehmen. |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 2. | ¹¹⁷⁷Mit der Prüfung werden die Wirkungen auf den Saatauflauf und das frühe Wachstum höherer Pflanzen beurteilt, die im Boden (oder in einer sonstigen geeigneten Bodenmatrix) der Prüfchemikalie ausgesetzt waren. ¹¹⁷⁸Das Saatgut wird mit dem mit der Prüfchemikalie behandelten Boden in Berührung gebracht und gewöhnlich 14 bis 21 Tage nach dem Auflauf von 50 % der Samen in der Kontrollgruppe auf Wirkungen untersucht. ¹¹⁷⁹Die gemessenen Endpunkte bestehen in der visuellen Beurteilung des Auflaufs, der Ermittlung der Sprosstrockenmasse (alternativ der Sprossfrischmasse) sowie in manchen Fällen der Sprosslänge und in einer Bewertung der sichtbaren schädlichen Wirkungen auf verschiedene Teile der Pflanze. ¹¹⁸⁰Diese Messungen und Beobachtungen werden mit denen bei unbehandelten Kontrollpflanzen verglichen. |
| 3. | ¹¹⁸¹Je nach erwartetem Expositionspfad wird die Prüfchemikalie entweder in den Boden (bzw. in eine künstliche Bodenmatrix) eingearbeitet oder auf die Bodenoberfläche aufgebracht, so dass der potenzielle Expositionspfad der Chemikalie angemessen nachgebildet wird. ¹¹⁸²Die Prüfchemikalie wird in die Bodenmasse eingearbeitet. ¹¹⁸³Nach der Einarbeitung wird der Boden in Töpfe gefüllt; anschließend wird das Saatgut der betreffenden Pflanzenarten gesät. ¹¹⁸⁴Bei der Applikation auf die Oberfläche wird die Chemikalie auf den in die Töpfe eingefüllten Boden ausgebracht, in den bereits die Samen gesät wurden. ¹¹⁸⁵Danach werden die Versuchseinheiten (Kontrollen und behandelte Böden mit Saatgut) unter Bedingungen gehalten, die die Keimung/das Wachstum der Pflanzen fördern. |
| 4. | ¹¹⁸⁶Je nach Ziel der Untersuchung kann die Prüfung zur Bestimmung der Dosis-Wirkungs-Kurve oder als Limit-Test mit nur einer Konzentration/Dosierung durchgeführt werden. ¹¹⁸⁷Wenn die Ergebnisse des Limit-Tests ein bestimmtes Toxizitätsniveau überschreiten (z. B. wenn Wirkungen von mehr als x % beobachtet werden), wird ein Vorversuch zur Bestimmung der Ober- und der Untergrenze der Toxizität durchgeführt. ¹¹⁸⁸Darauf folgt ein Test mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen zur Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve. Mit einer geeigneten statistischen Analyse werden die wirksame Konzentration ECx oder die wirksame Dosierung ERx (z. B. EC25, ER25, EC50, ER50) für die empfindlichsten relevanten Parameter bestimmt. ¹¹⁸⁹Außerdem können mit diesem Test die höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung (NOEC) und die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (LOEC) berechnet werden. |
INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 5. | Die folgenden Informationen sind hilfreich zur Bestimmung des voraussichtlichen Expositionspfads der jeweiligen Chemikalie und zur Konzeption der Prüfung: Strukturformel, Reinheit, Wasserlöslichkeit, Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, 1-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, Sorptionsverhalten des Bodens, Dampfdruck, chemische Beständigkeit in Wasser und Licht und biologische Abbaubarkeit. |
VALIDITÄT DES TESTS | 6. | Damit ein Test als valide gewertet werden kann, müssen die Kontrollen die folgenden Kriterien erfüllen:- —
- Es muss eine Auflaufrate von mindestens 70 % erzielt werden.
- —
- Die Keimlinge weisen keine sichtbaren phytotoxischen Wirkungen auf (z. B. Chlorose, Nekrose, Welken, Verformungen von Blättern und Stängeln), und bei den Pflanzen treten hinsichtlich Wachstumsentwicklung und Morphologie nur solche Unterschiede auf, die für die jeweilige Art normal sind.
- —
- Die mittlere Überlebensrate der aufgelaufenen Kontrollkeimlinge liegt während der Dauer der Untersuchung bei mindestens 90 %.
- —
- Die Umweltbedingungen für alle Pflanzen einer bestimmten Art sind identisch, und die Nährmedien enthalten die gleiche Menge Bodenmatrix, Trägermaterial oder Substrat derselben Herkunft.
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REFERENZCHEMIKALIE | 7. | ¹¹⁹⁵Eine Referenzchemikalie kann regelmäßig getestet werden, um sicherzustellen, dass sich die Leistungsfähigkeit des Tests, die Reaktion der jeweiligen Testpflanzen und die Testbedingungen im Laufe der Zeit nicht erheblich geändert haben. ¹¹⁹⁶Die Leistungsfähigkeit des Prüfsystems in bestimmten Labors kann auch anhand historischer Messungen der Biomasse und des Wachstums von Kontrollpflanzen beurteilt werden; diese Messungen können auch als laborinterne Qualitätskontrollmaßnahme dienen. |
BESCHREIBUNG DER METHODENaturboden — künstliches Substrat
| 8. | ¹¹⁹⁷Pflanzen können in Töpfen mit sandigem Lehm, lehmigem Sand oder sandiger Lehm-/Tonerde mit einem Anteil von bis zu 1,5 % organischem Kohlenstoff (ca. ¹¹⁹⁸3 % organische Bestandteile) gezogen werden. ¹¹⁹⁹Alternativ können auch handelsübliche Pflanzenerde oder eine künstliche Bodenmischung mit bis zu 1,5 % organischem Kohlenstoff verwendet werden. ¹²⁰⁰Tonböden sollten nicht verwendet werden, wenn bekannt ist, dass die Prüfchemikalie eine hohe Tonaffinität besitzt.. Feldboden ist bis auf eine Teilchengröße von 2 mm zu sieben, um eine gleichmäßige Struktur herzustellen und grobe Partikel abzutrennen. ¹²⁰¹Art und Beschaffenheit, der prozentuale Anteil an organischem Kohlenstoff, der pH-Wert und der Salzgehalt (gemessen an der elektrischen Leitfähigkeit des fertig aufbereiteten Bodens) werden erfasst. ¹²⁰²Der Boden ist nach einer Standard-Klassifizierung einzustufen (11). ¹²⁰³Um die Wirkung von im Boden befindlichen Erregern zu reduzieren, kann der Boden pasteurisiert oder wärmebehandelt werden. |
| 9. | ¹²⁰⁴Naturboden kann wegen unterschiedlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften und unterschiedlicher Mikrobenpopulationen die Interpretation der Ergebnisse erschweren und zu stärkeren Schwankungen führen. ¹²⁰⁵Diese Variablen wirken sich auf die Fähigkeit des Bodens zur Aufnahme von Feuchtigkeit, auf die chemische Bindungsfähigkeit, auf die Belüftung sowie auf den Gehalt an Nährstoffen und Spurenelementen aus. ¹²⁰⁶Über diese Unterschiede bei den physikalischen Faktoren hinaus bestehen Unterschiede auch im Hinblick auf chemische Eigenschaften wie z. B. den pH-Wert und das Redoxpotenzial, die die Bioverfügbarkeit der Prüfchemikalie beeinträchtigen können (12)(13)(14). |
| 10. | ¹²⁰⁷Für die Versuche mit Pflanzenschutzprodukten werden in der Regel keine künstlichen Substrate verwendet; sie können aber bei der Untersuchung allgemeiner Chemikalien hilfreich sein sowie dann, wenn die Unterschiede natürlicher Böden minimiert und eine bessere Vergleichbarkeit der Testergebnisse erzielt werden sollen. ¹²⁰⁸Die verwendeten Substrate müssen aus inertem Material bestehen, bei dem es nur zu minimalen Wechselwirkungen mit der Prüfchemikalie und/oder dem Lösungsmittelträger kommt. ¹²⁰⁹Mit Säure gereinigter Quarzsand, Mineralwolle und Glasperlen (z. B. mit einem Durchmesser von 0,35 bis 0,85 mm) haben sich als geeignete inerte Materialien erwiesen, die die Prüfchemikalie nur minimal absorbieren (15) und eine maximale Verfügbarkeit der Chemikalie zur Aufnahme durch die Wurzeln des Keimlings gewährleisten. ¹²¹⁰Vermiculit, Perlit oder sonstige stark absorbierende Materialien sind ungeeignet. ¹²¹¹Um Stress durch Nährstoffmangel zu vermeiden, sind Nährstoffe zur Förderung des Pflanzenwachstums bereitzustellen; hierzu sollten nach Möglichkeit chemische Analysen durchgeführt oder Kontrollpflanzen visuell geprüft werden. |
Kriterien für die Auswahl von Arten für die Prüfungen | 11. | Die ausgewählten Arten müssen in Bezug auf ihre taxonomische Diversität im Pflanzenreich, ihre Verbreitung, ihre Abundanz, die artenspezifischen Lebenszyklusmerkmale und ihren natürlichen Lebensraum ein angemessen breites Spektrum abdecken, um eine entsprechende Reihe von Reaktionen zu ermitteln (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Bei der Auswahl sind folgende Merkmale der möglicherweise im Test zu verwendenden Arten zu berücksichtigen:- —
- die Arten haben einheitliche Samen, die aus zuverlässigen Standardquellen für Saatgut leicht zu beschaffen sind und die regelmäßig, zuverlässig und gleichmäßig keinem; die Keimlinge wachsen einheitlich;
- —
- die Pflanzen sind für Labortests geeignet und führen zu verlässlichen und reproduzierbaren Ergebnissen innerhalb von Testanlagen sowie in unterschiedlichen Testanlagen;
- —
- die Empfindlichkeit der geprüften Arten muss sich mit den Reaktionen der Pflanzen decken, die in der durch die jeweilige Chemikalie belasteten Umgebung vorkommen;
- —
- die Arten wurden in gewissem Umfang bereits in anderen Toxizitätstests verwendet und ihr Verhalten in Herbizid-Bioassays, Schwermetall-Screenings, Tests auf Salz- oder Mineralienbelastung oder in Allelopathie-Untersuchungen deutet auf Empfindlichkeit gegenüber vielfältigen Belastungsfaktoren hin;
- —
- sie sind mit den Wachstumsbedingungen der Prüfung kompatibel;
- —
- sie erfüllen die Validitätskriterien der Prüfung.
Anlage 2 enthält einige in Tests bislang am häufigsten verwendeten Arten, Anlage 3 eine Liste potenzieller Nichtkulturpflanzen. |
| 12. | Wie viele Arten zu prüfen sind, hängt von den jeweiligen Regulierungsanforderungen ab; daher enthält diese Prüfmethode hierzu keine Angaben. |
Applikation der Prüfchemikalie | 13. | ¹²¹⁵Die Chemikalie wird in einen geeigneten Träger (z. B. Wasser, Aceton, Ethanol, Polyethylenglykol, Gummiarabikum oder Sand) gegeben. ¹²¹⁶Gemische (Fertigprodukte oder Formulierungen) mit Wirkstoffen und mit verschiedenen Hilfsstoffen können ebenfalls geprüft werden. |
Einarbeitung in den Boden/in künstliches Substrat | 14. | ¹²¹⁷In Wasser lösliche oder suspendierbare Chemikalien können in Wasser gegeben werden; anschließend wird die Lösung mithilfe einer geeigneten Mischvorrichtung mit dem Boden vermischt. ¹²¹⁸Dieser Prüfungstyp kommt dann in Betracht, wenn eine Belastung durch die Chemikalie über den Boden oder über im Boden enthaltenes Porenwasser gegeben ist und die Gefahr der Aufnahme über die Wurzeln besteht. ¹²¹⁹Die zugegebene Menge der Prüfchemikalie darf die Wasserhaltekapazität des Bodens nicht überschreiten. ¹²²⁰Bei allen Testkonzentrationen muss das gleiche Volumen Wasser zugegeben werden, jedoch nur so viel, dass das Bodensubstrat nicht verklumpt. |
| 15. | ¹²²¹Schlecht wasserlösliche Chemikalien sind in einem geeigneten flüchtigen Lösungsmittel (z. B. Aceton oder Ethanol) aufzulösen und mit Sand zu mischen. ¹²²²Das Lösungsmittel kann dann aus dem Sand abgetrennt werden, indem ein Luftstrom auf den kontinuierlich durchmischten Sand geleitet wird. ¹²²³Der so behandelte Sand wird mit dem für den Versuch vorgesehenen Boden gemischt. ¹²²⁴Eine zweite Kontrolle wird ausschließlich aus Sand und Lösungsmittel hergestellt. ¹²²⁵Bei allen Dosierungsstufen und bei der zweiten Kontrolle werden gleiche Mengen Sand, dem zunächst Lösungsmittel beigemischt und dann entzogen wurde, hinzugegeben. ¹²²⁶Für feste, unlösliche Prüfchemikalien wird trockener Boden in einer geeigneten Mischvorrichtung mit der Chemikalie gemischt. ¹²²⁷Anschließend wird der Boden in Töpfe gefüllt, und das Saatgut wird umgehend eingesät. |
| 16. | ¹²²⁸Wenn anstelle von Naturboden ein künstliches Substrat verwendet wird, können wasserlösliche Chemikalien unmittelbar vor Beginn des Tests in der Nährlösung aufgelöst werden. ¹²²⁹Chemikalien, die nicht wasserlöslich sind, aber mit einem Lösungsmittelträger in Wasser suspendiert werden können, sind mit dem Träger zur Nährlösung hinzuzugeben. ¹²³⁰Nicht wasserlösliche Chemikalien, für die es auch keinen nicht toxischen wasserlöslichen Träger gibt, sind in einem geeigneten flüchtigen Lösungsmittel aufzulösen. ¹²³¹Die Lösung wird mit Sand oder Glasperlen gemischt und in einem Vakuum-Rotationstrockner verdampft, so dass eine gleichmäßige Schicht der Chemikalie auf dem Sand oder den Perlen verbleibt. ¹²³²Vor der Befüllung der Töpfe ist eine gewogene Menge der Perlen mithilfe des gleichen organischen Lösungsmittels und der Prüfchemikalie zu extrahieren. |
Ausbringung auf die Oberfläche | 17. | ¹²³³Im Fall von Pflanzenschutzprodukten wird die Prüfchemikalie häufig ausgebracht, indem die Oberfläche des Bodens mit der Testlösung besprüht wird. ¹²³⁴Alle bei den Tests verwendeten Geräte einschließlich der Ausrüstung zur Herstellung und Applikation der Prüfchemikalie muss eine solche Konstruktion und Kapazität aufweisen, dass die Tests mit der betreffenden Ausrüstung in der erforderlichen Genauigkeit und mit reproduzierbarer Abdeckung ausgeführt werden können. ¹²³⁵Die Bodenoberfläche muss gleichmäßig abgedeckt werden. ¹²³⁶Insbesondere ist darauf zu achten, dass Chemikalien nicht von der Ausrüstung adsorbiert werden und nicht mit der Ausrüstung reagieren können (z. B. Kunststoffschläuche und lipophile Chemikalien oder Stahlbauteile und Komponenten). ¹²³⁷Die Prüfchemikalie wird in gleicher Weise wie bei einem typischen Sprühbehälter auf die Bodenoberfläche aufgesprüht. ¹²³⁸Im Allgemeinen bewegen sich die Sprühvolumina im Bereich der normalen landwirtschaftlichen Praxis, und die Volumina (Wassermenge usw.) sind zu protokollieren.) Die Düsen sind so zu wählen, dass der Boden gleichmäßig abgedeckt wird. ¹²³⁹Wenn Lösungsmittel und Träger verwendet werden, ist eine zweite Gruppe von Kontrollpflanzen ausschließlich mit dem Lösungsmittel/Träger zu behandeln. ¹²⁴⁰Bei Pflanzenschutzprodukten, die als Formulierungen geprüft werden, ist dies nicht erforderlich. |
Verifizierung der Konzentration/Dosierung der Prüfchemikalie | 18. | ¹²⁴¹Die angewendeten Konzentrationen/Dosierungen sind durch eine geeignete Analyse zu bestätigen. ¹²⁴²Bei löslichen Chemikalien können sämtliche Testkonzentrationen/-dosierungen bestätigt werden, indem die Testlösung mit der höchsten Konzentration analysiert wird und Aufzeichnungen über anschließende Verdünnungen und über die Verwendung kalibrierter Ausrüstung (z. B. kalibrierter Glasgeräte oder kalibrierte Sprühausrüstung) geführt werden. ¹²⁴³Bei unlöslichen Chemikalien muss das Gewicht der in den Boden eingebrachten Prüfchemikalie zugrunde gelegt werden. ¹²⁴⁴Wenn ein Homogenitätsnachweis erforderlich ist, muss der Boden unter Umständen analysiert werden. |
VERFAHRENVersuchsaufbau
| 19. | ¹²⁴⁵Saatgut derselben Art wird in Töpfe eingesät. ¹²⁴⁶Die Anzahl der Samen pro Topf hängt von der Art, der Größe des Topfs und der Testdauer ab. ¹²⁴⁷In den Töpfen sollten sich so viele Pflanzen befinden, dass angemessene Wachstumsbedingungen gegeben sind und die Töpfe während der Testdauer nicht zu voll werden. Die maximale Dichte dürfte je nach Samengröße bei drei bis zehn Samen pro 100 cm2 liegen. ¹²⁴⁸Zu empfehlen sind beispielsweise ein bis zwei Mais-, Soja-, Tomaten-, Gurken- oder Zuckerrübenpflanzen pro 15-cm-Topf, drei Raps- oder Erbsenpflanzen pro 15-cm-Topf und fünf bis zehn Zwiebeln oder Weizenhalme oder sonstige Pflanzen mit kleinen Samen pro 15-cm-Topf. ¹²⁴⁹Die Anzahl der Töpfe mit dem Saatgut und die der Replikate (ein Replikat ist als ein Topf definiert, deshalb stellen Pflanzen in demselben Topf kein Replikat dar) muss für eine optimale statistische Analyse ausreichend sein (21). ¹²⁵⁰Wenn im Test Arten mit wenigen großen Samen je Topf (Replikat) verwendet werden, ist eine größere Variabilität zu erwarten als bei Arten, bei denen eine größere Anzahl kleiner Samen pro Topf gesät werden kann. ¹²⁵¹Diese Variabilität kann minimiert werden, indem in alle Töpfe die gleiche Anzahl Samen gesät wird. |
| 20. | ¹²⁵²Mit Kontrollgruppen wird sichergestellt, dass die beobachteten Wirkungen ausschließlich mit der Exposition gegenüber der Prüfchemikalie in Zusammenhang stehen bzw. ausschließlich der Prüfchemikalie zuzurechnen sind. ¹²⁵³Die Kontrollgruppe muss mit Ausnahme der Exposition gegenüber der Prüfchemikalie in jeder Hinsicht mit der Prüfgruppe identisch sein. ¹²⁵⁴In einem Test müssen alle verwendeten Pflanzen einschließlich der Kontrollen aus derselben Quelle stammen. ¹²⁵⁵Um Verzerrungen zu vermeiden, sind Test- und Kontrolltöpfe zu randomisieren. |
| 21. | ¹²⁵⁶Mit einem Insektizid oder einem Fungizid behandeltes Saatgut (d. h. gebeiztes Saatgut) darf nicht verwendet werden. ¹²⁵⁷Einige Regulierungsbehörden erlauben jedoch die Verwendung bestimmter nicht systemischer Kontaktfungizide (z. B. Captan, Thiram) (22). ¹²⁵⁸Wenn Bedenken hinsichtlich der Eintragung von Erregern über das Saatgut bestehen, kann das Saatgut kurz in eine schwache Hypochloritlösung (5 %) gegeben, gründlich unter fließendem Wasser gewaschen und getrocknet werden. ¹²⁵⁹Es dürfen keine Behandlungen mit anderen Pflanzenschutzprodukten vorgenommen werden. |
Prüfbedingungen | 22. | ¹²⁶⁰Die Prüfbedingungen müssen etwa den Bedingungen entsprechen, die für ein normales Wachstum der geprüften Arten und Sorten erforderlich sind. ¹²⁶¹(Beispiele für Prüfbedingungen sind Anlage 4 zu entnehmen.) Die auflaufenden Pflanzen sind entsprechend guter gärtnerischer Praxis in Klimakammern, Phytotronanlagen oder Gewächshäusern zu halten. ¹²⁶²In Pflanzenwachstumsanlagen umfasst diese gute Praxis beispielsweise die Regelung sowie die Aufzeichnung von Temperatur, Feuchtigkeit, Kohlendioxid-Konzentration, Lichtverhältnissen (Intensität, Wellenlänge, photosynthetisch aktive Strahlung), Beleuchtungsdauer und Bewässerung in angemessener Häufigkeit (z. B. täglich), um ein gutes Wachstum der Pflanzen (gemessen an der Entwicklung der Kontrollpflanzen der ausgewählten Arten) sicherzustellen. ¹²⁶³Die Temperaturen in Gewächshäusern müssen durch Belüftungs-, Heiz- und/oder Kühlsysteme geregelt werden. Für Tests in Gewächshäusern werden im Allgemeinen die folgenden Bedingungen empfohlen:- —
- Temperatur: 22 ± 10 °C;
- —
- Feuchtigkeit: 70 ± 25 %;
- —
- Photoperiode: mindestens 16 Stunden;
- —
- Lichtintensität: 350 ± 50 μE/m2/s. Zusätzliche Beleuchtung kann erforderlich sein, wenn die Intensität unter 200 μE/m2/s, Wellenlänge 400-700 nm, absinkt (außer bei bestimmten Arten mit geringerem Lichtbedarf).
¹²⁶⁵Im Laufe der Prüfung sind die Umgebungsbedingungen zu überwachen und zu protokollieren. ¹²⁶⁶Die Pflanzen müssen in nicht porösen Kunststofftöpfen oder in glasierten Töpfen mit einer Schale oder einem Untersetzer unter dem Topf gezogen werden. ¹²⁶⁷Die Töpfe können regelmäßig umgestellt werden, um Wachstumsunterschiede (infolge unterschiedlicher Prüfbedingungen in den Wachstumsanlagen) zu minimieren. ¹²⁶⁸Außerdem müssen die Töpfe so groß sein, dass die Pflanzen normal wachsen können. |
| 23. | ¹²⁶⁹Zur Erhaltung der Wuchskraft können den Böden bei Bedarf Nährstoffe zugeführt werden. ¹²⁷⁰Notwendigkeit und Zeitpunkt der Gabe zusätzlicher Nährstoffe lassen sich durch Beobachtung der Kontrollpflanzen ermitteln. ¹²⁷¹Die Testbehältnisse sollten von unten bewässert werden (z. B. mit Glasfaserdochten). ¹²⁷²Anfänglich kann aber auch von oben bewässert werden, um die Keimung anzuregen und um bei Oberflächenapplikation das Eindringen der Chemikalie in den Boden zu erleichtern. |
| 24. | ¹²⁷³Die spezifischen Wachstumsbedingungen sollten für die zu prüfende Art und die jeweilige Prüfchemikalie angemessen sein. ¹²⁷⁴Die Pflanzen der Kontrollgruppe und die behandelten Pflanzen sind unter den gleichen Umgebungsbedingungen zu halten; es sollten jedoch geeignete Maßnahmen getroffen werden, um Kreuzexpositionen (z. B. gegen flüchtige Chemikalien) zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen sowie der Kontrollgruppen gegen die Prüfchemikalie zu vermeiden. |
Prüfung mit einer einzigen Konzentration/Dosierung | 25. | ¹²⁷⁵Bei der Bestimmung der Konzentration/Dosierung einer Chemikalie zur Durchführung eines Tests mit einer einzigen Konzentration/Dosierung (Challenge- oder Limit-Test) sind eine Reihe von Faktoren zu beachten. ¹²⁷⁶Bei allgemeinen Chemikalien gehören dazu die physikalisch-chemischen Eigenschaften der betreffenden Chemikalie. ¹²⁷⁷Bei Pflanzenschutzprodukten sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Art der Verwendung der Prüfchemikalie, die maximale Konzentration/Dosierung, die Anzahl der Aufbringungen pro Saison und/oder die Persistenz der Prüfchemikalie zu berücksichtigen. ¹²⁷⁸Um festzustellen, ob eine allgemeine Chemikalie phytotoxische Eigenschaften besitzt, kann eine Prüfung mit maximal 1 000 mg/kg trockenem Boden angemessen sein. |
Vorversuch | 26. | ¹²⁷⁹Erforderlichenfalls kann ein Vorversuch durchgeführt werden, um die in der definitiven Dosis-Wirkungs-Studie zu testenden Konzentrationen/Dosierungen zu bestimmen. ¹²⁸⁰Im Vorversuch sollten die Testkonzentrationen/-dosierungen weit auseinander liegen (z. B. 0,1, 1,0, 10, 100 and 1 000 mg/kg trockener Boden). ¹²⁸¹Im Fall von Pflanzenschutzprodukten kann von der empfohlenen oder maximalen Konzentration oder Dosierung ausgegangen werden (z. B. 1/100, 1/10, 1/1 der empfohlenen/maximalen Konzentration oder Dosierung). |
Prüfung mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen | 27. | Ziel der Prüfung mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen sind entsprechend den Anforderungen der Regulierungsbehörden die Ermittlung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung und die Bestimmung eines ECx- bzw. ERx-Werts für Auflauf, Biomasse und/oder sichtbare Wirkungen im Vergleich zu nicht exponierten Kontrollen. |
| 28. | ¹²⁸³Die Abstände zwischen den Konzentrationen oder Dosierungen und ihre Anzahl sollten hinreichend sein, um eine Dosis-Wirkungs-Beziehung zuverlässig feststellen, eine Regressionsgleichung aufstellen und die Werte für ECx oder ERx bestimmen zu können. Die ausgewählten Konzentrationen/Dosierungen müssen die zu ermittelnden ECx- oder ERx-Werte einschließen. ¹²⁸⁴Wenn beispielsweise ein EC50-Wert benötigt wird, sollten die Prüfungen bei Dosierungen durchgeführt werden, bei denen eine Wirkung im Bereich von 20-80 % zu erwarten ist. ¹²⁸⁵Hierzu werden mindestens fünf Testkonzentrationen/-dosierungen mit einer geometrischen Reihe sowie eine unbehandelte Kontrolle empfohlen, wobei sich die Konzentrationen/Dosierungen höchstens um den Faktor 3 unterscheiden sollten. ¹²⁸⁶Für jede Behandlungsgruppe und für jede Kontrollgruppe sind mindestens vier Replikate vorzusehen, und insgesamt sind mindestens 20 Samen zu verwenden. ¹²⁸⁷Bei bestimmten Pflanzen mit schlechter Keimung oder unterschiedlicher Wachstumsentwicklung sind unter Umständen auch mehr Replikate erforderlich, um die statistische Aussagekraft der Prüfung zu erhöhen. ¹²⁸⁸Wenn eine größere Anzahl an Testkonzentrationen/-dosierungen verwendet wird, kann die Anzahl der Replikate reduziert werden. ¹²⁸⁹Muss die NOEC bestimmt werden, sind unter Umständen mehr Replikate erforderlich, um die erwünschte statistische Aussagekraft zu erzielen (23). |
Beobachtungen | 29. | ¹²⁹⁰Während der Beobachtungsdauer (d. h. 14 bis 21 Tage nach Auflauf von 50 % der Kontrollpflanzen sowie gegebenenfalls auch der Kontrollen mit Lösungsmitteln) werden die Pflanzen häufig (mindestens wöchentlich, möglichst sogar täglich) auf Auflaufen und sichtbare Anzeichen von Phytotoxizität und Mortalität kontrolliert. ¹²⁹¹Am Ende der Prüfung werden der Prozentanteil der aufgelaufenen Pflanzen und die Biomasse der überlebenden Pflanzen sowie sichtbare Schädigungen an verschiedenen Pflanzenteilen protokolliert. ¹²⁹²Zu Letzteren zählen Anomalien im Aussehen der aufgelaufenen Keimlinge, Wachstumshemmungen, Chlorose, Entfärbungen, Mortalität und Wirkungen auf die Entwicklung der Pflanzen. ¹²⁹³Die endgültige Biomasse kann anhand der endgültigen durchschnittlichen Spross-Trockenmasse der überlebenden Pflanzen ermittelt werden, indem die Pflanzen am Boden abgeschnitten und dann bei 60 °C auf ein konstantes Gewicht getrocknet werden. ¹²⁹⁴Alternativ kann die endgültige Biomasse auch anhand der Spross-Frischmasse bestimmt werden. ¹²⁹⁵Die Länge der Triebe kann ein weiterer Endpunkt sein, wenn von den Regulierungsbehörden gefordert. ¹²⁹⁶Es muss ein einheitliches System für die Beurteilung sichtbarer Schäden verwendet werden, um feststellbare toxische Reaktionen bewerten zu können. ¹²⁹⁷Beispiele für qualitative und quantitative visuelle Beurteilungen sind den Quellen (23) und (24) zu entnehmen. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGStatistische Analyse
Prüfung mit einer einzigen Konzentration/Dosierung
| 30. | Für jede Pflanzenart sind die ermittelten Daten mithilfe einer geeigneten statistischen Methode zu analysieren (21). Die Wirkung bei der Testkonzentration/-dosierung ist ebenso zu protokollieren wie gegebenenfalls die Tatsache, dass bei der Testkonzentration/-dosierung eine bestimmte Wirkung nicht eintritt (z. B. festgestellte Wirkung <x % bei Konzentration oder Dosierung y). |
Prüfung mit mehreren Konzentrationen/Dosierungen | 31. | ¹²⁹⁹Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung wird mithilfe einer Regressionsgleichung aufgestellt. ¹³⁰⁰Dabei können verschiedene Modelle zur Anwendung kommen. ¹³⁰¹Für die Bestimmung der ECx- oder ERx-Werte (etwa EC25, ER25, EC50 oder ER50) und der entsprechenden Konfidenzintervalle für das Auflaufen als quantale Daten beispielsweise könnten u. a. das Logit-, das Probitmodell, die Weibull-, die Spearman-Karber- oder die Trimmed Spearman-Karber-Methode geeignet sein. Das Wachstum der Keimlinge (Gewicht und Länge) als kontinuierliche Endpunkte ECx oder ERx und die entsprechenden Konfidenzintervalle können mit geeigneten Regressionsanalysen (z. B. durch nicht lineare Regressionsanalyse nach Bruce-Versteeg (25)) bestimmt werden. Nach Möglichkeit sollte R2 bei den empfindlichsten Arten mindestens 0,7 betragen, und die Testkonzentrationen/-dosierungen sollten Wirkungen im Bereich von 20-80 % einschließen. ¹³⁰²Zur Ermittlung der NOEC sind leistungsfähige statistische Tests zu empfehlen, die auf Basis der Datenverteilung ausgewählt werden sollten (21) (26). |
Prüfbericht | 32. | ¹³⁰³Der Prüfbericht muss die Ergebnisse der Untersuchungen sowie eine detaillierte Beschreibung der Prüfbedingungen, eine eingehende Diskussion der Ergebnisse, eine Datenanalyse und die Schlussfolgerungen der Analyse enthalten. ¹³⁰⁴Eine tabellarische Übersicht und eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist beizufügen. Der Bericht muss folgende Angaben enthalten: | Prüfchemikalie:- —
- chemische Kenndaten, relevante Eigenschaften der geprüften Chemikalie (z. B. log Pow, Wasserlöslichkeit, Dampfdruck und gegebenenfalls Angaben zum Verbleib und zum Verhalten in der Umwelt);
- —
- Angaben zur Herstellung der Testlösung und zur Verifizierung von Testkonzentrationen wie unter Nummer 18 beschrieben.
|
| Im Test verwendete Art:- —
- Angaben zum Testorganismus; Art/Sorte, Pflanzenfamilien, wissenschaftliche und allgemeine Bezeichnung, möglichst genaue Angaben zu Quelle und Herkunft des Saatguts (d. h. Name des Lieferanten, Keimrate, Größenklasse der Samen, Chargen- oder Losnummer, Saatjahr oder Wachstumssaison, Datum der Bewertung der Keimung), Lebensfähigkeit usw.;
- —
- Anzahl der geprüften ein- und zweikeimblättrigen Arten;
- —
- Gründe für die Auswahl der Arten;
- —
- Beschreibung der Lagerung, der Behandlung und der Erhaltung des Saatguts.
|
| Prüfbedingungen:- —
- Prüfanlage (z. B. Wachstumskammer, Phytotron und Gewächshaus);
- —
- Beschreibung des Prüfsystems (z. B. Abmessungen der Töpfe, Topfmaterial und Bodenmenge);
- —
- Merkmale des Bodens (Textur oder Typ: Partikelverteilung und Klassifizierung, physikalische und chemische Eigenschaften einschließlich Prozentanteil organischer Materie und organischen Kohlenstoffs sowie pH-Wert);
- —
- Vorbereitung des Bodens/Substrats vor der Prüfung (natürlicher und künstlicher Boden, Sand usw.);
- —
- Beschreibung des Nährmediums, falls verwendet;
- —
- Applikation der Prüfchemikalie: Beschreibung der Applikationsmethode, Beschreibung der Ausrüstung, der Exposition (Dosierung und Volumina) einschließlich chemischer Verifizierung, Beschreibung der Kalibrierungsmethode und der Umgebungsbedingungen während der Applikation;
- —
- Wachstumsbedingungen: Lichtintensität (z. B. photosynthetisch aktive Strahlung), Photoperiode, Temperaturen (max./min.), Bewässerungsplan und -methode, Düngung;
- —
- Anzahl der Samen pro Topf, Anzahl der Pflanzen pro Dosis, Anzahl der Replikate (Töpfe) pro Expositionsrate;
- —
- Typ und Anzahl der Kontrollen (negative und/oder positive Kontrollen sowie Lösungsmittelkontrollen, falls verwendet);
- —
- Dauer der Prüfung.
|
| Ergebnisse:- —
- Tabelle mit allen Endpunkten für alle Replikate, Testkonzentrationen/-dosierungen und Arten;
- —
- Anzahl und Prozentsatz aufgelaufener Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollen;
- —
- Messungen der Biomasse (Spross-Trockenmasse oder -Frischmasse) der Pflanzen ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrollen;
- —
- Länge der Pflanzentriebe als Prozentsatz der Kontrollen, falls gemessen;
- —
- Prozentanteil sichtbarer Schäden sowie qualitative und quantitative Beschreibung der sichtbaren Schäden (Chlorose, Nekrose, Welken, Verformungen von Blättern und Stängeln sowie gegebenenfalls des Ausbleiben von Wirkungen) durch die Prüfchemikalie im Vergleich zu Kontrollpflanzen;
- —
- Beschreibung der Skala zur Beurteilung sichtbarer Schäden, wenn eine visuelle Beurteilung vorliegt;
- —
- bei Untersuchungen mit einer einzigen Dosierung ist der Prozentanteil der Schäden zu protokollieren;
- —
- ECx- oder ERx-Werte (z. B. EC50, ER50, EC25, ER25) und entsprechende Konfidenzintervalle. Wenn Regressionsanalysen vorgenommen werden, sind der Standardfehler für die Regressionsgleichung und der Standardfehler der einzelnen Parameterschätzungen (z. B. Steigung und Schnittpunkt) anzugeben;
- —
- NOEC (und LOEC), falls berechnet;
- —
- Beschreibung der statistischen Verfahren und der zugrunde gelegten Annahmen;
- —
- grafische Darstellung dieser Daten und der Dosis-Wirkungs-Beziehung der im Test verwendeten Art;
|
Abweichungen von den für diese Prüfmethode beschriebenen Verfahren und außergewöhnliche Vorkommnisse während der Prüfung. |
LITERATUR | (1) | Schrader, G., Metge, K., und Bahadir, M. (1998). ¹³¹⁰Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. ¹³¹¹Applied Soil Ecology, 7, 189-193. |
| (2) | Internationale Organisation für Normung (1993). ¹³¹³ISO 11269-1. ¹³¹⁴Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der Wirkungen von Schadstoffen auf die Bodenflora — Teil 1: Verfahren zur Messung der Wurzelwachstumshemmmung. |
| (3) | Internationale Organisation für Normung (1995). ¹³¹⁶ISO 11269-2. ¹³¹⁷Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der Wirkungen von Schadstoffen auf die Bodenflora — Teil 2: Wirkung von verunreinigten Böden auf Saatauflauf und frühes Wachstum höherer Pflanzen. |
| (4) | American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). ¹³¹⁹E 1963-98. ¹³²⁰Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. |
| (5) | U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. |
| (6) | US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:- —
- 850.4000: Background — Non-target Plant Testing;
- —
- 850.4025: Target Area Phytotoxicity;
- —
- 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);
- —
- 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;
- —
- 850.4225: Seedling Emergence, Tier II;
- —
- 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.
|
| (7) | AFNOR, X31-201. (1982). ¹³²⁴Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. ¹³²⁵AFNOR X31-203/ISO 11269-1. ¹³²⁶(1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. |
| (8) | Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). ¹³²⁸Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation.Technical Report Series No.145. ¹³²⁹Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada. |
| (9) | Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., und Zwerger, P. (1997). ¹³³¹Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Nichtzielorganismen. ¹³³²Diskussionspapier zur Risikoabschätzung und Risikominimierung für terrestrische Nichtzielorganismen (Flora und Fauna). ¹³³³Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. Nr. 48. |
| (10) | Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., und Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario, Kanada. |
| (11) | Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. ¹³³⁶1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. ¹³³⁷26:305 (1962). |
| (12) | Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, S. 163-206. |
| (13) | Beall, M.L., Jr., und Nash, R.G. (1969). ¹³⁴³Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. ¹³⁴⁴61:571-575. |
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| (15) | U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). ¹³⁴⁹Environmental Assessment Technical Handbook. ¹³⁵⁰Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 S., FDA, Washington, DC. |
| (16) | McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L., und Warren, L.W. (2002). ¹³⁵²A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. ¹³⁵³Pest Management Science vol. ¹³⁵⁴58:1161-1174. |
| (17) | Boutin, C.; Elmegaard, N., und Kjær, C. (2004). ¹³⁵⁶Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. ¹³⁵⁷Ecotoxicology vol. ¹³⁵⁸13(4): 349-369. |
| (18) | Boutin, C., und Rogers, C.A. (2000). ¹³⁶⁰Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. ¹³⁶¹Ecotoxicology vol.9(4):255-271. |
| (19) | Boutin, C., und Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. |
| (20) | Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P., und Maguire, R.J. (2000). ¹³⁶⁵Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. ¹³⁶⁶19 (10): 2532-2541. |
| (21) | OECD (2006). ¹³⁶⁸Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. ¹³⁶⁹Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. |
| (22) | Hatzios, K.K., und Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. |
| (23) | Hamill, P.B., Marriage, P.B., und G. Friesen. (1977). ¹³⁷³A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. ¹³⁷⁴Weed Science 25:386-389. |
| (24) | Frans, R.E., und Talbert, R.E. (1992). ¹³⁷⁶Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. ¹³⁷⁷Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. |
| (25) | Bruce, R.D., und Versteeg, D. J.(1992). ¹³⁷⁹A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. ¹³⁸⁰Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. |
| (26) | Kapitel C.33: Reproduktionstest mit Regenwürmern (Eisenia fetida/Eisenia andrei). |
Anlage 1Begriffsbestimmungen
Wirkstoff: ein Stoff, mit dem eine bestimmte biologische Wirkung erzielt werden soll (z. B. Bekämpfung von Insekten, Pflanzenkrankheiten oder Unkräutern im jeweils behandelten Bereich); auch als Wirkstoff technischer Qualität bezeichnet.
Chemikalie: ein Stoff oder eine Mischung.
Pflanzenschutzmittel oder Pestizide: Stoffe mit spezifischer biologischer Wirkung, die gezielt zum Schutz von Pflanzen gegen Schädlinge (z. B. Pilze, Insekten und konkurrierende Pflanzen) eingesetzt werden.
ECx, Konzentration mit einer Wirkung von x %, oder ERx, Dosis mit einer Wirkung von x %: die Konzentration oder Dosis, bei der es in einem Test zu einer unerwünschten Änderung des Endpunkts um x % gegenüber der jeweiligen Kontrolle kommt (z. B. Reduzierung des Auflaufs, des Sprossgewichts, der endgültigen Anzahl vorhandener Pflanzen oder Zunahme sichtbarer Schäden um 25 % oder 50 %, entsprechend einer EC25/ER25 bzw. EC50/ER50).
Auflauf: Austreten der Koleoptile (Keimscheide) oder der Kotyledone (Keimblatt) aus dem Boden.
Formulierung: für den Handel hergestelltes Produkt mit dem Wirkstoff; auch als Endpräparat oder für den typischen Verwendungszweck bestimmtes Endprodukt bezeichnet.
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration): niedrigste geprüfte Konzentration der Prüfchemikalie, bei der eine Wirkung beobachtet wurde. Bei dieser Prüfung hat die der LOEC entsprechende Konzentration innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle eine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05) und ist höher als die NOEC.
Nichtzielpflanzen: Pflanzen außerhalb des Zielpflanzenbereichs. Bei Pflanzenschutzmitteln bezieht diese Bezeichnung sich gewöhnlich auf Pflanzen außerhalb des behandelten Bereichs.
NOEC (No observed Effect Concentration): Die höchste Konzentration der Prüfchemikalie, bei der keine Wirkung beobachtet wurde. Bei diesem Test hat die der NOEC entsprechende Konzentration innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle keine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05).
Phytotoxizität: in Messungen und visuellen Prüfungen festgestellte schädliche Abweichungen vom normalen Aussehen und Wachstum der Pflanzen aufgrund der Wirkung einer bestimmten Chemikalie.
Replikat: Versuchseinheit, die die Kontrollgruppe und/oder die Behandlungsgruppe repräsentiert. Bei diesen Untersuchungen ist der Topf als Replikat definiert.
Visuelle Prüfung: Beurteilung des sichtbaren Schadens anhand von Beobachtungen zur Haltung der Pflanze, zur Wuchskraft, zu Missbildungen, Chlorose, Nekrose sowie zum Gesamteindruck im Vergleich zu einer Kontrolle.
Prüfchemikalie: ein Stoff oder eine Mischung, der bzw. die nach dieser Methode geprüft wird.
Anlage 2
Liste der Üblicherweise für Pflanzentests verwendeten Arten
| Familie | Art | Gewöhnliche Bezeichnung | | DICOTYLEDONAE | | Apiaceae (Umbelliferae) | Daucus carota | Möhre | | Asteraceae (Compositae) | Helianthus annuus | Sonnenblume | | Asteraceae (Compositae) | Lactuca sativa | Gartensalat | | Brassicaceae (Cruciferae) | Sinapis alba | Weißer Senf | | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica campestris var. chinensis | Chinakohl | | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica napus | Raps | | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica oleracea var. capitata | Kohl | | Brassicaceae (Cruciferae) | Brassica rapa | Rübsen | | Brassicaceae (Cruciferae) | Lepidium sativum | Gartenkresse | | Brassicaceae (Cruciferae) | Raphanus sativus | Rettich | | Chenopodiaceae | Beta vulgaris | Rübe | | Cucurbitaceae | Cucumis sativus | Gurke | | Fabaceae (Leguminosae) | Glycine max (G. soja) | Sojabohne | | Fabaceae (Leguminosae) | Phaseolus aureus | Mungobohne | | Fabaceae (Leguminosae) | Phaseolus vulgaris | Gartenbohne | | Fabaceae (Leguminosae) | Pisum sativum | Erbse | | Fabaceae (Leguminosae) | Trigonella foenum-graecum | Bockshornklee | | Fabaceae (Leguminosae) | Lotus corniculatus | Gewöhnlicher Hornklee | | Fabaceae (Leguminosae) | Trifolium pratense | Wiesenklee | | Fabaceae (Leguminosae) | Vicia sativa | Futterwicke | | Linaceae | Linum usitatissimum | Flachs | | Polygonaceae | Fagopyrum esculentum | Buchweizen | | Solanaceae | Solanum lycopersicon | Tomate | | MONOCOTYLEDONAE | | Liliaceae (Amarylladaceae) | Allium cepa | Zwiebel | | Poaceae (Gramineae) | Avena sativa | Hafer | | Poaceae (Gramineae) | Hordeum vulgare | Gerste | | Poaceae (Gramineae) | Lolium perenne | Deutsches Weidelgras | | Poaceae (Gramineae) | Oryza sativa | Reis | | Poaceae (Gramineae) | Secale cereale | Roggen | | Poaceae (Gramineae) | Sorghum bicolor | Körner-Sorghum, Mohrenhirse | | Poaceae (Gramineae) | Triticum aestivum | Weichweizen | | Poaceae (Gramineae) | Zea mays | Mais |
Anlage 3Liste potenzieller Nichtkulturpflanzen
OECD-Liste potenzieller Arten für Toxizitätsprüfungen an Pflanzen
Hinweis: Die folgende Tabelle enthält Informationen zu 52 Nichtkulturpflanzen (Literaturangaben sind jeweils in Klammern nachgestellt). ¹³⁹⁹Die genannten Auflaufraten stammen aus der veröffentlichten Literatur und dienen nur als Anhaltspunkt. ¹⁴⁰⁰In Abhängigkeit von der Herkunft des Saatguts und anderen Faktoren kann es im Einzelfall zu Abweichungen kommen.
FAMILIE Botanischer Name der Art(gemeiner deutscher Name)
| Lebensdauer und Lebensraum | Samengewicht(mg)
| Photoperiode für Keimung oder Wachstum | Saattiefe(mm)
| Keimzeit(Tage)
| Spezialbehandlungen | Toxizitätstest | Saatgut-Anbieter | Sonstige Literatur | APIACEAETorilis japónica
(Gewöhnlicher Klettenkerbel)
| А, В gestörte Flächen, Hecken, Weiden (16, 19) | 1,7 – 1,9 (14, 19) | L = D (14) | 0(1, 19)
| 5 (50 %) (19) | Stratifikation (Kälte) (7, 14, 18, 19); unter Umständen ist eine Reifung erforderlich (19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 19); keine Spezialbehandlungen (5) | NACH (5) | | | ASTERACEAEBellis perennis
(Gänseblümchen)
| ΡGrasflächen, Äcker, Rasen (16, 19)
| 0,09-0,17 (4, 19) | L = D (14) | 0(4)
| 3 (50 %) (19)11 (100 %) (18)
| Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (18, 19); keine Spezialbehandlungen (4, 14) | NACH (4) | A, D, F | 7 | Centaurea cyanus(Kornblume)
| AFelder, Straßenränder, offene Lebensräume (16)
| 4,1-4,9 (4, 14) | L = D (14) | 0-3 (2, 4, 14) | 14-21 (100 %) (14) | keine Spezialbehandlungen (2, 4) | NACH (2,4) | A, D, E, F | 7 | Centaurea nigra(Schwarze Flockenblume)
| ΡFelder, Straßenränder, offene Lebensräume (16, 19)
| 2,4-2,6 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 3 (50 %) (19)4 (97 %) (18)
| Reifung kann erforderlich sein (18, 19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (19); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 26) | NACH (5, 22, 26) | a | | Inula heleniumAlant
| Ρfeuchte, gestörte Standorte
(16)
| 1 – 1,3 (4, 14, 29) | | 0(4, 29)
| | keine Spezialbehandlungen (4) | NACH (4) | A, F | | Leontodon hispidus(Steifhaariger Löwenzahn)
| ΡFelder, Straßenränder, gestörte Flächen (16, 19)
| 0,85 -1,2 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 4 (50 %) (19)7 (80 %) (18)
| Keimung durch Bestrahlung gehemmt (17, 18, 19); keine Spezialbehandlungen (5, 23) | NACH (5, 22, 23) | | | Rudbeckia hirta(Rudbeckie
| Β, Ρ gestört(16)
| 0,3 (4, 14) | L = D (14) | 0(4, 33)
| < 10 (100 %) (33) | keine Spezialbehandlungen(4, 14, 33)
| NACH (4, 33) | C, D, E, F | | Solidago canadensisKanadische Goldrute
| ΡWeiden, offene Flächen (16)
| 0,06-0,08 (4, 14) | L = D (11) | 0(4)
| 14-21(11)
| zu gleichen Teilen mit Sand mischen und 24 h in 500 ppm GA einweichen (11); keine Spezialbehandlungen (4) | NACH (4) | E, F | | Xanthium pensylvanicum(Spitzklette)
| AFelder, offene Lebensräume (16)
| 25-61 (14, 29) | | 0(1)5(29)
| | Keimung kann durch Dunkelheit gehemmt werden (1); 12 h in warmem Wasser einweichen (29) | VOR UND NACH (31) | a | | Xanthium spinosum(Dornige Spitzklette)
| Aoffene Lebensräume (16)
| 200 (14) | L = D (14)L > D (6)
| 10(6)
| | Skarifikation (14); keine Spezialbehandlungen (6) | VOR UND NACH (6) | a | | Xanthium strumarium(Gewöhnliche Spitzklette)
| AFelder, offene Lebensräume (16)
| 67,4 (14) | L = D (14) | 10-20 (6, 21) | | keine Spezialbehandlungen(6, 14, 21)
| VOR UND NACH (6, 21, 28, 31) | a | | BRASSICACEAECardamine pratensis
(Wiesenschaumkraut)
| ΡFelder, Straßenränder, Rasen (16, 19)
| 0,6 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19)15 (98 %) (18)
| Keimung durch Bestrahlung gehemmt (18, 19); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 22) | NACH (5, 22) | F | | CARYOPHYLLACEAELychnis flos-cuculi
(Kuckucks-Lichtnelke)
| Ρ(16)
| 0,21 (14) | L = D (14) | | < 14 (100 %) (14, 25) | Reifung kann erforderlich sein (18); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 15, 22-26) | NACH (5, 15, 22-26) | F | | ChenopodiaceaeChenopodium album
(Weißer Gänsefuß)
| aFeldränder, gestörte Flächen (16, 19)
| 0,7-1,5 (14, 19, 34) | L = D (14) | 0(1, 19)
| 2 (50 %) (19) | Behandlung je nach Farbe der Samen unterschiedlich (19); trockene Keimruhe (19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 18, 19); Stratifikation (Kälte) (18); keine Spezialbehandlungen (14, 34) | VOR UND NACH (28, 31, 34) | a | 32 | CLUSIACEAEHypericum perforatum
(Echtes Johanniskraut)
| ΡFelder, Äcker, offene Lebensräume (16, 19)
| 0,1-0,23(14, 19)
| L= D(14)
| 0(1, 19)
| 3 (19)11 (90 %) (18)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 18, 19)keine Spezialbehandlungen (5, 14, 15, 25, 27)
| NACH(5, 15, 25, 27)
| A, E, F | | CONVOLVULACEAEIpomoea hederacea
(Efeu-Prunkwinde)
| aStraßenränder, offene Lebensräume, Maisfelder (16)
| 28,2(14)
| L > D(6, 10)
| 10-20(6, 10, 21)
| 4 (100 %)(10)
| Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1)keine Spezialbehandlungen (6, 21)
| VOR UND NACH(6, 12, 21, 28)
| a | | CYPERACEAECyperus rotundus
(Knolliges Zypergras)
| ΡÄcker, Weiden, Straßenränder (16, 30)
| 0,2(14)
| L= D(14)
| 0 (1)10-20 (6, 10)
| 12 (91 %)(10)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1)keine Spezialbehandlungen (6, 10, 14)
| VOR UND NACH(6, 28, 31)
| B | 7 | FABACEAELotus corniculatus
(Gewöhnlicher Hornklee)
| ΡGrasflächen, Straßenränder, offene Lebensräume (16, 19)
| 1-1,67(14, 19)
| L = D (14) | | 1 (50 %)(19)
| Skarifikation (14, 19)Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (18, 19); keine Spezialbehandlungen (23, 25)
| NACH(5, 23, 25)
| A, D, E, F | | Senna obtusifolia(Senna)
| Afeuchte Wälder (16)
| 23-28(9)
| L = D (14)L > D (9)
| 10-20(6,9)
| | Samen 24 h in Wasser einweichen (9)Skarifikation (14); je nach Farbe unterschiedliche Lebensfähigkeit der Samen (1); keine Spezialbehandlungen (6)
| NACH(6,9)
| a | | Sesbania exaltata(Hanf)
| ASchwemmboden (16)
| 11-13(9, 14)
| L > D (9) | 10-20(9, 21)
| | Samen 24 h in Wasser einweichen (9)Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); keine Spezialbehandlungen (21)
| VOR UND NACH(9, 21, 28, 31)
| a | | Trifolium pratense(Wiesenklee)
| ΡFelder, Straßenränder, Äcker (16, 19)
| 1,4-1,7(14, 19)
| L= D (14) | | 1 (50 %)(19)
| Skarifikation (14, 18)unter Umständen Reifung erforderlich (19); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1, 19); keine Spezialbehandlungen (5)
| NACH(5)
| A, E, F | | LAMIACEAELeonurus cardiaca
(Echtes Herzgespann)
| Ρoffene Flächen (16)
| 0,75-1,0(4, 14)
| L= D (14) | 0(4)
| | keine Spezialbehandlungen(4, 14)
| NACH(4)
| F | | Mentha spicata(Grüne Minze)
| Ρfeuchte Gebiete (16)
| 2,21(4)
| | 0(4)
| | keine Spezialbehandlungen(4)
| NACH(4)
| F | | Nepeta cataria(Echte Katzenminze)
| Ρgestörte Flächen (16)
| 0,54(4, 14)
| L= D (14) | 0(4)
| | keine Spezialbehandlungen(2, 4, 14)
| NACH(2,4)
| F | | Prunella vulgaris(Gewöhnliche Braunelle)
| ΡÄcker, Grasflächen, gestörte Standorte (16, 19)
| 0,58 -1,2(4, 14, 19)
| L= D (14) | 0(4, 19)
| 5 (50 %) (19)7 (91 %) (18)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19)stärkere Keimung bei größeren Samen (1); keine Spezialbehandlungen (4, 14, 22)
| NACH(4, 22)
| A, F | | Stachys officinalis(Echte Betonie)
| ΡGrasflächen, Feldränder (19)
| 14-18(14, 19)
| L= D (14) | | 7 (50 %)(19)
| keine Spezialbehandlungen(5, 14, 22)
| NACH(5, 22)
| F | | MALVACEAEAbutilon theophrasti
(Europäische Samtpappel)
| AFelder, offene Lebensräume (16)
| 8,8(14)
| L= D (14) | 10-20(6, 10, 21)
| 4 (84 %)(10)
| Skarifikation (14)keine Spezialbehandlungen (5, 10, 21)
| VOR UND NACH(6, 22, 28, 31)
| A, F | | Sida spinosaSida spinosa
| aFelder, Straßenränder (16)
| 3,8(14)
| L= D (14) | 10-20(6, 21)
| | Skarifikation (14)Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); keine Spezialbehandlungen (6, 21)
| VOR UND NACH(6, 21, 28, 31)
| A, F | | PAPAVERACEAEPapaver rhoeas
(Klatschmohn)
| aFelder, Äcker, gestörte Standorte (16, 19)
| 0,1 -0,3(4, 14, 19, 29)
| L= D (14) | 0(4, 29)
| 4 (50 %)(19)
| Stratifikation (Kälte) und Skarifikation (1, 19, 32)keine Spezialbehandlungen (4, 14, 29)
| NACH(4)
| A, D, E, F, G | | POACEAEAgrostis tenuis
(Rotes Straußgras)
| Rasen, Weiden (16) | 0,07 (14) | L > D (Ю) | 20 (10) | 10 (62 %) (10) | Keimung durch Bestrahlung gehemmt (1, 17-19); keine Spezialbehandlungen (10) | NACH (10) | A, E | | Alopecurus myosuroides(Acker-Fuchsschwanzgras)
| AFelder, offene Lebensräume (16)
| 0,9-1,6(29, 34)
| L = D (14) | 2(29)
| < 24 (30 %) (34) | Skarifikation (14); Behandlung mit 101 mg/l KNO3 (14); Stratifikation (Wärme) (1) Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (34) | VOR UND NACH(28, 34)
| a | 32 | Avena fatua(Flughafer)
| AAnbaugebiete, offene Lebensräume (16)
| 7-37,5 (14, 30) | L = D (14)L > D (6)
| 10-20 (6, 10) | 3 (70 %) (18) | Skarifikation (7, 32); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1)Stratifikation (Kälte) (1, 18); keine Spezialbehandlungen (6, 10, 14)
| VOR UND NACH (6, 10, 28, 31) | a | | Bromus tectorum(Dach-Trespe)
| AFelder, Straßenränder, Äcker (16)
| 0,45-2,28 (14, 29) | L = D (14) | 3 (29) | | Reifungsperiode (1, 7, 32); Keimung durch Licht gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (14) | VOR UND NACH (28, 31) | a | | Cynosurus cristatus(Kammgras)
| PFelder, Straßenränder, offene Lebensräume (16, 19)
| 0,5-0,7 (14, 19, 29) | L = D (14) | 0 (29) | 3 (50 %) (19) | Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (19); keine Spezialbehandlungen (14, 29) | NACH (5) | a | | Digitaria sanguinalis(Blutrote Fingerhirse)
| AFelder, Rasen, offene Lebensräume (16)
| 0,52-0,6 (14, 30) | L = D (14) | 10-20 (21) | 7 (75 %)14 (94 %) (7)
| Skarifikation, Stratifikation (Kälte) und Reifung (1, 7, 14, 32); Behandlung mit 101 mg/l KNO3 (14); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (21) | VOR UND NACH (18, 25, 31) | a | | Echinochloa crusgalli(Hühnerhirse)
| A(16)
| 1,5 (14) | L = D (14)L > D (3)
| 10-20 (7, 21) | | Skarifikation (7, 32); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); keine Spezialbehandlungen (3, 14, 21) | VOR UND NACH (3, 21, 28, 31) | a | | Elymus canadensis(Kanada-Quecke)
| PUferzonen, gestörte Standorte (16)
| 4-5 (14, 30) | L = D (11) | 1(11)
| 14-28(11)
| keine Spezialbehandlungen(2, 11)
| NACH (2) | C, D, E | | Festuca pratensis(Wiesenschwingel)
| PFelder, feuchte Gebiete (16, 19)
| 1,53-2,2 (16, 19) | L = D (14)L > D (10)
| 20 (10) | 9 (74 %) (10)2 (50 %) (19)
| keine Spezialbehandlungen(10, 19)
| NACH (10) | a | 7 | Hordeum pusillum(Gerste)
| AWeiden, Straßenränder, offene Lebensräume (16)
| 3,28 (14) | | | | Stratifikation (Wärme) (1); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1) | VOR (31) | | 7 | Phieum pratense(Wiesenlieschgras)
| PWeiden, Äcker, gestörte Standorte (16, 19)
| 0,45 (14, 19) | L > D (10, 14) | 0-10 (10, 19) | 2 (74 %) (10)8 (50 %) (19)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (19); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (17); keine Spezialbehandlungen (10, 14, 17, 19) | NACH (10) | A, E | | POLYGONACEAEPolygonum convolvulus
(Windenknöterich)
| Aoffene Lebensräume, Straßenränder (16)
| 5-8 (4, 14, 29) | L = D (20) | 0-2 (4, 29) | | Stratifikation (Kälte) über 4-8 Wochen (1, 2, 4, 20, 29); Keimung durch Bestrahlung nicht gehemmt (1) | VOR UND NACH (1, 2, 20, 28, 31) | a | 32 | Polygonum lapathifolium(Ampfer-Knöterich)
| Afeuchter Boden (16)
| 1,8-2,5 (14) | L > D (6) | | 5 (94 %) (18) | Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (1); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18); Stratifikation (Kälte) (1); keine Spezialbehandlungen (5) | VOR UND NACH (6) | A, E | | Polygonum pennsylvanicum(Vogelknöterich)
| AFelder, offene Lebensräume (16)
| 3,6-7 (14, 29) | | 2 (29) | | Stratifikation (Kälte) über 4 Wochen bei 0-5 °C (1, 29); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1) | VOR (31) | A, E | | Polygonum periscaria(Floh-Knöterich)
| Agestörte Flächen, Äcker (16, 19)
| 2,1 -2,3 (14, 19) | L > D (13) | 0 (19) | < 14 (13)2 (50 %) (19)
| Skarifikation, Stratifikation (Kälte), Behandlung mit GA (14); Stratifikation (Kälte), Reifung (17-19); Keimung durch Dunkelheit gehemmt (19); keine Spezialbehandlungen (13) | NACH (13) | a | 32 | Rumex crispus(Krauser Ampfer)
| PÄcker, Straßenränder, offene Flächen (16, 19)
| 1,3-1,5 (4, 14, 19) | L = D (14, 33) | 0(4, 19, 33)
| 3 (50 %) (19)6 (100 %) (33)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19); Reifung kann erforderlich sein (18); keine Spezialbehandlungen (4, 14, 33) | NACH (4, 33) | A, E | 32 | PRIMULACEAEAnagallis arvensis
(Acker-Gauchheil)
| AÄcker, Grasflächen, gestörte Standorte (16, 19)
| 0,4-0,5 (4, 14, 19) | L = D (14) | | 1 (50 %) (19) | Stratifikation (Kälte), Behandlung mit GA (1,14, 18, 19, 32); Licht zur Keimung erforderlich (1); keine Spezialbehandlungen (2, 4) | NACH (2,4) | A, F | | RANUNCULACEAERanunculus acris
(Scharfer Hahnenfuß)
| ΡÄcker, Straßenränder, offene Flächen (16, 19)
| 1,5-2 (14, 19, 29) | L = D (14) | 1(29)
| 41 -56 (19, 29) | keine Spezialbehandlungen(5, 14, 22, 24 -26)
| NACH (5, 22, 24-26) | | 32 | ROSACEAEGeum urbanum
(Echte Nelkenwurz)
| ΡHecken, feuchte Gebiete
(16, 19)
| 0,8-1,5 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19)16 (79 %) (18)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19); Stratifikation (Wärme) (1); keine Spezialbehandlungen (5, 14, 22, 25, 26) | NACH (5, 22, 25, 26) | a | | RUBIACEAEGalium aparine
(Kletten-Labkraut)
| aÄcker, feuchte Gebiete, gestörte Standorte (16, 19)
| 7-9 (14, 19) | L = D (14) | | 5 (50 %) (19)6 (100 %) (18)
| Stratifikation (Kälte) (1, 18, 19); Keimung durch Bestrahlung nicht beeinträchtigt (18, 19); Keimung durch Licht gehemmt (1); keine Spezialbehandlungen (6, 14) | VOR UND NACH (6, 28) | a | 32 | Galium mollugo(Wiesen-Labkraut)
| ΡWallhecken, offene Flächen (8)
| 7(29)
| L = D (14) | 2(29)
| | keine Spezialbehandlungen(5, 14, 22, 24, 26, 29)
| NACH (5, 22, 24, 26) | a | | SCROPHULARIACEAEDigitalis purpurea
(Roter Fingerhut)
| Β, Ρ Hecken, offene Flächen (16, 19) | 0,1-0,6 (4, 14, 19) | L = D (14) | 0(4, 19)
| 6 (50 %) (19)8 (99 %) (18)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (1, 17-19); keine Spezialbehandlungen (4, -26, 22) | NACH (4, 22-26) | D, G, F | | Veronica persica(Persischer Ehrenpreis)
| AÄcker, Grasflächen, gestörte Standorte (16, 19)
| 0,5-0,6 (14, 19) | L = D (14) | 0 (19) | 3(19)5 (96 %) (18)
| Keimung durch Dunkelheit gehemmt (18, 19); Stratifikation (Kälte) (18); keine Spezialbehandlungen (14) | VOR UND NACH (28) | a | 32 |
Genannte Saatgutanbieter| Anbieter | Anbieterinformationen | | A | | Herbiseed | | New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ, ENGLAND | | +44 1189 349 464 | | www.herbiseed.com |
| | B | | Tropilab Inc. | | 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948, USA | | +1 727 344 — 4050 | | www.tropilab.com |
| | C | | Pterophylla — Native Plants & Seeds | | #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0, KANADA | | +1 519 586 — 3985 |
| | D | | Applewood Seed Co. | | 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002, USA | | +1 303 431 — 7333 | | www.applewoodseed.com |
| | E | | Ernst Conservation Seeds | | 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335, USA | | +1 800 873 — 3321 | | www.ernstseed.com |
| | F | | Chiltern Seeds | | Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB, ENGLAND | | +44 1229 581137 | | www.chiltemseeds.co.uk |
| | G | | Thompson & Morgan | | P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7, KANADA | | +1 800 274 — 7333 | | www.thompson-morgan.com |
|
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| (24) | Marrs, R.H., Frost, A.J., und Plant, R.A. 1991. ¹⁴⁶⁰Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. ¹⁴⁶¹Environmental Pollution, 73:25-42. |
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| (29) | Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) |
| (30) | USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA |
| (31) | USEPA. 1999. ¹⁴⁷⁸One-Liner Database. ¹⁴⁷⁹[U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. |
| (32) | Webster, R.H. 1979. ¹⁴⁸¹Technical Report No. ¹⁴⁸²56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. ¹⁴⁸³Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. |
| (33) | White, A. L., und Boutin, C. ¹⁴⁸⁵(National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. ¹⁴⁸⁶Persönliche Auskunft. |
| (34) | Zwerger, P., und Pestemer, W., 2000. ¹⁴⁸⁸Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. ¹⁴⁸⁹PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. |
Anlage 4Beispiele für geeignete Wachstumsbedingungen für bestimmte Pflanzenarten
Die folgenden Bedingungen haben sich für zehn Pflanzenarten als geeignet erwiesen und können als Orientierung auch für Prüfungen bestimmter anderer Arten in Wachstumskammern dienen:
| Kohlendioxid-Konzentration: 350 ± 50 ppm; |
| Relative Feuchte: 70 % ± 5 % in Lichtperioden und 90 % ± 5 % in Dunkelperioden |
| Temperatur: 25 ± 3 °C am Tag und 20 ± 3 °C in der Nacht; |
| Photoperiode: 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit; Licht mit einer Wellenlänge von durchschnittlich 400 bis 700 nm; |
| Licht: Leuchtdichte 350 ± 50 μE/m2/s, gemessen an der Vegetationsoberfläche. |
Die Kulturpflanzenarten sind:- —
- Tomate (Solanum lycopersicon);
- —
- Gurke (Cucumis sativus);
- —
- Salat (Lactuca sativa);
- —
- Sojabohne (Glycine max);
- —
- Kohl (Brassica oleracea var. capitata);
- —
- Möhre (Daucus carota);
- —
- Hafer (Avena sativa);
- —
- Deutsches Weidelgras (Lolium perenne);
- —
- Mais (Zea mays);
- —
- Zwiebel (Allium cepa).
C.32. ENCHYTRAEEN-REPRODUKTIONSTESTEINLEITUNG
| 1. | ¹⁴⁹¹Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 220 (2004). Sie soll eingesetzt werden, um die Wirkung von Chemikalien auf die Reproduktionsleistung von Enchytraeen (Enchytraeus albidus, Henle 1873) im Boden zu beurteilen. ¹⁴⁹²Die Prüfung beruht im Wesentlichen auf einer vom deutschen Umweltbundesamt entwickelten (1) und in einem Ringtest (2) geprüften Methode. ¹⁴⁹³Darüber hinaus wurden noch weitere Methoden zur Untersuchung der Toxizität von Chemikalien für Enchytraeen und Regenwürmer in Betracht gezogen (3)(4)(5)(6)(7)(8). |
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN | 2. | ¹⁴⁹⁴Bodenbewohnende Anneliden der Gattung Enchytraeus sind ökologisch relevante Arten für Ökotoxizitätsprüfungen. ¹⁴⁹⁵Enchytraeen kommen zwar häufig in Böden vor, in denen auch Regenwürmer leben; bei vielen Böden treten sie aber auch dann in großer Anzahl auf, wenn keine Regenwürmer vorkommen. ¹⁴⁹⁶Enchytraeen können sowohl in Labortests als auch in Halbfreiland- und in Freilandtests verwendet werden. ¹⁴⁹⁷Aus praktischer Sicht ist festzustellen, dass viele Enchytraeus-Arten leicht zu handhaben und zu züchten sind; außerdem ist ihre Regenerationszeit erheblich kürzer als die von Regenwürmern. Ein Reproduktionstest mit Enchytraeen dauert nur 4 bis 6 Wochen (gegenüber 8 Wochen bei Regenwürmern (Eisenia fetida)). |
| 3. | Allgemeine Informationen zur Ökologie und zur Ökotoxikologie von Enchytraeen in der terrestrischen Umwelt sind den Quellen (9), (10), (11) und (12) zu entnehmen. |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 4. | ¹⁴⁹⁹Adulte Enchytraeen werden verschiedenen Konzentrationen der in künstlichen Boden eingemischten Prüfchemikalie ausgesetzt. ¹⁵⁰⁰Die Prüfung kann in zwei Schritte unterteilt werden: a) einen Vorversuch zur Feststellung des geeigneten Konzentrationsbereichs (falls keine hinreichenden Informationen verfügbar sind), in dem die Mortalität nach zweiwöchiger Exposition als wesentlicher Endpunkt beurteilt wird, und b) einen definitiven Reproduktionstest, bei dem die Gesamtzahl an juvenilen Tieren eines Elterntiers und das Überleben der Elterntiere bewertet werden. ¹⁵⁰¹Der definitive Test dauert sechs Wochen. ¹⁵⁰²Nach den ersten drei Wochen werden die adulten Würmer herausgenommen und die morphologischen Änderungen protokolliert. ¹⁵⁰³Nach weiteren drei Wochen werden die juvenilen Tiere gezählt, die aus den von den adulten Tieren hergestellten Kokons geschlüpft sind. Die Reproduktionsleistung der Tiere, die der Prüfchemikalie ausgesetzt waren, wird mit der Reproduktionsleistung der Kontrollgruppe(n) verglichen, um i) die NOEC (höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung) und/oder ii) mit dem ECx-Wert (z. B. EC10 oder EC50) (mithilfe eines Regressionsmodells) die Konzentration zu ermitteln, bei der die Reproduktionsleistung um x % reduziert wird. Die Testkonzentrationen müssen den ECx-Bereich einschließen (z. B. EC10 und EC50), damit der ECx-Wert durch Interpolation anstelle einer Extrapolation ermittelt werden kann. |
INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 5. | ¹⁵⁰⁴Die Wasserlöslichkeit, der log-Kow-Wert, der Boden-Wasser-Verteilungskoeffizient (z. B. Kapitel C.18 oder C.19) und der Dampfdruck der Prüfchemikalie sollten bekannt sein. ¹⁵⁰⁵Wünschenswert sind zudem Informationen über den Verbleib der Chemikalie im Boden (z. B. die Photolyse- und die Hydrolyserate). |
| 6. | ¹⁵⁰⁶Die Prüfmethode kann sowohl für wasserlösliche als auch für nicht lösliche Chemikalien verwendet werden. ¹⁵⁰⁷Allerdings ist die Prüfchemikalie entsprechend unterschiedlich einzubringen. ¹⁵⁰⁸Für flüchtige Chemikalien ist die Prüfmethode nicht geeignet (d. h. für Chemikalien, bei denen die Henry-Konstante oder der Luft-Wasser-Verteilungskoeffizient größer als eins ist, oder für Chemikalien, bei denen der Dampfdruck bei 25 °C mehr als 0,0133 Pa beträgt. |
VALIDITÄT DES TESTS | 7. | Damit ein Test als valide gewertet werden kann, sollten die Kontrollen die folgenden Kriterien erfüllen:- —
- Die Mortalität der adulten Tiere darf am Ende des Vorversuchs und nach den ersten drei Wochen des Reproduktionstests nicht mehr als 20 % betragen;
- —
- wenn bei der Vorbereitung des Tests 10 adulte Tiere pro Gefäß verwendet wurden, sollten sich am Ende des Tests durchschnittlich mindestens 25 juvenile Tiere pro Gefäß entwickelt haben;
- —
- der Variationskoeffizient um die durchschnittliche Anzahl an juvenilen Tieren sollte am Ende des Reproduktionstests höchstens 50 % betragen.
¹⁵¹⁰Wenn ein Test die genannten Validitätskriterien nicht erfüllt, ist er zu beenden, sofern keine besonderen Gründe für seine Fortsetzung vorliegen. ¹⁵¹¹Die Begründung ist in den Prüfbericht aufzunehmen. |
REFERENZCHEMIKALIE | 8. | ¹⁵¹²Eine Referenzchemikalie ist entweder regelmäßig zu prüfen oder in jeden einzelnen Test mit einzubeziehen, um sicherzustellen, dass sich die Reaktion der Testorganismen im Laufe der Zeit nicht signifikant geändert hat. ¹⁵¹³Eine geeignete Referenzchemikalie ist Carbendazim, für das gezeigt wurde, dass es die Lebens- und Reproduktionsfähigkeit von Enchytraeen beeinträchtigt (13)(14); außerdem können Chemikalien mit gut bekannten Toxizitätsdaten verwendet werden. ¹⁵¹⁴AgrEvo Company (Frankfurt, Deutschland) bietet unter dem Handelsnamen Derosal™ eine Carbendazim-Formulierung mit einem Wirkstoffanteil von 360 g/l (32,18 %) an. ¹⁵¹⁵Diese Formulierung wurde in einem Ringtest verwendet (2). Der im Ringtest ermittelte EC50-Wert der Reproduktionsleistung lag bei 1,2 ± 0,8 mg Wirkstoff/kg Trockenmasse (2). ¹⁵¹⁶Wenn ein positiver toxischer Standard in die Testreihe aufgenommen wird, ist eine einzige Konzentration zu verwenden, und die Anzahl der Replikate muss mit der Anzahl der Kontrollen übereinstimmen. ¹⁵¹⁷Bei Carbendazim wird die Prüfung von 1,2 mg Wirkstoff/kg Trockenmasse (getestet in einer flüssigen Formulierung) empfohlen. |
BESCHREIBUNG DES TESTSAusrüstung
| 9. | ¹⁵¹⁸Die Prüfgefäße müssen aus Glas oder einem sonstigen chemisch inertem Material bestehen. ¹⁵¹⁹Geeignet sind Glasgefäße (z. B. mit einem Volumen von 0,20 bis 0,25 l und einem Durchmesser von ≈ 6 cm). ¹⁵²⁰Die Gefäße müssen transparente Deckel haben (z. B. aus Glas oder Polyethylen), die so ausgeführt sind, dass sie die Wasserverdampfung reduzieren und gleichzeitig den Gasaustausch zwischen dem Bodensubstrat und der Atmosphäre erlauben. ¹⁵²¹Die Deckel müssen transparent sein, damit die erforderliche Lichtdurchlässigkeit gegeben ist. |
| 10. | Es wird eine übliche Laborausrüstung insbesondere mit folgenden Bestandteilen benötigt:- —
- Trockenschrank;
- —
- Stereomikroskop;
- —
- pH-Messgerät und Photometer;
- —
- Waagen mit geeigneter Genauigkeit;
- —
- geeignete Vorrichtungen zur Temperaturregelung;
- —
- geeignete Ausrüstung zur Feuchtigkeitsregelung (bei Expositionsgefäßen mit Deckel nicht wesentlich);
- —
- Inkubator oder kleiner Raum mit Klimaanlage;
- —
- Pinzette, Haken oder Schlaufen;
- —
- Fotoschalen.
|
Herstellung des künstlichen Bodens | 11. | In diesem Test wird künstlicher Boden (5)(7) mit folgender Zusammensetzung verwendet (bezogen auf Trockenmassen, bei 105 °C bis zur Massekonstanz getrocknet):- —
- 10 % Sphagnum-Torf, luftgetrocknet und fein gemahlen (eine Partikelgröße von 2 ± 1 mm ist akzeptabel); vor der Verwendung in einem Test sollte sichergestellt werden, dass mit einer frischen Torf-Charge hergestellter Boden für die Zucht der Würmer geeignet ist;
- —
- 20 % Kaolin-Ton (Kaolinit-Anteil vorzugsweise über 30 %);
- —
- ca. 0,3 bis 1,0 % Calciumcarbonat (CaCO3, pulverisiert, Analysequalität), um einen pH-Wert von 6,0 ± 0,5 zu erzielen; wie viel Calciumcarbonat hinzuzugeben ist, kann vor allem von der Qualität/Beschaffenheit des Torfs abhängen;
- —
- ca. 70 % luftgetrockneter Quarzsand (je nach erforderlichem CaCO3-Anteil), hauptsächlich Feinsand mit mehr als 50 % Partikeln mit einer Größe von 50 bis 200 μm.
¹⁵²⁴Vor der Verwendung eines künstlichen Bodens in einem definitiven Test ist seine Eignung für die Zucht von Würmern und zur Erfüllung der Validitätskriterien des Tests nachzuweisen. ¹⁵²⁵Die entsprechende Prüfung wird insbesondere empfohlen, um sicherzustellen, dass die Aussagekraft des Tests bei reduziertem Kohlenstoffgehalt des künstlichen Bodens, z. B. durch Verringerung des Torfanteils auf 4-5 % und entsprechende Erhöhung des Sandanteils, nicht beeinträchtigt wird. ¹⁵²⁶Durch eine solche Reduzierung des Gehalts an organischem Kohlenstoff kann die Bindung der Prüfchemikalie an den Boden (d. h. an organischen Kohlenstoff) verringert werden und die Verfügbarkeit der Prüfchemikalie für die Würmer zunehmen. Es wurde nachgewiesen, dass Enchytraeus albidus den Validitätskriterien hinsichtlich der Reproduktion bei Versuchen mit Feldböden mit geringerem Gehalt an organischem Kohlenstoff als oben angegeben (z. B. 2,7 %) (15) genügen, und es gibt (wenngleich in begrenztem Umfang) Hinweise darauf, dass diese Ergebnisse auch mit künstlichem Boden mit 5 %igem Torfanteil erzielt werden können.Hinweis: Wenn in weiteren (z. B. höherstufigen) Tests natürlicher Boden verwendet wird, sind auch die Eignung dieses Bodens und die Erfüllung der Validitätskriterien des Tests nachzuweisen.
|
| 12. | ¹⁵²⁸Die trockenen Bestandteile des Bodens werden gründlich gemischt (z. B. in einem großen Labormischer). ¹⁵²⁹Der Mischvorgang wird mindestens eine Woche vor Prüfbeginn durchgeführt. ¹⁵³⁰Der gemischte Boden muss zwei Tage ruhen, damit sich der Säurepegel ausgleichen/stabilisieren kann. Zur Bestimmung des pH-Werts wird eine Mischung aus Boden und einer 1 M Kaliumchlorid- (KCl) oder einer 0,01 M Calciumchloridlösung (CaCl2) im Verhältnis 1:5 verwendet (siehe (16) und Anlage 3). Wenn der Säuregrad des Bodens außerhalb des spezifizierten Bereichs liegt (siehe Nummer 11), kann der pH-Wert durch Zugabe einer geeigneten Menge CaCO3 eingestellt werden. Ist der Boden zu alkalisch, kann der pH-Wert durch Zugabe eines größeren Anteils des Gemischs (siehe Nummer 11) ohne CaCO3 eingestellt werden. |
| 13. | ¹⁵³¹Die maximale Wasserhaltekapazität des künstlichen Bodens wird mit den in Anlage 2 beschriebenen Verfahren ermittelt. ¹⁵³²Ein oder zwei Tage vor Beginn des Tests wird der trockene künstliche Boden mit so viel entionisiertem Wasser befeuchtet, dass etwa die Hälfte des endgültigen Wassergehalts erreicht wird (40-60 % der maximalen Wasserhaltekapazität). ¹⁵³³Zu Beginn des Tests wird der befeuchtete Boden entsprechend der Anzahl der im Test zu verwendenden Testkonzentrationen (sowie gegebenenfalls der Referenzchemikalie) und Kontrollen aufgeteilt. ¹⁵³⁴Der Feuchtegehalt wird auf 40-60 % der maximalen Wasserhaltekapazität eingestellt, indem die Lösung mit der Prüfchemikalie und/oder destilliertes oder entionisiertes Wasser hinzugegeben wird (siehe Nummern 19, 20 und 21). ¹⁵³⁵Der Feuchtegehalt wird zu Beginn und am Ende des Tests ermittelt (durch Trocknen bei 105 °C bis zur Massekonstanz) und sollte im optimalen Bereich für die Lebensfähigkeit der Würmer liegen. ¹⁵³⁶Für eine grobe Prüfung des Feuchtegehalts des Bodens kann der Boden vorsichtig in der Hand gedrückt werden; bei richtigem Feuchtegehalt sollten Wassertröpfchen zwischen den Fingern austreten. |
Auswahl und Vorbereitung der Versuchstiere | 14. | Die empfohlene Art für den Test ist Enchytraeus albidus (Henle 1837, weißer Topfwurm), ein Mitglied der Familie Enchytraeidae (Ordnung Oligochaeta, Stamm Annelida). E. albidus ist eine der größten Enchytraeen-Arten; bei einzelnen Exemplaren wurde eine Länge von bis zu 35 mm gemessen (17)(18). E. albidus ist weltweit in marinen, limnischen und terrestrischen Habitaten zu finden, hauptsächlich in faulendem organischem Material (Seetang, Kompost), seltener auch in Wiesen (9). Die breite ökologische Toleranz und gewisse morphologische Variationen deuten darauf hin, dass es unterschiedliche Rassen geben könnte. |
| 15. | E. albidus wird im Handel als Fischfutter angeboten. ¹⁵⁴¹Es ist zu prüfen, ob die Kultur durch andere, normalerweise kleinere Arten kontaminiert ist (1) (19). ¹⁵⁴²Ist dies der Fall, sind alle Würmer in einer Petrischale mit Wasser zu waschen. Mithilfe eines Stereomikroskops werden große adulte Exemplare von E. albidus für eine neue Kultur aussortiert, und alle anderen Würmer sind zu verwerfen. E. albidus lässt sich leicht in einer Vielzahl organischer Materialien züchten (siehe Anlage 4). Der Lebenszyklus von E. albidus ist kurz, da die Tiere ihre Geschlechtsreife zwischen dem 33. ¹⁵⁴⁶Lebenstag (bei 18 °C) und dem 74. ¹⁵⁴⁷Lebenstag (bei 12 1 °C) erreichen. ¹⁵⁴⁸Für die Prüfung sollten ausschließlich Wurmkulturen verwendet werden, die mindestens fünf Wochen lang (eine Generation) ohne Probleme im Labor gehalten wurden. |
| 16. | Andere Enchytraeus-Arten kommen ebenfalls in Betracht; z. B. E. buchholzi Vejdovsky 1879 oder E. crypticus Westheide und Graefe 1992 (siehe Anlage 5). Werden andere Enchytraeus-Arten verwendet, so sind diese eindeutig zu identifizieren, und die Wahl der Art ist zu begründen. |
| 17. | ¹⁵⁵¹Für die Tests sind adulte Tiere zu verwenden. ¹⁵⁵²In der Clitellum-Region sollten Eier (weiße Flecken) erkennbar sein, und die Tiere müssen alle etwa gleich groß sein (ca. ¹⁵⁵³1 cm lang). ¹⁵⁵⁴Die Zuchtkultur braucht nicht synchronisiert zu werden. |
| 18. | ¹⁵⁵⁵Wenn die Enchytraeen nicht in demselben Bodentyp und unter denselben Bedingungen (einschließlich Fütterung) gehältert werden wie im endgültigen Test, muss eine Akklimatisierung erfolgen (mindestens 24 Stunden bis drei Tage). ¹⁵⁵⁶Zunächst sollten mehr adulte Tiere als zur Durchführung des Tests benötigt akklimatisiert werden, damit beschädigte oder anderweitig ungeeignete Exemplare verworfen werden können. ¹⁵⁵⁷Am Ende des Akklimatisierungszeitraums werden für den Test ausschließlich Würmer ausgewählt, die Eier enthalten und keine Verhaltensauffälligkeiten zeigen (z. B. Versuche, den Boden zu verlassen). ¹⁵⁵⁸Die Würmer werden mit einer Juwelierpinzette, mit Haken oder Schlaufen vorsichtig herausgenommen und in eine Petrischale mit einer kleinen Menge Süßwasser gesetzt. Für diesen Zweck ist rekonstituiertes Süßwasser zu empfehlen, wie in Kapitel C.20 (Daphnia magna Reproduktionstest) beschrieben, da entionisiertes oder entmineralisiertes Wasser oder Leitungswasser für die Würmer schädlich sein könnte. ¹⁵⁵⁹Die Würmer werden unter einem Stereomikroskop untersucht, und Würmer ohne Eier werden verworfen. ¹⁵⁶⁰Es ist sorgfältig darauf zu achten, dass auch Milben und Springschwänze entfernt und verworfen werden, die in die Kulturen geraten sein könnten. ¹⁵⁶¹Für den Test nicht benötigte gesunde Würmer werden in die Stammkultur zurückgegeben. |
Herstellung der TestkonzentrationenWasserlösliche Prüfchemikalie
| 19. | ¹⁵⁶²Eine Lösung der Prüfchemikalie wird in entionisiertem Wasser in ausreichender Menge für alle Replikate einer Testkonzentration hergestellt. ¹⁵⁶³Vorzugsweise sollte eine angemessene Menge Wasser verwendet werden, um den erforderlichen Feuchtegehalt (d. h. 40 bis 60 % der maximalen Wasserhaltekapazität (siehe Nummer 13)) zu erzielen. ¹⁵⁶⁴Jede Lösung mit der Prüfchemikalie wird gründlich mit einer Charge des angefeuchteten Bodens gemischt und dann in das Prüfgefäß gegeben. |
Wasserunlösliche Prüfchemikalien | 20. | ¹⁵⁶⁵Chemikalien, die in Wasser unlöslich, aber in organischen Lösungsmitteln löslich sind, können in der kleinstmöglichen Menge eines geeigneten Lösungsvermittlers (z. B. Aceton) gelöst werden. ¹⁵⁶⁶Hierzu sind ausschließlich flüchtige Lösungsmittel zu verwenden. ¹⁵⁶⁷Der Trägerstoff wird auf eine kleine Menge (z. B. 2,5 g) Quarzsand gesprüht oder mit dem Sand vermischt. ¹⁵⁶⁸Anschließend wird der Sand mindestens eine Stunde unter einem Abzug gestellt, damit das Lösungsmittel verdunsten kann. ¹⁵⁶⁹Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfchemikalie wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und nach Hinzugabe von entionisiertem Wasser in ausreichender Menge gründlich gemischt, um den erforderlichen Feuchtegehalt zu erzielen. ¹⁵⁷⁰Die endgültige Mischung wird in die Prüfgefäße gegeben. |
| 21. | ¹⁵⁷¹Bei Chemikalien, die sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln schlecht löslich sind, wird das Äquivalent von 2,5 g fein gemahlenem Quarzsand pro Prüfgefäß mit der Menge der Prüfchemikalie vermischt, die erforderlich ist, um die gewünschte Testkonzentration zu erhalten. ¹⁵⁷²Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfchemikalie wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und nach Hinzugabe von entionisiertem Wasser in ausreichender Menge gründlich vermischt, um den erforderlichen Feuchtegehalt zu erzielen. ¹⁵⁷³Die endgültige Mischung wird auf die Prüfgefäße verteilt. ¹⁵⁷⁴Dieses Verfahren wird für alle Testkonzentrationen wiederholt, und es wird eine geeignete Kontrolle hergestellt. |
| 22. | ¹⁵⁷⁵Die Chemikalien werden im Allgemeinen höchstens bis zu einer Konzentration von 1 000 mg/kg Boden (Trockenmasse) geprüft. ¹⁵⁷⁶Je nach Zielsetzung eines bestimmten Tests können Prüfungen allerdings auch mit höheren Konzentrationen vorgenommen werden. |
DURCHFÜHRUNG DER TESTSTest- und Kontrollgruppen
| 23. | ¹⁵⁷⁷Für jede Testkonzentration werden 20 g (Trockenmasse) Testboden in das Prüfgefäß gegeben (siehe Nummern 19, 20 und 21). ¹⁵⁷⁸Außerdem werden Kontrollen ohne die Prüfchemikalie hergestellt. ¹⁵⁷⁹In alle Prüfgefäße wird Futter gegeben, wie unter Nummer 29 beschrieben. ¹⁵⁸⁰In jedes Prüfgefäß werden zehn zufällig ausgewählte Würmer gesetzt. ¹⁵⁸¹Die Würmer werden vorsichtig in die einzelnen Prüfgefäße gegeben und auf dem Boden abgesetzt (z. B. mit einer Juwelierpinzette, mit Haken oder mit Schlaufen. ¹⁵⁸²Die Anzahl der Replikate der Testkonzentrationen und der Kontrollen hängt vom jeweiligen Prüfprotokoll ab (siehe Nummer 34). ¹⁵⁸³Die Prüfgefäße werden nach dem Zufallsprinzip in den Testinkubator gestellt, und die Positionen werden wöchentlich neu randomisiert. |
| 24. | ¹⁵⁸⁴Wenn zur Applikation der Prüfchemikalie ein Lösungsvermittler verwendet wird, ist zusätzlich zu den Testreihen eine Kontrollreihe mit Quarzsand mit aufgesprühtem oder untergemischtem Lösungsmittel zu prüfen. ¹⁵⁸⁵Die Konzentration des Lösungsmittels oder des Dispergiermittels muss mit der Konzentration übereinstimmen, die auch in den Prüfgefäßen mit der Prüfchemikalie verwendet wird. ¹⁵⁸⁶Bei Chemikalien, die gemäß den unter Nummer 21 beschriebenen Verfahren zu applizieren sind, muss eine Kontrollreihe mit zusätzlichem Quarzsand (2,5 g pro Gefäß) geprüft werden. |
Prüfbedingungen | 25. | ¹⁵⁸⁷Die Testtemperatur beträgt 20 ± 2 °C. ¹⁵⁸⁸Damit die Würmer den Boden nicht verlassen, wird die Prüfung bei einem geregelten Licht-Dunkel-Zyklus (vorzugsweise 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit) mit einer Lichtstärke von 400 bis 800 lux im Bereich der Prüfgefäße durchgeführt. |
| 26. | ¹⁵⁸⁹Um die Feuchte des Bodens zu ermitteln, werden die Gefäße zu Beginn des Tests und danach jeweils einmal pro Woche gewogen. ¹⁵⁹⁰Gewichtsverluste werden durch Zugabe von entionisiertem Wasser in ausreichender Menge aufgefüllt. ¹⁵⁹¹Wasserverluste können durch Aufrechterhaltung einer hohen Luftfeuchtigkeit (> 80 %) im Testinkubator reduziert werden. |
| 27. | ¹⁵⁹²Der Feuchtegehalt und der pH-Wert sind jeweils zu Beginn und am Ende sowohl des Vorversuchs als auch des definitiven Tests zu messen. ¹⁵⁹³Die Messungen sind an allen Kontrollen und an allen mit der Prüfchemikalie (in allen Konzentrationen) behandelten Bodenproben vorzunehmen, die zwar in der gleichen Weise wie die Testkulturen hergestellt und gehandhabt werden, aber keine Würmer enthalten. ¹⁵⁹⁴Zu diesen Bodenproben ist nur zu Beginn des Tests Futter hinzuzugeben, um die Aktivität der vorhandenen Mikroorganismen anzuregen. ¹⁵⁹⁵Es sollte die gleiche Menge Futter hinzugegeben werden, wie zu den Testkulturen. ¹⁵⁹⁶Während des Tests braucht in diese Gefäße allerdings kein weiteres Futter mehr gegeben zu werden. |
Fütterung | 28. | ¹⁵⁹⁷Es wird Futter verwendet, das die Lebensfähigkeit der Enchytraeen-Population gewährleistet. ¹⁵⁹⁸Haferflocken, vorzugsweise vor der Verwendung autoklaviert, um Verunreinigungen durch Mikroorganismen zu verhindern (auch Erwärmung ist möglich), haben sich als geeignetes Futter erwiesen. |
| 29. | ¹⁵⁹⁹Bei der ersten Fütterung werden 50 mg gemahlene Haferflocken mit dem Boden in jedem Gefäß vermischt, bevor die Würmer eingesetzt werden. ¹⁶⁰⁰Anschließend wird bis zum 21. Tag Futter einmal wöchentlich hinzugegeben. ¹⁶⁰¹An Tag 28 wird nicht gefüttert, da die adulten Tiere in diesem Stadium bereits herausgenommen wurden und die juvenilen Würmer ab diesem Zeitpunkt verhältnismäßig wenig zusätzliches Futter brauchen. ¹⁶⁰²Die Fütterung während des Tests besteht aus 25 mg gemahlenen Haferflocken pro Gefäß, die wird vorsichtig auf die Bodenoberfläche gelegt werden, damit die Würmer nicht verletzt werden. ¹⁶⁰³Um Schimmelpilzbefall zu verhindern, sind die Haferflocken mit einer kleinen Menge Boden zu bedecken. ¹⁶⁰⁴Wenn das Futter nicht aufgezehrt wird, sollte die Futtermenge verringert werden. |
Protokoll des Vorversuchs zur Konzentrationsbereichs-Bestimmung | 30. | ¹⁶⁰⁵Wenn erforderlich, wird ein Vorversuch beispielsweise mit fünf Konzentrationen der Prüfchemikalie (0,1, 1,0, 10, 100 und 1 000 mg/kg (Boden Trockenmasse)) durchgeführt. ¹⁶⁰⁶Ein Replikat für jede Behandlung und jede Kontrolle ist ausreichend. |
| 31. | ¹⁶⁰⁷Der Vorversuch dauert zwei Wochen. ¹⁶⁰⁸Am Ende des Versuchs wird die Mortalität der Würmer ermittelt. ¹⁶⁰⁹Ein Wurm wird dann als tot erfasst, wenn er am vorderen Ende nicht mehr auf mechanische Reize reagiert. ¹⁶¹⁰Über die Mortalität hinaus können auch weitere Informationen hilfreich sein, um die im definitiven Test zu verwendenden Konzentrationen festzulegen. ¹⁶¹¹Änderungen im Verhalten der adulten Würmer (die Würmer können sich nicht mehr in den Boden eingraben, sie liegen reglos an der Glaswand des Prüfgefäßes usw.) sowie morphologische Änderungen (z. B. offene Wunden) sind daher ebenso zu protokollieren wie das Vorhandensein juveniler Würmer. ¹⁶¹²Letzteres kann mit der in Anlage 6 beschriebenen Färbemethode ermittelt werden. |
| 32. | ¹⁶¹³Der ungefähre LC50-Wert kann bestimmt werden, indem der geometrische Mittelwert der Mortalitätsdaten berechnet wird. Bei der Festlegung des Konzentrationsbereichs für den definitiven Test wird davon ausgegangen, dass die Wirkungen auf die Reproduktionsleistungen maximal um den Faktor 10 geringer sind als der LC50-Wert. ¹⁶¹⁴Dies ist jedoch eine empirische Beziehung; jeder Einzelfall kann anderes aussehen. ¹⁶¹⁵Weitere Beobachtungen im Vorversuch (z. B. das Vorkommen juveniler Tiere) können helfen, den Konzentrationsbereich der Prüfchemikalie für den definitiven Test noch genauer einzugrenzen. |
| 33. | ¹⁶¹⁶Um den LC50-Wert genau zu bestimmen, wird empfohlen, den Test mit mindestens vier Replikaten für jede Konzentration der Prüfchemikalie und mit einer geeigneten Anzahl Konzentrationen zu wiederholen, damit sich mindestens vier statistisch signifikante mittlere Reaktionen für die jeweiligen Konzentrationen ergeben. ¹⁶¹⁷Eine ähnliche Anzahl an Konzentrationen und Replikaten ist gegebenenfalls auch für die Kontrollen zu verwenden. |
Protokoll des definitiven Reproduktionstests | 34. | Entsprechend den Empfehlungen aufgrund eines Ringtests werden drei Protokolle vorgeschlagen (2):- —
- Zur Bestimmung der NOEC sind mindestens fünf Konzentrationen in einer geometrischen Reihe zu prüfen. ¹⁶¹⁹Zu empfehlen sind vier Replikate je Testkonzentration und acht Kontrollen. ¹⁶²⁰Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden.
- —
- ¹⁶²¹Zur Ermittlung des ECx-Werts (z. B. EC10 oder EC50) müssen mindestens fünf Konzentrationen geprüft werden; diese Konzentrationen müssen den ECx einschließen, damit der ECx interpoliert werden kann und nicht extrapoliert werden muss. ¹⁶²²Mindestens vier Replikate je Testkonzentration und vier Kontrollreplikate werden empfohlen. ¹⁶²³Der Abstandsfaktor kann unterschiedlich sein (d. h. im erwarteten Wirkungsbereich maximal 1,8 und bei den höheren und niedrigeren Konzentrationen mehr als 1,8).
- —
- Ein kombinierter Ansatz ermöglicht die Bestimmung sowohl der NOEC als auch des ECx-Werts. ¹⁶²⁴Es sind acht Testkonzentrationen in einer geometrischen Reihe zu verwenden. ¹⁶²⁵Zu empfehlen sind vier Replikate je Behandlung und acht Kontrollen. ¹⁶²⁶Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden.
|
| 35. | ¹⁶²⁷Pro Prüfgefäß sind zehn adulte Würmer zu verwenden (siehe Nummer 23). ¹⁶²⁸Zu Beginn des Tests und danach einmal wöchentlich bis zum 21. Tag einschließlich wird Futter in die Prüfgefäße gegeben (siehe Nummer 29). ¹⁶²⁹An Tag 21 werden die Bodenproben sorgfältig manuell abgesucht, und die lebenden adulten Würmer werden erfasst und gezählt; Verhaltensänderungen (die Würmer graben sich nicht mehr in den Boden; sie liegen reglos an der Glaswand des Prüfgefäßes usw.) und morphologische Veränderungen (z. B. offene Wunden) werden protokolliert. ¹⁶³⁰Anschließend werden alle adulten Würmer aus den Prüfgefäßen und aus dem Boden herausgenommen. ¹⁶³¹Der Testboden mit etwa gebildeten Kokons wird nochmals drei Wochen unter den genannten Prüfbedingungen inkubiert, wobei allerdings nur noch einmal an Tag 35 gefüttert wird (25 mg gemahlene Haferflocken pro Gefäß). |
| 36. | ¹⁶³²Nach sechs Wochen werden die neu geschlüpften Würmer gezählt. ¹⁶³³Hierzu wird die auf der Färbung mit Bengalrot beruhende Methode (siehe Anlage 6) empfohlen, wenngleich sich auch andere Verfahren zur Entnahme und Flotation unter Zufuhr von Flüssigkeit (aber nicht von Wärme) als geeignet erwiesen haben (4)(10)(11)(20). ¹⁶³⁴Die Einfärbung mit Bengalrot wird empfohlen, weil die Nassextraktion aus einem Bodensubstrat durch Trübungen aufgrund suspendierter Tonpartikel erschwert sein könnte. |
Limit-Test | 37. | Wenn im Vorversuch auch bei der höchsten Konzentration (d. h. bei 1 000 mg/kg) keine Wirkungen festzustellen sind, kann der Reproduktionstest als Limit-Test durchgeführt werden, bei dem mit einer Konzentration von 1 000 mg/kg nachgewiesen wird, dass die NOEC im Hinblick auf die Reproduktionsleistung noch über diesem Wert liegt. |
Zusammenfassung und Zeitplan des Tests | 38. | Im Einzelnen umfasst der Test folgende Schritte:| Zeitpunkt | Vorversuch | Definitiver Test | | Tag – 7 oder früher | | — | Herstellen des künstlichen Bodens (Mischen trockener Bestandteile) |
| | — | Herstellen des künstlichen Bodens (Mischen trockener Bestandteile) |
| | Tag – 5 | - —
- Prüfung des pH-Werts des künstlichen Bodens
- —
- Messung der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens
| - —
- Prüfung des pH-Werts des künstlichen Bodens
- —
- Messung der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens
| | Tag – 5 bis – 3 | | — | Sortieren der Würmer zur Akklimatisierung |
| | — | Sortieren der Würmer zur Akklimatisierung |
| | Tag – 3 bis 0 | | — | Akklimatisieren der Würmer über mindestens 24 Stunden |
| | — | Akklimatisieren der Würmer über mindestens 24 Stunden |
| | Tag – 1 | | — | Befeuchten des künstlichen Bodens und Aufteilung in Chargen |
| | — | Befeuchten des künstlichen Bodens und Aufteilung in Chargen |
| | Tag 0 | - —
- Herstellen der Stammlösungen
- —
- Applikation der Prüfchemikalie
- —
- Einwiegen des Prüfsubstrats in die Prüfgefäße
- —
- Einmischen des Futters
- —
- Einsetzen der Würmer
- —
- Messung pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
| - —
- Herstellen der Stammlösungen
- —
- Applikation der Prüfchemikalie
- —
- Einwiegen des Prüfsubstrats in die Prüfgefäße
- —
- Einmischen des Futters
- —
- Einsetzen der Würmer
- —
- Messung des pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
| | Tag 7 | | — | Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens |
| - —
- Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
- —
- Füttern
| | Tag 14 | - —
- Bestimmen der Mortalität der adulten Tiere
- —
- Schätzung der Anzahl der juvenilen Tiere
- —
- Messung des pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
| - —
- Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
- —
- Füttern
| | Tag 21 | | - —
- Beobachten des Verhaltens der adulten Tiere
- —
- Entnahme der adulten Tieren
- —
- Bestimmung der Mortalität der adulten Tiere
- —
- Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
- —
- Füttern
| | Tag 28 | | - —
- Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
- —
- Keine Fütterung
| | Tag 35 | | - —
- Prüfen des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
- —
- Füttern
| | Tag 42 | | - —
- Zählen der juvenilen Würmer
- —
- Messung des pH-Werts und des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens
|
|
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 39. | Anlage 7 enthält zwar eine Übersicht, doch bei dieser Prüfmethode ist keine statistische Vorgehensweise für die Analyse der Prüfergebnisse vorgeschrieben. |
| 40. | ¹⁶³⁷Der wesentliche Endpunkt des Vorversuchs ist die Mortalität. ¹⁶³⁸Änderungen im Verhalten der adulten Würmer (die Würmer können sich nicht mehr in den Boden eingraben, sie liegen reglos an der Glaswand des Prüfgefäßes usw.) sowie morphologische Änderungen (z. B. offene Wunden) sind jedoch ebenso zu protokollieren wie das Vorhandensein juveniler Würmer. Der LC50-Wert wird normalerweise mit Probit-Analysen (21) oder durch logistische Regressionsanalysen bestimmt. ¹⁶³⁹Wenn diese Analysemethode jedoch ungeeignet ist (z. B. weil weniger als drei Konzentrationen verfügbar sind, bei denen ein Teil der Tiere gestorben ist), können auch alternative Methoden verwendet werden. In Betracht kommen etwa gleitende Durchschnitte (22), die Trimmed-Spearman-Karber-Methode (23) oder eine einfache Interpolation (z. B. geometrischer Mittelwert von LC0 und LC100, berechnet als Quadratwurzel von LC0 multipliziert mit LC100). |
| 41. | ¹⁶⁴⁰Endpunkt beim definitiven Test ist die Vermehrungsrate (d. h. die Anzahl der entstandenen juvenilen Tiere). ¹⁶⁴¹Ebenso wie im Vorversuch sind jedoch im Abschlussbericht auch alle Anzeichen für sonstige schädliche Wirkungen zu erfassen. ¹⁶⁴²Für die statistische Analyse müssen für jede Textkonzentration und jede Kontrolle im Reproduktionstest das arithmetische Mittel und die Standardabweichung berechnet werden. |
| 42. | ¹⁶⁴³Wenn eine Varianzanalyse vorgenommen wurde, können die Standardabweichung, s, und die Freiheitsgrade, df, durch die nach der ANOVA geschätzte gepoolte Varianz bzw. durch die entsprechenden Freiheitsgrade ersetzt werden (wenn die Varianz nicht von der Konzentration abhängig ist). ¹⁶⁴⁴In diesem Fall sind die einzelnen Varianzen der Kontrollen und der Gefäße mit den Testkonzentrationen zu verwenden. ¹⁶⁴⁵In der Regel werden die betreffenden Werte mit kommerzieller Statistik-Software berechnet, wobei die Ergebnisse der einzelnen Gefäße als Replikate angenommen werden. ¹⁶⁴⁶Wenn die Zusammenfassung von Daten der negativen Kontrollen und der Lösungsmittelkontrollen sinnvoller erscheint als die Prüfung mit einer einzelnen Kontrolle, werden die Kontrollen getestet, um sicherzustellen, dass sich die Ergebnisse nicht signifikant unterscheiden (entsprechende Tests siehe Nummer 45 und Anlage 7). |
| 43. | Ob weitere statistische Tests vorzunehmen und statistische Rückschlüsse zu ziehen sind, hängt davon ab, ob bei den Replikaten eine Normalverteilung und eine homogene Varianz der Werte gegeben ist. |
Schätzung der NOEC | 44. | ¹⁶⁴⁸Vorzugsweise sollten leistungsfähige Tests durchgeführt werden. ¹⁶⁴⁹Dabei könnten Informationen (z. B. frühere Erfahrungen mit Ringtests oder sonstige historische Daten) herangezogen werden, um zu beurteilen, ob die Daten in etwa normal verteilt sind. ¹⁶⁵⁰Entscheidender ist die Varianzhomogenität (Homoskedastizität). ¹⁶⁵¹Erfahrungsgemäß steigt die Varianz häufig mit zunehmendem Mittelwert. ¹⁶⁵²In diesem Fall könnte eine Datentransformation eine Homoskedastizität zur Folge haben. ¹⁶⁵³Eine entsprechende Transformation sollte aber eher auf Erfahrungen mit historischen Daten als auf den Daten der aktuellen Untersuchung beruhen. ¹⁶⁵⁴Bei homogenen Daten sind multiple t-Tests (z. B. ein Williams-Test (α = 0,05, einseitig) (24)(25) oder in bestimmten Fällen auch ein Dunnett-Test (26)(27)) durchzuführen. ¹⁶⁵⁵Bei uneinheitlichen Replikaten müssen die t-Werte in der Tabelle korrigiert werden, wie von Dunnett und Williams empfohlen. ¹⁶⁵⁶Bei einer starken Variation steigen/sinken die Ergebnisse nicht regelmäßig. ¹⁶⁵⁷Bei derart starken Monotonieabweichungen ist der Dunnett-Test besser geeignet. ¹⁶⁵⁸Bei Abweichungen von der Homoskedastizität kann es angebracht sein, mögliche Wirkungen in Bezug auf Varianzen näher zu untersuchen, um dann zu entscheiden, ob die t-Tests durchgeführt werden können, ohne zu viel an Aussagekraft einzubüßen (28). ¹⁶⁵⁹Alternativ kann ein multipler U-Test (z. B. der Bonferroni-U-Test nach Holm (29)) oder — wenn bei diesen Daten zwar eine Homoskedastizität festzustellen ist, die Daten ansonsten aber mit der zugrunde liegenden monotonen Dosis-Wirkungs-Kurve übereinstimmen — ein weiterer nicht parametrischer Test (z. B. Jonckheere-Terpstra (30)(31) oder Shirley) (32)(33) vorgenommen werden; dies wäre im Allgemeinen sinnvoller als t-Tests für ungleiche Varianzen (siehe auch Flussdiagramm in Anlage 7). |
| 45. | Wenn ein Limit-Test durchgeführt wurde und die Voraussetzungen für parametrische Prüfverfahren (Normalität, Homogenität) erfüllt sind, kann der paarige Student-t-Test verwendet werden; ansonsten ist der -U-Test nach Mann und Whitney durchzuführen (29). |
Schätzung von ECx | 46. | ¹⁶⁶¹Zur Berechnung eines ECx-Werts wird eine Regressionsanalyse (linear oder nicht linear) mit den Mittelwerten aus der Vorbehandlung vorgenommen, nachdem eine geeignete Dosis-Wirkungs-Beziehung ermittelt wurde. Für das Wachstum der Würmer als kontinuierliche Reaktion können ECx--Werte mit einer geeigneten Regressionsanalyse geschätzt werden (35). ¹⁶⁶²Geeignete Funktionen für quantale Daten (Mortalität/Überleben und Anzahl der Nachkommen) sind die normale sigmoide Funktion, die Logit- oder die Weibull-Funktion mit zwei bis vier Parametern, die teilweise auch hormetische Effekte abbilden können. Wenn eine Dosis-Wirkungs-Funktion mithilfe einer linearen Regressionsanalyse angepasst wurde, müssten in der Regressionsanalyse ein signifikanter r2-Wert (Bestimmungskoeffizient) und/oder eine Steigung festzustellen sein; anschließend wird der ECx-Wert abgeschätzt, indem in die nach der Regressionsanalyse erstellte Gleichung ein Wert entsprechend x % des Mittelwerts der Kontrollgruppe eingesetzt wird. ¹⁶⁶³95- %-Konfidenzintervalle werden nach Fieller (zitiert in Finney (21)) oder mit sonstigen modernen geeigneten Methoden berechnet. |
| 47. | ¹⁶⁶⁴Alternativ wird die Reaktion als Anteil oder Prozentanteil eines Modellparameters nachgebildet, der dann als mittlere Reaktion der Kontrollgruppe angenommen wird. ¹⁶⁶⁵In diesen Fällen kann die normale (Logit, Weibull) sigmoide Kurve häufig leicht durch eine Probit-Regression an die Ergebnisse angepasst werden (21). ¹⁶⁶⁶In diesen Fällen ist die Gewichtungsfunktion entsprechend den metrischen Antworten anzupassen, wie bei Christensen (36) beschrieben. ¹⁶⁶⁷Wenn allerdings eine Hormesis festgestellt wurde, ist die Probit-Analyse durch eine 4-Parameter-Funktion (Logit oder Weibull) zu ersetzen, die mit einem nicht linearen Regressionsverfahren angepasst wird (36). Kann keine geeignete Dosis-Wirkungs-Funktion an die Daten angepasst werden, können alternative Methoden zur Abschätzung von ECx und der entsprechenden Konfidenzintervalle verwendet werden (beispielsweise gleitende Durchschnitte nach Thompson (22) und das Trimmed-Spearman-Karber-Verfahren (23)). |
PRÜFBERICHT | 48. | Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: | Prüfchemikalie:- —
- physikalische Beschaffenheit und — wenn relevant — physikalisch-chemische Eigenschaften (z. B. Wasserlöslichkeit oder Dampfdruck);
- —
- chemische Bezeichnung der Prüfchemikalie nach der IUPAC-Nomenklatur, CAS-Nummer, Charge, Los, Strukturformel und Reinheit;
- —
- Verfallsdatum der Probe;
|
| Im Test verwendete Art:| — | eingesetzte Testtiere: Art, wissenschaftlicher Name, Bezugsquelle der Testorganismen und Zuchtbedingungen. |
|
| Prüfbedingungen:- —
- Bestandteile und Herstellung des künstlichen Bodens;
- —
- Methode der Applikation der Prüfchemikalie;
- —
- Beschreibung der Prüfbedingungen (Temperatur, Feuchtegehalt, pH-Wert usw.);
- —
- vollständige Beschreibung des Prüfprotokolls und der Verfahren.
|
| Prüfergebnisse:- —
- Mortalität adulter Würmer nach zwei Wochen und Anzahl der juvenilen Tiere am Ende des Vorversuchs;
- —
- Mortalität adulter Würmer nach dreiwöchiger Exposition und vollständige Anzahl der juvenilen Tiere am Ende des definitiven Tests;
- —
- alle beobachteten physischen oder pathologischen Symptome und Verhaltensänderungen der Testorganismen;
- —
- der LC50-Wert, die NOEC und/oder der ECx-Wert (z. B. EC50 oder EC10) für die Reproduktionsleistung, gegebenenfalls mit Konfidenzintervallen, und eine Grafik des angepassten Modells der Berechnung sowie sämtliche Informationen und Feststellungen, die für die Interpretation der Ergebnisse hilfreich sein können;
|
Abweichungen von den für diese Prüfmethode beschriebenen Verfahren und außergewöhnliche Vorkommnisse während der Prüfung. |
LITERATUR | (1) | Römbke, J. (1989). ¹⁶⁷²Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. ¹⁶⁷³Abschlussbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. |
| (2) | Römbke, J., und Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 S. |
| (3) | Westheide, W., und Bethge-Beilfuss, D. (1991). ¹⁶⁷⁶The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Hrsg. ¹⁶⁷⁷Esser, G., und Overdieck, D., S. 497-508. ¹⁶⁷⁸Elsevier, Amsterdam. |
| (4) | Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R., und Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 S. |
| (5) | Kapitel C.8: Toxizität bei Regenwürmern. |
| (6) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1993). ¹⁶⁸¹Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer (Eisenia fetida) — Teil 1: Verfahren zur Bestimmung der akuten Toxizität unter Verwendung von künstlichem Bodensubstrat, Nr. 11268-1. ¹⁶⁸²ISO, Genf. |
| (7) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1996). Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer — Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung von Eisenia fetida/Eisenia andrei, Nr. 11268-2. ISO, Genf. |
| (8) | Rundgren, S., und A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H., und C.A.M. ¹⁶⁸⁷Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. ¹⁶⁸⁸John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. |
| (9) | Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. |
| (10) | Römbke, J. (1995). ¹⁶⁹²Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF — Z. ¹⁶⁹³Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. |
| (11) | Dunger, W., und Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. |
| (12) | Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. |
| (13) | Becker, H. (1991). ¹⁷⁰⁰Bodenorganismen — Prüfungskategorien der Forschung. UWSF — Z. ¹⁷⁰¹Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. |
| (14) | Römbke, J., und Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. |
| (15) | Römbke, J., Riepert, F. ¹⁷⁰⁴und Achazi R. ¹⁷⁰⁵(2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. ¹⁷⁰⁷Heiden, S., Erb, R., Dott, W. ¹⁷⁰⁸und Eisentraeger, A. (Hrsg.). ¹⁷⁰⁹Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. |
| (16) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1994). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung des pH-Wertes, Nr. 10390. ISO, Genf. |
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| (18) | Nielsen, C.O. und Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. |
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Anlage 1Begriffsbestimmungen
Für diese Prüfmethode gelten folgende Begriffsbestimmungen:
Chemikalie: ein Stoff oder eine Mischung.
ECx (Konzentration mit einer Wirkung von x %): Konzentration, bei der es innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle zu einer Wirkung von x % auf die Testorganismen kommt; bei diesem Test werden die Wirkungskonzentrationen als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.
LC0 (Konzentration ohne letale Wirkung): die Konzentration einer Prüfchemikalie, bei der Testorganismen innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer nicht getötet werden; bei diesem Test wird LC0 als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.
LC50 (mediane letale Konzentration): die Konzentration einer Prüfchemikalie, bei der innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer 50 % der Testorganismen getötet werden; bei diesem Test wird LC50 als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.
LC100 (absolut tödliche Konzentration): die Konzentration einer Prüfchemikalie, bei der innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer 100 % der Testorganismen getötet werden; bei diesem Test wird LC100 als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.
LOEC (niedrigste Konzentration, bei der noch eine schädliche Wirkung zu beobachten ist): niedrigste Konzentration der Prüfchemikalie mit statistisch signifikanter Wirkung (p < 0,05); bei diesem Test wird die LOEC als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt. ¹⁷⁶²Bei allen Testkonzentrationen oberhalb der LOEC müsste normalerweise eine Wirkung auftreten, die sich statistisch von der jeweiligen Kontrolle unterscheidet. ¹⁷⁶³Alle Abweichungen von den vorstehenden Beschreibungen bei der Ermittlung der LOEC sind im Prüfbericht zu begründen.
NOEC (höchste Konzentration ohne beobachtete Wirkung): Die höchste Konzentration der Prüfchemikalie unmittelbar unterhalb der LOEC, bei der keine Wirkung beobachtet wird; bei diesem Test hat die der NOEC entsprechende Konzentration innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle keine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05).
Reproduktionsrate: mittlere Anzahl der juvenilen Würmer, die im Testzeitraum aus einer bestimmten Anzahl an adulten Tieren hervorgegangen sind.
Prüfchemikalie: ein Stoff oder eine Mischung, der bzw. die nach dieser Methode geprüft wird.
Anlage 2
Bestimmung der maximalen Wasserhaltekapazität
Bestimmung der Wasserhaltekapazität des künstlichen Bodens
Die folgende Methode hat sich als geeignet erwiesen. Eine nähere Beschreibung ist ISO DIS 11268-2 Anhang C zu entnehmen.
¹⁷⁶⁹Mit einer geeigneten Vorrichtung (Stechzylinder usw.) eine bestimmte Menge (z. B. 5 g) des Prüfbodens entnehmen. ¹⁷⁷⁰Den Zylinder auf der Unterseite mit Filterpapier abdecken, anschließend mit Wasser füllen und auf einem Gestell in ein Wasserbad setzen. ¹⁷⁷¹Den Zylinder allmählich eintauchen, bis der Boden durch das Wasser bedeckt ist, und etwa drei Stunden im Wasser belassen. ¹⁷⁷²Da nicht alles durch die Bodenkapillare aufgenommene Wasser im Substrat gehalten werden kann, den Zylinder mit der Bodenprobe zur Entwässerung für zwei Stunden in einem geschlossenen Gefäß (um eine Austrocknung zu verhindern) auf sehr feuchten, fein gemahlenen Quarzsand stellen. ¹⁷⁷³Anschließend wird die Probe gewogen und bei 105 °C auf eine konstante Masse getrocknet. Die Wasserhaltekapazität (WHC = Water Holding Capacity) kann dann wie folgt berechnet werden:
Dabei sind:
| S | = | das wassergesättigte Substrat + Masse des Zylinders + Masse des Filterpapiers | | T | = | Tara (Masse des Zylinders + Masse des Filterpapiers) | | D | = | Trockenmasse des Substrats |
LITERATUR:ISO (Internationale Organisation für Normung) (1996). ¹⁷⁷⁴Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer — Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung von Eisenia fetida/Eisenia andrei, Nr. 11268-2. ¹⁷⁷⁵ISO, Genf.
Anlage 3
Bestimmung des pH-Wertes von Böden
Die folgende Methode zur Bestimmung des pH-Wertes von Böden beruht auf der Beschreibung in ISO 10390 (Bodenbeschaffenheit — Bestimmung des pH-Wertes).
¹⁷⁷⁷Eine gegebene Menge Boden mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur trocknen. Eine Suspension aus (mindestens 5 g) Boden in einer 1-M-Lösung analysenreines Kaliumchlorid (KCl) oder einer 0,01-M-Lösung analysenreines Calciumchlorid (CaCl2) im Verhältnis 1:5 herstellen. ¹⁷⁷⁸Anschließend die Suspension fünf Minuten kräftig schütteln und dann mindestens 2, aber nicht länger als 24 Stunden ruhen lassen. ¹⁷⁷⁹Der pH-Wert der flüssigen Phase wird mit einem pH-Meter gemessen, das vor jeder Messung mit einer geeigneten Reihe an Pufferlösungen (z. B. pH 4,0 und 7,0) kalibriert wurde.
LITERATUR
ISO (Internationale Organisation für Normung) (1994). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung des pH-Wertes, Nr. 10390. ISO, Genf.
Anlage 4
Kulturbedingungen für Enchytraeus sp.
¹⁷⁸²Enchytraeen der Art Enchytraeus albidus (und anderer Enchytraeus-Arten) können in großen Kunststoffkästen (z. B. 30 × 60 × 10 cm) gezüchtet werden, die mit einer Mischung aus künstlichem Boden und natürlicher, nicht kontaminierter Gartenerde im Verhältnis 1:1 gefüllt werden. ¹⁷⁸³Kompostmaterial könnte toxische Chemikalien (etwa Schwermetalle) enthalten und ist daher zu vermeiden. ¹⁷⁸⁴Vor der Verwendung des Bodens ist sämtliche Fauna zu entfernen (z. B. durch Gefrieren). ¹⁷⁸⁵Es kann auch ein Substrat ausschließlich aus künstlichem Boden verwendet werden, aber die Reproduktionsrate ist dann unter Umständen geringer als in einem gemischten Bodensubstrat. ¹⁷⁸⁶Der pH-Wert des Substrats muss im Bereich von 6,0 ± 0,5 liegen.
¹⁷⁸⁷Die Kultur wird bei einer Temperatur von 15 bis 20 ± 2 °C im Dunkeln aufbewahrt. ¹⁷⁸⁸Temperaturen über 23 °C sind zu vermeiden. ¹⁷⁸⁹Der Boden muss feucht gehalten werden, darf aber nicht nass sein. ¹⁷⁹⁰Die richtige Feuchte ist dann gegeben, wenn bei vorsichtigem Ausdrücken des Bodens zwischen den Fingern kleine Wassertropfen austreten. ¹⁷⁹¹Die Entstehung anoxischer Bedingungen ist zu vermeiden, indem sichergestellt wird, dass die Abdeckungen der Kulturgefäße einen angemessenen Gasaustausch mit der Atmosphäre ermöglichen. ¹⁷⁹²Um die Belüftung des Substrats zu erleichtern, ist der Boden wöchentlich vorsichtig zu lockern.
¹⁷⁹³Die Würmer können mit Haferflocken gefüttert werden. Diese sind in verschlossenen Behältnissen zu lagern und vor Gebrauch zu autoklavieren oder zu erwärmen, um Befall mit Mehlmilben (z. B. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) oder Raubmilben (z. B. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) zu vermeiden. ¹⁷⁹⁴Nach der Wärmebehandlung wird das Futter gemahlen, damit es leichter auf dem Boden ausgestreut werden kann. ¹⁷⁹⁵Von Zeit zu Zeit können die Haferflocken mit Vitaminen, Milch und Lebertran angereichert werden. ¹⁷⁹⁶Als Futter kommen auch Backhefe und das Fischfutter ‚TetraMin‘ in Betracht.
¹⁷⁹⁷Die Fütterung erfolgt etwa zweimal pro Woche. ¹⁷⁹⁸Eine angemessene Menge Haferflocken wird auf dem Boden ausgestreut oder beim Lockern des Bodens zur besseren Belüftung vorsichtig in das Substrat gemischt. ¹⁷⁹⁹Die absolute Futtermenge hängt von der Anzahl Würmer im Substrat ab. ¹⁸⁰⁰Allgemein gilt, dass die Futtermenge zu erhöhen ist, wenn das gesamte Futter binnen eines Tages nach Bereitstellung aufgezehrt ist. ¹⁸⁰¹Wenn dagegen bei der zweiten Fütterung (nach einer Woche) noch Futter auf der Bodenoberfläche liegt, muss die Futtermenge reduziert werden. ¹⁸⁰²Futter mit Schimmelpilzbefall ist zu entfernen und zu ersetzen. ¹⁸⁰³Nach drei Monaten sind die Würmer in frisch hergestelltes Substrat umzusetzen.
Die Kulturbedingungen gelten als zufriedenstellend, wenn die Würmer a) nicht versuchen, das Bodensubstrat zu verlassen, b) sich rasch im Boden bewegen, c) eine glänzende Oberfläche haben, an der keine Bodenpartikel anhaften, d) eine mehr oder weniger weißliche Farbe haben, e) in unterschiedlichen Altersstufen in der Kultur vertreten sind und f) sich kontinuierlich vermehren.
Anlage 5
Durchführung der Prüfung mit anderen Enchytraeus-Arten
Wahl der Arten
Außer E. albidus können auch andere Arten verwendet werden, dann sind Prüfverfahren und Validitätskriterien entsprechend anzupassen. Da viele Enchytraeus-Arten leicht zu beschaffen sind und im Labor gut gehalten werden können, sind die wichtigsten Kriterien für die Auswahl einer anderen Art als E. albidus die ökologische Relevanz und die Empfindlichkeit der jeweiligen Art. Es kann allerdings auch praktische Gründe für die Umstellung auf eine andere Art geben. In Ländern beispielsweise, in denen E. albidus nicht vorkommt und auch nicht eingeführt werden darf (z. B. aufgrund von Quarantänebestimmungen) müssen andere Enchytraeus-Arten verwendet werden.
Beispiele für geeignete alternative Arten)
- —
- Enchytraeus crypticus (Westheide und Graefe 1992): Diese Art wurde in den letzten Jahren häufig in ökotoxologischen Untersuchungen verwendet, weil sie sich leicht züchten und untersuchen lässt. Die Würmer sind allerdings klein und entsprechend schwieriger zu handhaben als E. albidus (besonders in den Phasen vor Durchführung der Färbemethode). Das Vorkommen von E. crypticus im Freiland konnte nicht sicher nachgewiesen werden, da diese Art bisher nur in Zusammenhang mit Regenwurmkulturen beschrieben wurde. Seine ökologischen Anforderungen sind daher nicht bekannt.
- —
- Enchytraeus buchholzi (Vejdovsky 1879): Unter dieser Bezeichnung wird vermutlich eine Gruppe eng verwandter Arten erfasst, die morphologisch schwer voneinander zu unterscheiden sind. Diese Art sollte nur dann für Prüfungen verwendet werden, wenn die für eine Untersuchung vorgesehenen Tiere jeweils einer bestimmten Art zugeordnet werden können. E. buchholzi kommt gewöhnlich in Wiesen und an gestörten Standorten (z. B. an Straßenrändern) vor.
- —
- Enchytraeus luxuriosus: Diese Art wurde ursprünglich als E. ‚minutus‘ bezeichnet; sie wurde erst vor Kurzem näher beschrieben (1). E. minutus wurde von U. ¹⁸¹⁷Graefe (Hamburg) erstmals in einer Wiese in der Nähe von St. ¹⁸¹⁸Peter-Ording (Schleswig-Holstein) entdeckt. E. luxuriosus ist etwa halb so groß wie E. albidus, aber größer als die übrigen hier behandelten Arten. Insoweit könnte diese Art eine gute Alternative zu E. albidus darstellen.
- —
- Enchytraeus bulbosus (Nielsen und Christensen 1963): Bislang wurde diese Art in mineralischen Böden in Deutschland und in Spanien dokumentiert, wo wie allgemein verbreitet ist, aber keine sehr großen Populationen aufweist. ¹⁸²¹Im Vergleich zu anderen kleinen Arten dieser Gattung ist diese Art verhältnismäßig leicht zu bestimmen. ¹⁸²²Über ihr Verhalten in Laborversuchen oder über ihre Empfindlichkeit gegenüber Chemikalien ist nichts bekannt. ¹⁸²³Allerdings hat sich gezeigt, dass die Art leicht zu kultivieren ist (E. ¹⁸²⁴Belotti, persönliche Mitteilung).
ZuchtbedingungenAlle oben genannten Enchytraeus-Arten können in den Substraten kultiviert werden, die auch für E. albidus verwendet werden. Wegen der geringeren Größe der Tiere können auch die Kulturgefäße kleiner sein, und es kann zwar das gleiche Futter verwendet werden, aber die Futtermengen sind zu reduzieren. Der Lebenszyklus dieser Arten ist kürzer als der von E. albidus, und die Tiere müssen häufiger gefüttert werden.
Prüfbedingungen
Im Allgemeinen werden die Prüfungen unter den gleichen Bedingungen vorgenommen wie bei E. albidus; die folgenden Unterschiede sind allerdings zu beachten:
- —
- Die Prüfgefäße können (müssen aber nicht) kleiner sein;
- —
- der Reproduktionstest kann (muss aber nicht) verkürzt werden (etwa von sechs Wochen auf vier Wochen); die Dauer eines Vorversuchs sollte allerdings nicht geändert werden;
- —
- in Anbetracht der geringen Größe der juvenilen Tiere wird nachdrücklich die Färbemethode zum Zählen der Tiere empfohlen;
- —
- das Validitätskriterium bezüglich der ‚Anzahl der juvenilen Tiere pro Prüfgefäß in der Kontrollgruppe‘ ist auf ‚50‘ zu ändern.
LITERATUR | (1) | Schmelz, R.M, und Collado, R. (1999). ¹⁸³⁰Enchytraeus luxuriosus sp.nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeidae, Clitellata, Annelida). ¹⁸³¹Carolinea 57, 93-100. |
Anlage 6Detaillierte Beschreibung der Entnahmeverfahren
Färbung mit Bengalrot
Diese ursprünglich in der limnischen Ökologie (1) entwickelte Methode wurde für die Zählung juveniler Enchytraeen im Enchytraeen-Reproduktionstest erstmals von W. ¹⁸³³de Coen (Universität Gent, Belgien) beschrieben. ¹⁸³⁴Unabhängig davon wurde von RIVM Bilthoven eine modifizierte Version entwickelt (Bengalrot gemischt mit Formaldehyd statt mit Ethanol) (2)(3).
¹⁸³⁵Am Ende des definitiven Tests (d. h. nach sechs Wochen) wird der Boden aus den Prüfgefäßen in ein flaches Behältnis umgefüllt. ¹⁸³⁶Geeignet ist beispielsweise ein Bellaplast-Gefäß oder ein Fotoschale mit geripptem Boden, weil die Rippen die Beweglichkeit der Würmer im Beobachtungsbereich einschränken. ¹⁸³⁷Die juvenilen Tiere werden mit Ethanol fixiert (ca. ¹⁸³⁸5 ml pro Replikat). ¹⁸³⁹Anschließend werden die Gefäße 1-2 cm hoch mit Wasser befüllt. ¹⁸⁴⁰Einige Tropfen (200-300 μl) Bengalrot (1 %ige Lösung in Ethanol) werden hinzugegeben (alternativ 0,5 % Eosin), und die beiden Bestandteile werden sorgfältig gemischt. ¹⁸⁴¹Nach zwölf Stunden sollten die Würmer eine rötliche Farbe aufweisen und leicht zu zählen sein, weil sie auf der Oberfläche des Substrats liegen. ¹⁸⁴²Alternativ kann die Substrat-Alkoholmischung durch ein Sieb gegeben werden (Maschenweite 0,250 mm), bevor die Würmer gezählt werden. ¹⁸⁴³Bei diesem Verfahren werden Kaolinit, Torf und (teilweise) Sand ausgewaschen; die rötlich eingefärbten Würmer sind dann leichter zu erkennen und zu zählen. ¹⁸⁴⁴Die Verwendung beleuchteter Lupen (Größe der Lupe mindestens 100 × 75 mm mit 2- oder 3-facher Vergrößerung) erleichtert das Zählen ebenfalls.
Die Färbetechnik verkürzt den Zeitaufwand beim Zählen auf wenige Minuten pro Gefäß; in der Regel müsste eine Person alle in einem Test verwendeten Gefäße in höchstens zwei Tagen auszählen können.
Nassextraktion
Mit der Nassextraktion sollte unmittelbar nach Testende begonnen werden. ¹⁸⁴⁷Der Boden aus den Prüfgefäßen wird in Kunststoffsiebe mit einer Maschenweite von etwa 1 mm gegeben. ¹⁸⁴⁸Anschließend werden die Siebe so auf Kunststoffschalen gesetzt, dass sie den Boden nicht berühren. ¹⁸⁴⁹Die Schalen werden vorsichtig mit Wasser gefüllt, bis die Proben in den Sieben vollständig von Wasser bedeckt sind. ¹⁸⁵⁰Um eine Wiederfindungsrate von mehr als 90 % aller vorhandenen Würmer sicherzustellen, ist für die Entnahme eine Zeitraum von 3 Tagen bei 20 ± 2 °C vorzusehen. ¹⁸⁵¹Am Ende des Extraktionszeitraums werden die Siebe herausgenommen, und das Wasser wird (bis auf einen kleinen Anteil) langsam dekantiert, wobei darauf zu achten ist, dass die Sedimente am Boden der Gefäße nicht aufgewirbelt werden. ¹⁸⁵²Die Kunststoffschalen werden dann leicht geschwenkt, um die Sedimente im Überstandswasser zu suspendieren. ¹⁸⁵³Danach wird das Wasser in eine Petrischale gegeben. ¹⁸⁵⁴Nach dem Absetzen der Bodenpartikel sind die Enchytraeen erkennbar und können mit einer Stahlpinzette mit weichen Spitzen unter einem Stereomikroskop entnommen und gezählt werden.
Flotation
Eine Flotationsmethode wurde in einer Anmerkung von R. ¹⁸⁵⁶Kuperman (4) beschrieben. ¹⁸⁵⁷Nach dem Fixieren des Inhalts eines Prüfgefäßes mit Ethanol wird der Boden bis zu einer Höhe von 10-15 mm über der Bodenoberfläche mit kolloidalem Siliciumdioxid Ludox AM-30 (30 Gew.- % Suspension in Wasser) bedeckt. ¹⁸⁵⁸Nachdem der Boden 2-3 Minuten gründlich mit dem Flotationsmittel gemischt wurde, können die auf der Oberfläche schwimmenden juvenilen Würmer leicht gezählt werden.
LITERATUR
| (1) | Korinkova, J., und Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. |
| (2) | Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R., und Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 S. |
| (3) | Posthuma, aL., Baerselmann, R., Van Veen, R.P.M., und Dirven-Van Breemen, E.M. (1997). Single and joint toxic effects of copper and zinc on reproduction of Enchytraeus crypticus in relation to sorption of metals in soils. Ecotox. Envir. Safety 38, 108-121. |
| (4) | Phillips, C.T., Checkai, R.T., und Kuperman, R.G. (1998). ¹⁸⁶³An alternative to the O'Connor Method for Extracting Enchytraeids from Soil. SETAC 19th Annual Meeting, Charlotte, USA. ¹⁸⁶⁴Abstract Book No. PMP069, S. 157. |
Anlage 7Überblick über die statistische Auswertung der Daten (NOEC-Bestimmung)
 C.33. REPRODUKTIONSTEST MIT REGENWÜRMERN (EISENIA FETIDA/EISENIA ANDREI)EINLEITUNG
| 1. | ¹⁸⁶⁵Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 222 (2004). Sie wird zur Beurteilung der Wirkungen von Chemikalien im Boden auf die Reproduktionsleistung (sowie zur Beurteilung sonstiger subletaler Endpunkte) der Regenwurm-Arten Eisenia fetida (Savigny 1826) und Eisenia andrei (Andre 1963) verwendet (1)(2). ¹⁸⁶⁶Die Methode wurde einem Ringtest unterzogen (3). ¹⁸⁶⁷Eine Methode zur Prüfung der akuten Toxizität bei Regenwürmern ist verfügbar (4). ¹⁸⁶⁸Außerdem wurde eine Reihe weiterer internationaler und nationaler Leitlinien zur Prüfung der akuten und der chronischen Toxizität bei Regenwürmern veröffentlicht (5)(6)(7)(8). |
| 2. | Eisenia fetida /Eisenia andrei werden als Vertreter der Bodenfauna und insbesondere der Familie der Regenwürmer betrachtet. Hintergrundinformationen zur Ökologie der Regenwürmer und ihre Verwendung bei Ökotoxizitätsprüfungen sind verfügbar (7)(9)(10)(11)(12). |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 3. | ¹⁸⁷¹Adulte Würmer werden einer Reihe von Konzentrationen der entweder in den Boden gemischten oder — bei Pestiziden — auf oder in den Boden applizierten Prüfchemikalie ausgesetzt; dabei ist entsprechend den Anwendungsformen der jeweiligen Chemikalie zu verfahren. ¹⁸⁷²Das Applikationsverfahren hängt von den Prüfzielen ab. ¹⁸⁷³Die Konzentrationsspanne wird so gewählt, dass die Konzentrationen abgedeckt sind, bei denen über einen Zeitraum von acht Wochen mit subletalen und letalen Wirkungen zu rechnen ist. ¹⁸⁷⁴Nach vierwöchiger Exposition werden die Wirkungen auf die Mortalität und das Wachstum der adulten Würmer ermittelt. ¹⁸⁷⁵Die adulten Würmer werden aus dem Boden entfernt, und nach weiteren vier Wochen werden durch Auszählen der im Boden vorhandenen juvenilen Tiere die Wirkungen auf die Reproduktionsleistung beurteilt. Die Reproduktionsleistung der Tiere, die der Prüfchemikalie ausgesetzt waren, wird mit der Reproduktionsleistung der Kontrollgruppe(n) verglichen, um (i) die NOEC (höchste messbare Konzentration ohne statistisch signifikante Wirkung) und/oder (ii) mithilfe eines Regressionsmodells den ECx-Wert (z. B. EC10 oder EC50), d. h. die Konzentration zu ermitteln, bei der die Reproduktionsleistung um x % reduziert wird. ¹⁸⁷⁶Die Testkonzentrationen müssen den ECx-Bereich einschließen (z. B. EC10 und EC50), damit der ECx-Wert nicht extrapoliert werden muss, sondern durch Interpolation bestimmt werden kann (Begriffsbestimmungen siehe Anlage 1). |
ANGABEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 4. | Die folgenden Angaben zur Prüfchemikalie müssen verfügbar sein, um geeignete Prüfverfahren aufstellen zu können:- —
- Wasserlöslichkeit,
- —
- log Kow,
- —
- Dampfdruck
- —
- und möglichst Informationen zu Verbleib und Verhalten in der Umwelt (z. B. Photolyse- und Hydrolyserate soweit für die jeweilige Auf- oder Einbringung von Bedeutung).
|
| 5. | ¹⁸⁷⁸Diese Prüfmethode ist bei allen Chemikalien unabhängig von ihrer Wasserlöslichkeit anzuwenden. ¹⁸⁷⁹Für flüchtige Chemikalien ist die Prüfmethode nicht geeignet (d. h. für Chemikalien, bei denen die Henry-Konstante oder der Luft-Wasser-Verteilungskoeffizient größer als 1 ist, oder für Chemikalien, bei denen der Dampfdruck bei 25 °C mehr als 0,0133 Pa beträgt). |
| 6. | ¹⁸⁸⁰Bei dieser Prüfmethode wird ein möglicher Abbau der Prüfchemikalie im Laufe des Versuchs nicht berücksichtigt. ¹⁸⁸¹Entsprechend kann nicht davon ausgegangen werden, dass die anfänglichen Expositionskonzentrationen während der gesamten Prüfung aufrechterhalten werden. ¹⁸⁸²In diesem Fall sind chemische Analysen der Prüfchemikalie zu Beginn und am Ende der Prüfung zu empfehlen. |
REFERENZCHEMIKALIE | 7. | ¹⁸⁸³Der NOEC- und/oder der ECx-Wert einer Referenzchemikalie sind zu ermitteln, um angemessene Bedingungen für den Labortest sicherstellen und nachweisen zu können, dass sich die Reaktion der Testorganismen im Laufe der Zeit nicht statistisch relevant ändert. ¹⁸⁸⁴Referenzchemikalien sollten mindestens einmal jährlich bzw. — wenn die Tests seltener durchgeführt werden — parallel zur Bestimmung der Toxizität einer Prüfchemikalie getestet werden. ¹⁸⁸⁵Bei Carbendazim oder Benomyl wird die Reproduktionsleistung nachweislich beeinträchtigt; entsprechend sind beide Chemikalien als Referenzchemikalien geeignet (3). Signifikante Wirkungen müssten bei (a) 1 bis 5 mg Wirkstoff/kg Trockenmasse oder (b) 250-500 g/ha oder 25-50 mg/m2 festzustellen sein. ¹⁸⁸⁶Wenn ein positiver toxischer Standard in die Testreihe aufgenommen wird, ist eine einzige Konzentration zu verwenden, und die Anzahl der Replikate muss mit der Anzahl in den Kontrollen übereinstimmen. |
VALIDITÄT DES TESTS | 8. | Damit ein Testergebnis als valide gewertet werden kann, müssen die Kontrollen die folgenden Kriterien erfüllen:- —
- Aus jedem Replikat (mit jeweils 10 adulten Würmern) müssen bis zum Ende des Tests ≥ 30 juvenile Tiere hervorgegangen sein;
- —
- der Variationskoeffizient der Reproduktionsleistung liegt bei ≤ 30 %;
- —
- die Mortalität adulter Tiere in den ersten vier Wochen des Tests beträgt ≤ 10 %.
¹⁸⁸⁸Wenn ein Test die genannten Validitätskriterien nicht erfüllt, ist der Test zu beenden, sofern keine besonderen Gründe für seine Fortsetzung vorliegen. ¹⁸⁸⁹Die Begründung ist in den Bericht aufzunehmen. |
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODEAusrüstung
| 9. | ¹⁸⁹⁰Zu verwenden sind Prüfbehälter aus Glas oder einem sonstigen chemisch inerten Material mit einem Fassungsvermögen von etwa 1 bis 2 l. Die Behälter sollten eine Querschnittsfläche von etwa 200 cm2 haben, damit bei Zugabe von 500 bis 600 g Substrat (Trockenmasse) eine Tiefe des feuchten Substrats von etwa 5 bis 6 cm erreicht wird. ¹⁸⁹¹Die Abdeckung des Behälters muss den Gasaustausch zwischen dem Substrat und der Atmosphäre zulassen, lichtdurchlässig sein (z. B. kann eine perforierte transparente Abdeckung verwendet werden) und ein Entweichen der Würmer verhindern. ¹⁸⁹²Wenn erheblich mehr Testsubstrat als die genannten 500 bis 600 g pro Prüfbehälter verwendet wird, ist die Anzahl der Würmer entsprechend zu erhöhen. |
| 10. | Es wird eine übliche Laborausrüstung insbesondere mit folgenden Bestandteilen benötigt:- —
- Trockenschrank;
- —
- Stereomikroskop;
- —
- pH-Messgerät und Photometer;
- —
- Waagen mit geeigneter Genauigkeit;
- —
- geeignete Vorrichtungen zur Temperaturregelung;
- —
- geeignete Ausrüstung zur Feuchtigkeitsregelung (bei Expositionsgefäßen mit Deckel nicht wesentlich);
- —
- Inkubator oder kleiner Raum mit Klimaanlage;
- —
- Pinzette, Haken oder Schlaufen;
- —
- Wasserbad.
|
Herstellung des künstlichen Bodens | 11. | In diesem Test wird künstlicher Boden (5)(7) mit folgender Zusammensetzung verwendet (bezogen auf Trockenmassen, bei 105 °C bis zur Massekonstanz getrocknet):- —
- 10 % Sphagnum-Torf (pH-Wert möglichst im Bereich 5,5-6,0, keine sichtbaren Pflanzenreste, fein gemahlen und auf einen bestimmten Feuchtegehalt getrocknet);
- —
- 20 % Kaolin-Ton (Kaolinit-Anteil vorzugsweise über 30 %);
- —
- 0,3 bis 1,0 % Calciumcarbonat (CaCO3, pulverisiert, analysenrein), um einen pH-Ausgangswert von 6,0 ± 0,5 zu erzielen;
- —
- 70 % luftgetrockneter Quarzsand (je nach erforderlichem CaCO3-Anteil), hauptsächlich Feinsand mit mehr als 50 % Partikeln mit einer Größe von 50-200 μm.
Hinweis 1: Wie viel CaCO3 benötigt wird, hängt von der Zusammensetzung des Bodensubstrats einschließlich des Futters ab und ist unmittelbar vor der Untersuchung durch Messung von Teilproben des Bodens zu ermitteln. Der pH-Wert in einer gemischten Probe wird in einer Kaliumchlorid-Lösung (1 mol) oder einer Calciumchlorid-Lösung (CaCl2) (0,01 mol) bestimmt (13).Hinweis 2: Der Gehalt des künstlichen Bodens an organischem Kohlenstoff kann reduziert werden, z. B. indem der Torfgehalt auf 4 bis 5 % verringert und der Sandanteil entsprechend erhöht wird. ¹⁸⁹⁷Durch eine solche Reduzierung des Gehalts an organischem Kohlenstoff kann die Adsorption der Prüfchemikalie an den Boden (organischen Kohlenstoff) verringert werden und die Bioverfügbarkeit der Prüfchemikalie für die Würmer zunehmen. Es wurde nachgewiesen, dass Eisenia fetida den Validitätskriterien hinsichtlich der Vermehrung bei Versuchen mit Feldböden mit geringerem Gehalt an organischem Kohlenstoff (z. B. 2,7 % (14)) genügt, und es hat sich gezeigt, dass diese Ergebnisse auch mit künstlichem Boden mit 5 %igem Torfgehalt erzielt werden können. ¹⁸⁹⁸Daher ist es zur Erfüllung der Validitätskriterien vor der Verwendung des künstlichen Bodens in einer Hauptprüfung nicht notwendig, seine Eignung für die Prüfung nachzuweisen, wenn der Torfgehalt nicht stärker als oben angegeben reduziert wird.
Hinweis 3: Wenn in weiteren (z. B. höherstufigen) Tests natürlicher Boden verwendet wird, sind auch die Eignung dieses Bodens und die Erfüllung der Validitätskriterien des Tests nachzuweisen.
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| 12. | ¹⁹⁰⁰Die trockenen Bestandteile des Bodens werden in einem gut belüfteten Bereich gründlich durchmischt (z. B. in einem großen Labormischer). ¹⁹⁰¹Vor Prüfbeginn wird der trockene künstliche Boden mit so viel entionisiertem Wasser befeuchtet, bis etwa die Hälfte des endgültigen Wassergehalts erreicht ist, die 40 bis 60 % der maximalen Wasserhaltekapazität (50 ± 10 % Feuchte bezogen auf die Trockenmasse) entspricht. ¹⁹⁰²Dabei entsteht ein Substrat, das kein überstehendes oder freies Wasser mehr enthält (durch Ausdrücken mit der Hand festzustellen). ¹⁹⁰³Die maximale Wasserhaltekapazität des künstlichen Bodens wird mit den in Anlage 2, ISO 11274 (15) oder der entsprechenden EU-Norm beschriebenen Verfahren ermittelt. |
| 13. | ¹⁹⁰⁴Wird die Prüfchemikalie auf die Bodenoberfläche aufgebracht oder ohne Wasser in den Boden gemischt, so kann die endgültige Menge des Wassers bei der Herstellung des Substrats in den künstlichen Boden gemischt werden. ¹⁹⁰⁵Wird die Prüfchemikalie zusammen mit etwas Wasser in den Boden gemischt, kann das zusätzliche Wasser zusammen mit der Prüfchemikalie hinzugegeben werden (siehe Nummer 19). |
| 14. | ¹⁹⁰⁶Der Feuchtegehalt des Bodens wird zu Beginn und am Ende des Tests gemäß ISO 11465 (16) oder nach der entsprechenden EU-Norm und der pH-Wert nach Anlage 3 oder ISO 10390 (13) bzw. der entsprechenden EU-Norm bestimmt. ¹⁹⁰⁷Diese Parameter sind an einer Probe des Kontrollbodens und jeweils an einer Probe des Bodens mit den einzelnen Testkonzentrationen zu ermitteln. ¹⁹⁰⁸Wenn saure oder basische Chemikalien geprüft werden, braucht der pH-Wert des Bodens nicht korrigiert zu werden. ¹⁹⁰⁹Der Feuchtegehalt ist während des gesamten Tests durch regelmäßiges Wiegen der Behältnisse zu kontrollieren (siehe Nummern 26 und 30). |
Auswahl und Vorbereitung der Testtiere | 15. | ¹⁹¹⁰Als Testspezies werden Eisenia fetida oder Eisenia andrei verwendet (1)(2). ¹⁹¹¹Für den Prüfbeginn werden adulte, zwei bis zwölf Monate alte Würmer mit Clitellum benötigt. ¹⁹¹²Die Würmer sind aus einer synchronisierten Kultur mit verhältnismäßig homogener Altersstruktur auszuwählen (Anlage 4). ¹⁹¹³Der Altersunterschied zwischen den Tieren einer Testgruppe darf höchstens vier Wochen betragen. |
| 16. | ¹⁹¹⁴Die ausgewählten Würmer werden mindestens einen Tag lang an den für die Prüfung zu verwendenden künstlichen Boden gewöhnt. ¹⁹¹⁵Sie erhalten dabei das gleiche Futter, das auch im Test verwendet werden soll (siehe Nummern 31-33). |
| 17. | ¹⁹¹⁶Zu Prüfbeginn werden Gruppen von je 10 Würmern einzeln gewogen und nach dem Zufallsprinzip auf die Prüfbehälter verteilt. ¹⁹¹⁷Vor dem Wiegen werden die Würmer mit entionisiertem Wasser gewaschen und zum Abtropfen kurz auf Filterpapier gesetzt. ¹⁹¹⁸Die Feuchtmasse der Würmer sollte jeweils zwischen 250 und 600 mg betragen. |
Herstellung der Testkonzentrationen | 18. | ¹⁹¹⁹Für die Applikation der Prüfchemikalie kommen zwei Methoden in Betracht: Die Prüfchemikalie kann in den Boden gemischt (siehe Nummern 19-21) oder auf die Bodenoberfläche aufgebracht werden (siehe Nummern 22-24). ¹⁹²⁰Welche Methode jeweils zu verwenden ist, hängt von den Prüfzielen ab. ¹⁹²¹Im Allgemeinen wird empfohlen, die Prüfchemikalie in den Boden zu mischen. ¹⁹²²Es können allerdings Applikationsverfahren erforderlich sein, die der gängigen landwirtschaftlichen Praxis (z. B. Aufsprühen einer flüssigen Formulierung oder Verwendung spezieller Pestizidformulierungen wie z. B. Granulate oder Saatgutbeizen) entsprechen. ¹⁹²³Als Hilfsmittel zur Aufbereitung des Bodens mit der Prüfchemikalie sollten Lösungsmittel ausgewählt werden, die gegenüber Regenwürmern wenig toxisch sind, und im Prüfprotokoll ist eine geeignete Lösungsmittelkontrolle vorzusehen (siehe Nummer 27). |
Mischen der Prüfchemikalie in den BodenWasserlösliche Prüfchemikalien
| 19. | ¹⁹²⁴Unmittelbar vor Prüfbeginn wird eine Lösung der Prüfchemikalie in entionisiertem Wasser in der für alle Replikate einer Testkonzentration erforderlichen Menge hergestellt. ¹⁹²⁵Um die Herstellung der Testlösung zu erleichtern, wird unter Umständen ein zweites Lösungsmittel benötigt. ¹⁹²⁶Aus praktischen Gründen sollte so viel Lösung hergestellt werden, wie zur Erzielung des endgültigen Feuchtegehalts (40 bis 60 % der maximalen Wasserhaltekapazität) erforderlich ist. ¹⁹²⁷Die Lösung wird gründlich mit dem Bodensubstrat gemischt, bevor die Mischung in die Prüfbehälter gegeben wird. |
Wasserunlösliche Prüfchemikalien | 20. | ¹⁹²⁸Die Prüfchemikalie wird in einem kleinen Volumen eines geeigneten organischen Lösungsmittels (z. B. Aceton) gelöst und dann auf eine kleine Menge feinen Quarzsand aufgesprüht oder mit dem Sand vermischt. ¹⁹²⁹Anschließend wird sie einige Minuten unter einen Abzug gestellt, damit das Lösungsmittel verdunsten kann. ¹⁹³⁰Der so behandelte Sand wird gründlich mit dem angefeuchteten künstlichen Boden gemischt. ¹⁹³¹Danach wird entionisiertes Wasser in der erforderlichen Menge hinzugegeben und mit dem Substrat gemischt, um einen endgültigen Feuchtegehalt von 40 bis 60 % der maximalen Wasserhaltekapazität zu erzielen. ¹⁹³²Der Boden kann dann in die Prüfbehälter gegeben werden. ¹⁹³³Dabei ist zu beachten, dass manche Lösungsmittel für Regenwürmer toxisch sein können. |
In Wasser und organischen Lösungsmitteln unlösliche Prüfchemikalien | 21. | ¹⁹³⁴10 g fein gemahlener Industrie-Quarzsand werden mit der Menge der Prüfchemikalie gemischt, die zur Erzielung der Testkonzentration im Boden benötigt wird. ¹⁹³⁵Anschließend wird diese Mischung gründlich mit dem angefeuchteten künstlichen Boden gemischt. ¹⁹³⁶Danach wird entionisiertes Wasser in der erforderlichen Menge hinzugegeben und mit dem Substrat gemischt, um einen endgültigen Feuchtegehalt von 40 bis 60 % der maximalen Wasserhaltekapazität zu erhalten. ¹⁹³⁷Der Boden kann dann in die Prüfbehälter gegeben werden. |
Applikation der Prüfchemikalie auf die Bodenoberfläche | 22. | ¹⁹³⁸Der Boden wird nach dem Einsetzen der Würmer behandelt. ¹⁹³⁹Die Prüfbehälter werden zunächst mit dem angefeuchteten Bodensubstrat gefüllt; anschließend werden die gewogenen Würmer auf die Oberfläche gesetzt. ¹⁹⁴⁰Gesunde Würmer graben sich in der Regel sofort in das Substrat ein; nach 15 Minuten noch an der Oberfläche verbliebene Würmer werden entsprechend als beschädigt betrachtet und sind zu ersetzen. ¹⁹⁴¹Wenn Würmer ersetzt werden, sind die neuen Würmer und die zu ersetzenden Würmer zu wiegen, damit zu Prüfbeginn das Lebendgewicht der gesamten exponierten Gruppe und das Gesamtgewicht des Behälters mit den Würmern bekannt sind. |
| 23. | ¹⁹⁴²Danach wird die Prüfchemikalie hinzugegeben. ¹⁹⁴³In der ersten halben Stunde nach dem Einsetzen der Würmer (oder wenn sich noch Würmer an der Oberfläche befinden) darf die Prüfchemikalie noch nicht hinzugegeben werden, um einen unmittelbaren Hautkontakt mit der Prüfchemikalie zu vermeiden. ¹⁹⁴⁴Handelt es sich bei der Prüfchemikalie um ein Pestizid, kann es angebracht sein, die Chemikalie auf den Boden aufzusprühen. ¹⁹⁴⁵Die Prüfchemikalie ist mit einem geeigneten Labor-Sprühgerät möglichst gleichmäßig auf den Boden aufzubringen, um die Sprühapplikation im Freiland zu simulieren. ¹⁹⁴⁶Vor der Applikation die Abdeckung des Prüfbehälters abnehmen und den Behälter auskleiden, um die Seitenwände des Behälters vor Spritzern zu schützen. ¹⁹⁴⁷Zur Auskleidung kann ein Prüfbehälter ohne Boden verwendet werden. Die Applikation muss bei einer Temperatur von 20 ± 2 °C und, bei wässrigen Lösungen, Emulsionen oder Dispersionen, mit einem Wasserdurchsatz von 600-800 μl/m2 erfolgen. ¹⁹⁴⁸Die Wassermenge ist mit einem geeigneten Kalibrierungsverfahren zu kontrollieren. ¹⁹⁴⁹Spezielle Formulierungen (z. B. Granulate oder Saatgutbeizen) sind entsprechend der landwirtschaftlichen Praxis aufzubringen. |
| 24. | ¹⁹⁵⁰Die Prüfbehälter bleiben eine Stunde geöffnet, damit zur Applikation der Prüfchemikalie verwendete flüchtige Lösungsmittel verdunsten können. ¹⁹⁵¹Dabei ist darauf zu achten, dass in diesem Zeitraum keine Würmer die Prüfgefäße verlassen. |
VERFAHRENTest- und Kontrollgruppen
| 25. | ¹⁹⁵²Empfohlen werden 10 Regenwürmer je 500 bis 600 g künstlichen Bodens (Trockenmasse) (d. h. 50 bis 60 g Boden pro Wurm). ¹⁹⁵³Wenn größere Mengen an Boden verwendet werden (etwa bei der Prüfung von Pestiziden in Verbindung mit besonderen Applikationsverfahren (z. B. bei Saatgutbeizen)) muss das Verhältnis von 50 bis 60 g Boden pro Wurm durch Erhöhung der Anzahl der Würmer ausgeglichen werden. ¹⁹⁵⁴Für jeden Kontrollbehälter und jeden Prüfbehälter sind 10 Würmer vorzubereiten. ¹⁹⁵⁵Die Würmer werden gewaschen, abgewischt und dann kurz auf saugfähiges Papier gelegt, um überschüssiges Wasser zu entfernen. |
| 26. | ¹⁹⁵⁶Um systematische Fehler beim Verteilen der Würmer auf die Prüfbehälter zu vermeiden, ist die Homogenität der Prüfpopulation zu bestimmen, indem aus der Population, aus der die Versuchstiere zu entnehmen sind, eine Probe von 20 Würmern nach dem Zufallsprinzip entnommen wird. ¹⁹⁵⁷Diese werden einzeln gewogen. ¹⁹⁵⁸Nachdem die nötige Homogenität sichergestellt ist, werden Gruppen von Würmern gebildet, gewogen und nach dem Zufallsprinzip den Prüfbehältern zugeordnet. ¹⁹⁵⁹Nach dem Einsetzen der Versuchstiere ist jeder einzelne Prüfbehälter zu wiegen, um ein Ausgangsgewicht zu erhalten, das als Grundlage für die Überwachung des Feuchtegehalts des Bodens während des gesamten Versuchs dienen kann (siehe Nummer 30). ¹⁹⁶⁰Anschließend werden die Prüfbehälter, wie unter Nummer 9 beschrieben, abgedeckt und in die Prüfkammer gestellt. |
| 27. | ¹⁹⁶¹Für jede der unter den Nummern 18-24 beschriebenen Methoden zur Applikation der Prüfchemikalie werden geeignete Kontrollen hergestellt. ¹⁹⁶²Die beschriebenen Verfahren sind auch bei Herstellung der Kontrollen einzuhalten, allerdings wird keine Prüfchemikalie hinzugegeben. ¹⁹⁶³Gegebenenfalls werden also organische Lösungsmittel, Quarzsand oder sonstige Trägerstoffe in Konzentrationen/Mengen entsprechend den Anteilen in den Prüfbehältern hinzugegeben. ¹⁹⁶⁴Soweit ein Lösungsmittel oder ein sonstiger Trägerstoff verwendet wird, um eine Prüfchemikalie aufzubringen, ist eine zusätzliche Kontrolle ohne den Trägerstoff und ohne die Prüfchemikalie herzustellen und zu untersuchen, um sicherzustellen, dass der Trägerstoff keine Auswirkungen auf das Ergebnis hat. |
Prüfbedingungen | 28. | ¹⁹⁶⁵Die Testtemperatur beträgt 20 ± 2 °C. ¹⁹⁶⁶Der Test wird bei einem geregelten Licht-Dunkel-Zyklus (vorzugsweise 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit) mit einer Lichtstärke von 400 bis 800 lx im Bereich der Prüfbehälter durchgeführt. |
| 29. | Die Prüfbehälter werden während des Versuchs nicht belüftet; die Deckel der Prüfgefäße sollten jedoch so beschaffen sein, dass ein Gasaustausch ermöglicht und die Verdunstung von Feuchtigkeit begrenzt wird (siehe Nummer 9). |
| 30. | ¹⁹⁶⁸Der Wassergehalt des Bodensubstrats in den Prüfbehältern ist während des gesamten Versuchs aufrechtzuerhalten, indem die Prüfbehälter (ohne Abdeckung) regelmäßig gewogen und Verluste gegebenenfalls mit entionisiertem Wasser ausgeglichen werden. ¹⁹⁶⁹Der Wassergehalt sollte um höchstens 10 % vom Anfangswassergehalt abweichen. |
Fütterung | 31. | ¹⁹⁷⁰Akzeptabel ist jedes Futter, das nachweislich dafür sorgt, während der Dauer des Versuchs das Gewicht der Würmer aufrechtzuerhalten. ¹⁹⁷¹Erfahrungsgemäß sind Haferflocken sowie Rinder- und Pferdedung geeignet. ¹⁹⁷²Es muss sichergestellt werden, dass die Rinder oder Pferde, von denen der Dung stammt, nicht mit Arzneimitteln oder Chemikalien wie z. B. wachstumsfördernden Mitteln, Nematiziden oder sonstigen veterinärmedizinischen Produkten behandelt wurden, die die Entwicklung der Würmer während des Versuchs beeinträchtigen könnten. ¹⁹⁷³Nach Möglichkeit sollte selbstgesammelter Rinderdung verwendet werden, da sich gezeigt hat, dass im Handel als Gartendünger angebotener Rinderdung nachteilige Wirkungen auf die Würmer haben kann. ¹⁹⁷⁴Der Dung sollte luftgetrocknet und fein gemahlen sein und vor seiner Verwendung pasteurisiert werden. |
| 32. | ¹⁹⁷⁵Jede frische Futtercharge ist vor der Verwendung im Versuch an eine nicht für den Versuch vorgesehene Wurmkultur zu verfüttern, um sicherzustellen, dass es von geeigneter Qualität ist. ¹⁹⁷⁶Das Wachstum und die Kokonbildung dürfen bei den Würmern im Vergleich zu Würmern in einem Substrat, das kein Futter aus der neuen Charge enthält (Bedingungen siehe Prüfmethode C.8 (4)), nicht beeinträchtigt sein. |
| 33. | ¹⁹⁷⁷Das Futter wird erstmals einen Tag nach dem Einsetzen der Würmer und nach Applikation der Prüfchemikalie auf den Boden bereitgestellt. ¹⁹⁷⁸In jedem Behälter werden etwa 5 g des Futters auf der Bodenoberfläche verteilt und mit entionisiertem Wasser befeuchtet (etwa 5 bis 6 ml pro Behälter). ¹⁹⁷⁹Danach wird während der vierwöchigen Testdauer einmal pro Woche frisches Futter hinzugegeben. ¹⁹⁸⁰Wenn das Futter nicht verzehrt wird, ist die Ration zu reduzieren, um Pilz- und Schimmelbildung zu vermeiden. ¹⁹⁸¹Die adulten Würmer werden an Tag 28 des Versuchs aus dem Boden genommen. ¹⁹⁸²Danach werden nochmals weitere 5 g Futter in die Prüfbehälter gegeben. ¹⁹⁸³Während der übrigen vier Wochen des Tests wird nicht mehr gefüttert. |
Auswahl der Testkonzentrationen | 34. | ¹⁹⁸⁴Bereits bekannte Informationen über die Toxizität der Prüfchemikalie bieten einen Anhaltspunkt für die Auswahl angemessener Testkonzentrationen (z. B. Erfahrungswerte aus einem Test zur Prüfung der akuten Toxizität (4) und/oder Ergebnisse von Vorversuchen). ¹⁹⁸⁵Wenn erforderlich, wird ein Vorversuch beispielsweise mit fünf Konzentrationen der Prüfchemikalie (0,1, 1,0, 10, 100 und 1 000 mg/kg (Trockenmasse des Bodens)) vorgenommen. ¹⁹⁸⁶Ein Replikat pro Gefäß mit Testkonzentration und pro Kontrolle ist ausreichend. ¹⁹⁸⁷Der Vorversuch dauert zwei Wochen; am Ende des Tests wird die Mortalität ermittelt. |
Prüfprotokoll | 35. | ¹⁹⁸⁸Da für diesen Versuch keine allgemeingültige Statistik vorgegeben werden kann, wird im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode die Ermittlung der NOEC- und ECx-Werte beschrieben. ¹⁹⁸⁹In absehbarer Zukunft werden die zuständigen Behörden wahrscheinlich die Angabe der NOEC vorschreiben. Ebenfalls in näherer Zukunft könnten ECx-Werte aus statistischen und ökologischen Gründen umfassender berücksichtigt werden. ¹⁹⁹⁰Entsprechend den Empfehlungen aufgrund eines Ringtests im Zusammenhang mit einem Prüfverfahren zur Ermittlung der Reproduktionsleistung von Enchytraeen werden daher drei Protokolle vorgeschlagen (17). |
| 36. | Bei der Festlegung der Konzentrationen sind die folgenden Aspekte zu berücksichtigen:- —
- Zur Bestimmung der NOEC sind mindestens fünf/zwölf Konzentrationen in einer geometrischen Reihe zu prüfen. ¹⁹⁹²Zu empfehlen sind vier Replikate je Testkonzentration und acht Kontrollen. ¹⁹⁹³Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 2,0 unterscheiden.
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- ¹⁹⁹⁴Zur Ermittlung der ECx-Werte (z. B. EC10 oder EC50) wird eine angemessene Anzahl an Konzentrationen empfohlen, die mindestens vier statistisch signifikant unterschiedliche mittlere Reaktionen hervorrufen. ¹⁹⁹⁵Zu empfehlen sind mindestens zwei Replikate pro Testkonzentration und sechs Replikate pro Kontrolle. ¹⁹⁹⁶Der Abstandsfaktor kann unterschiedlich sein (d. h. im erwarteten Wirkungsbereich maximal 1,8 und bei den höheren und niedrigeren Konzentrationen mehr als 1,8).
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- Ein kombinierter Ansatz ermöglicht die Bestimmung sowohl der NOEC als auch des ECx-Werts. ¹⁹⁹⁷Es sind acht Behandlungskonzentrationen in einer geometrischen Reihe zu verwenden. ¹⁹⁹⁸Zu empfehlen sind vier Replikate je Behandlung und acht Kontrollen. ¹⁹⁹⁹Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden.
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Testdauer und Messungen | 37. | ²⁰⁰⁰An Tag 28 werden die lebenden adulten Würmer ermittelt und gezählt. ²⁰⁰¹Verhaltensauffälligkeiten bei adulten Tiere (die Tiere können sich nicht mehr in den Boden eingraben oder liegen unbeweglich auf dem Boden) und morphologische Änderungen (z. B. offene Wunden) werden ebenfalls protokolliert. ²⁰⁰²Anschließend werden alle adulten Würmer aus den Prüfgefäßen herausgenommen, gezählt und gewogen. ²⁰⁰³Die Entnahme der adulten Würmer kann erleichtert werden, indem der Boden mit den Würmern vor der Beurteilung in eine saubere Schale umgefüllt wird. ²⁰⁰⁴Vor dem Wiegen werden die aus dem Boden entnommenen Würmer gewaschen (mit entionisiertem Wasser); zur Entfernung des überschüssigen Wassers werden die Würmer kurz auf Filterpapier gelegt. ²⁰⁰⁵Nicht wiedergefundene Würmer sind als tot zu erfassen; es wird davon ausgegangen, dass diese Würmer gestorben sind und sich vor der Bewertung zersetzt haben. |
| 38. | ²⁰⁰⁶Wenn der Boden aus den Behältern genommen wurde, wird er nun (ohne die adulten Würmer, aber gegebenenfalls mit gebildeten Kokons) in die Behälter zurückgegeben. ²⁰⁰⁷Anschließend wird der Boden weitere vier Wochen unter den genannten Prüfbedingungen inkubiert; gefüttert wird allerdings nur noch einmal zu Beginn dieser Testphase (siehe Nummer 33). |
| 39. | ²⁰⁰⁸Nach Ablauf der zweiten 4-wöchigen Phase werden die Anzahl der aus den in dem Boden befindlichen Kokons geschlüpften juvenilen Tiere und die Anzahl der Kokons mit den in Anlage 5 beschriebenen Verfahren ermittelt. ²⁰⁰⁹Außerdem sind sämtliche Anzeichen von Beschädigungen oder Verletzungen der Würmer während der Testphase zu erfassen. |
Limit-Test | 40. | ²⁰¹⁰Wenn im Vorversuch bei der höchsten Konzentration (1 000 mg/kg) keine Wirkungen festzustellen sind, wird der Reproduktionstest als Limit-Test mit der Testkonzentration 1 000 mg/kg durchgeführt. ²⁰¹¹Mit einem Limit-Test kann unter Minimierung der im Versuch zu verwendenden Würmer nachgewiesen werden, dass die NOEC für die Reproduktionsleistung größer ist als die Limit-Konzentration. ²⁰¹²Sowohl für den behandelten Boden als auch für die Kontrollen sind jeweils acht Replikate zu verwenden. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 41. | Anlage 6 enthält zwar eine Übersicht, doch bei dieser Prüfmethode ist keine statistische Vorgehensweise für die Analyse der Prüfergebnisse vorgeschrieben. |
| 42. | ²⁰¹⁴Ein Endpunkt ist die Mortalität. ²⁰¹⁵Änderungen im Verhalten der adulten Tiere (die Würmer können sich nicht mehr in den Boden eingraben, sie liegen reglos an der Glaswand des Prüfgefäßes usw.) sowie morphologische Änderungen (z. B. offene Wunden) sind jedoch ebenso zu protokollieren wie das Vorhandensein juveniler Würmer. Der LC50-Wert wird normalerweise mit Probit-Analysen (18) oder durch logistische Regressionsanalysen bestimmt. ²⁰¹⁶Wenn diese Analysemethode jedoch ungeeignet ist (z. B. wenn weniger als drei Konzentrationen verfügbar sind, bei denen Tiere gestorben sind), können auch alternative Methoden verwendet werden. In Betracht kommen etwa gleitende Durchschnitte (19), die Trimmed-Spearman-Karber-Methode (20) oder eine einfache Interpolation (z. B. geometrischer Mittelwert von LC0 und LC100, berechnet als Quadratwurzel von LC0 multipliziert mit LC100). |
| 43. | ²⁰¹⁷Der andere Endpunkt ist die Vermehrungsrate (d. h. die Anzahl der entstandenen juvenilen Tiere). ²⁰¹⁸Ebenso wie im Vorversuch sind jedoch im Abschlussbericht auch alle sonstigen Anzeichen für schädliche Wirkungen zu erfassen. Für die statistische Analyse müssen für jede Testkonzentration und für jede Kontrolle im Reproduktionstest das arithmetische Mittel  und die Standardabweichung berechnet werden. |
| 44. | ²⁰¹⁹Wenn eine Varianzanalyse vorgenommen wurde, können die Standardabweichung, s, und die Freiheitsgrade, df, durch die nach der ANOVA geschätzte gepoolte Varianz und durch die entsprechenden Freiheitsgrade ersetzt werden (wenn die Varianz nicht von der Konzentration abhängig ist). ²⁰²⁰In diesem Fall sind die einzelnen Varianzen der Kontrollen und der Gefäße mit den Testkonzentrationen zu verwenden. ²⁰²¹In der Regel werden die betreffenden Werte mit kommerzieller Statistik-Software berechnet, wobei die Ergebnisse der einzelnen Gefäße als Replikate angenommen werden. ²⁰²²Wenn die Zusammenfassung von Daten der negativen Kontrollen und der Lösungsmittelkontrollen sinnvoller erscheint als die Prüfung mit einer einzelnen Kontrolle, werden die Kontrollen getestet, um sicherzustellen, dass sich die Ergebnisse nicht signifikant unterscheiden (entsprechende Tests siehe Nummer 47 und Anlage 6). |
| 45. | Ob weitere statistische Tests vorzunehmen und statistische Rückschlüsse zu ziehen sind, hängt davon ab, ob bei den Replikaten eine Normalverteilung und eine homogene Varianz der Werte gegeben sind. |
NOEC-Schätzung | 46. | ²⁰²⁴Vorzugsweise sollten leistungsfähige Tests durchgeführt werden. ²⁰²⁵Dabei könnten Informationen (z. B. frühere Erfahrungen mit Ringtests oder sonstige historische Daten) herangezogen werden, um zu beurteilen, ob die Daten in etwa normal verteilt sind. ²⁰²⁶Entscheidender ist die Varianzhomogenität (Homoskedastizität). ²⁰²⁷Erfahrungsgemäß steigt die Varianz häufig mit zunehmendem Mittelwert. ²⁰²⁸In diesem Fall könnte eine Datenumwandlung eine Homoskedastizität zur Folge haben. ²⁰²⁹Eine entsprechende Umwandlung sollte aber eher auf Erfahrungen mit historischen Daten als auf den Daten der aktuellen Untersuchung beruhen. ²⁰³⁰Bei homogenen Daten sind multiple t-Tests (z. B. ein Williams-Test (α = 0,05, einseitig) (21)(22) oder in bestimmten Fällen auch ein Dunnett-Test (23)(24)) durchzuführen. ²⁰³¹Bei uneinheitlichen Replikaten müssen die t-Werte in der Tabelle korrigiert werden, wie von Dunnett und Williams empfohlen. ²⁰³²Bei einer starken Variation steigen/sinken die Ergebnisse nicht regelmäßig. ²⁰³³Bei derart starken Monotonieabweichungen ist der Dunnett-Test besser geeignet. ²⁰³⁴Bei Abweichungen von der Homoskedastizität kann es angebracht sein, mögliche Wirkungen in Bezug auf Varianzen näher zu untersuchen, um dann zu entscheiden, ob die t-Tests durchgeführt werden können, ohne zu viel an Aussagekraft einzubüßen (25). ²⁰³⁵Alternativ kann ein multipler U-Test (z. B. der Bonferroni-U-Test nach Holm (26)) oder — wenn bei diesen Daten zwar eine Homoskedaszität festzustellen ist, die Daten ansonsten aber mit der zugrunde liegenden monotonen Dosis-Wirkungs-Kurve übereinstimmen — ein weiterer nicht parametrischer Test (z. B. Jonckheere-Terpstra (27) (28) oder Shirley (29) (30)) vorgenommen werden; dies wäre im Allgemeinen sinnvoller als t-Tests für ungleiche Varianzen (siehe auch Flussdiagramm in Anlage 6). |
| 47. | Wenn ein Limit-Test durchgeführt wurde und die Voraussetzungen für parametrische Prüfverfahren (Normalität, Homogenität) erfüllt sind, kann der paarige Student-t-Test verwendet werden; ansonsten ist der U-Test nach Mann und Whitney durchzuführen (31). |
ECx-Schätzung | 48. | ²⁰³⁷Zur Berechnung eines ECx-Werts wird eine Regressionsanalyse (linear oder nicht linear) mit den Mittelwerten aus der Vorbehandlung vorgenommen, nachdem eine geeignete Dosis-Wirkungs-Beziehung ermittelt wurde. Für das Wachstum der Würmer als kontinuierliche Reaktion können ECx--Werte aufgrund einer geeigneten Regressionsanalyse geschätzt werden (32). ²⁰³⁸Geeignete Funktionen für quantale Daten (Mortalität/Überleben und Anzahl der Nachkommen) sind die normale sigmoide Funktion, die Logit-Funktion oder die Weibull-Funktion mit zwei bis vier Parametern, die teilweise auch hormetische Effekte abbilden können. Wenn eine Dosis-Wirkungs-Funktion mithilfe einer linearen Regressionsanalyse angepasst wurde, müssten in der Regressionsanalyse ein signifikanter r2-Wert (Bestimmungskoeffizient) und/oder eine Steigung festzustellen sein; anschließend wird der ECx-Wert abgeschätzt, indem in die nach der Regressionsanalyse erstellte Gleichung ein Wert entsprechend x % des Mittelwerts der Kontrollgruppe eingesetzt wird. ²⁰³⁹95- %-Konfidenzintervalle werden nach Fieller (zitiert in Finney (18)) oder mit sonstigen modernen geeigneten Methoden berechnet. |
| 49. | ²⁰⁴⁰Alternativ wird die Reaktion als Anteil oder Prozentanteil eines Modellparameters nachgebildet, der dann als mittlere Reaktion der Kontrollgruppe angenommen wird. ²⁰⁴¹In diesen Fällen kann die normale (Logit, Weibull) Sigmakurve durch eine Probit-Regression häufig leicht an die Ergebnisse angepasst werden (18). ²⁰⁴²In diesen Fällen ist die Gewichtungsfunktion entsprechend den metrischen Antworten anzupassen, wie bei Christensen (33) beschrieben. ²⁰⁴³Wenn allerdings eine Hormesis festgestellt wurde, ist die Probit-Analyse durch eine 4-Parameter-Funktion (Logit oder Weibull) zu ersetzen, die mit einem nicht linearen Regressionsverfahren angepasst wird (34). Kann keine geeignete Dosis-Wirkungs-Funktion an die Daten angepasst werden, können alternative Methoden zur Abschätzung von ECx und der entsprechenden Konfidenzintervalle verwendet werden (beispielsweise gleitende Durchschnitte nach Thompson (19) und das Trimmed-Spearman-Karber-Verfahren (20)). |
PRÜFBERICHT | 50. | Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten: | Prüfchemikalie:- —
- eine genaue Beschreibung der Prüfchemikalie (Charge, Los, CAS-Nummer und Reinheit);
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- Merkmale der Prüfchemikalie (z. B. log Kow, Wasserlöslichkeit, Dampfdruck, Henry-Konstante (H) und Angaben zu Verbleib und Verhalten).
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| Testorganismen:- —
- eingesetzte Testtiere: Art, wissenschaftlicher Name, Bezugsquelle und Zuchtbedingungen;
- —
- Alter, Größenbereich (Masse) der Testorganismen.
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| Prüfbedingungen- —
- Angaben zur Herstellung des Prüfbodens;
- —
- maximale Wasserhaltekapazität des Bodens;
- —
- Beschreibung des Verfahrens zur Einbringung der Prüfchemikalie in den Boden;
- —
- nähere Angaben zu chemischen Hilfsstoffen, die zur Applikation der Prüfchemikalie verwendet wurden;
- —
- (gegebenenfalls) Angaben zur Kalibrierung der Sprühvorrichtung;
- —
- Beschreibung des Versuchsaufbaus und des Prüfverfahrens;
- —
- Größe der Prüfbehälter und Volumen des Prüfsubstrats;
- —
- Prüfbedingungen: Lichtintensität, Dauer der Licht-Dunkel-Zyklen, Temperatur;
- —
- Beschreibung der Fütterung; Typ und Menge des im Versuch verwendeten Futters; Zeitpunkte der Fütterung;
- —
- pH-Wert und Wassergehalt des Bodens zu Beginn und am Ende des Versuchs.
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| Prüfergebnisse:- —
- Mortalität der adulten Tiere ( %) in jedem Prüfbehälter nach den ersten vier Wochen des Versuchs;
- —
- Gesamtmasse der adulten Würmer in den einzelnen Prüfbehältern zu Beginn des Versuchs;
- —
- Gewichtsveränderungen der lebenden adulten Würmer ( % des Ausgangsgewichts) in den einzelnen Prüfbehältern nach den ersten vier Wochen des Versuchs;
- —
- Anzahl der in den einzelnen Prüfbehältern entstandenen juvenilen Tiere am Ende des Versuchs;
- —
- Beschreibung deutlicher oder pathologischer Symptome oder ausgeprägter Verhaltensänderungen;
- —
- Ergebnisse mit der Referenzchemikalie;
- —
- der LC50-Wert, die NOEC und/oder der ECx-Wert (z. B. EC50 oder EC10) für die Reproduktionsleistung, gegebenenfalls mit Konfidenzintervallen, und eine Grafik des angepassten Modells für die Berechnung sowie sämtliche Informationen und Feststellungen, die für die Interpretation der Ergebnisse hilfreich sein könnten;
- —
- grafische Darstellung der Dosis-Wirkungs-Beziehung;
- —
- Ergebnisse der einzelnen Prüfbehälter;
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Abweichungen von den für diese Prüfmethode beschriebenen Verfahren und außergewöhnliche Vorkommnisse während der Prüfung. |
LITERATUR | (1) | Jaenicke, J. (1982). ‚Eisenia fetida‘ is two biological species. Megadrilogica 4, 6-8. |
| (2) | Oien, N. und J. ²⁰⁵⁰Stenerson (1984). ²⁰⁵¹Esterases of earthworm — III. Electrophoresis reveals that Eisenia fetida (Savigny) is two species. Comp. Biochem. Physiol. ²⁰⁵²78c (2), 277 — 282. |
| (3) | Kula, C. (1996). ²⁰⁵³Development of a test method on sublethal effects of pesticides on the earthworm species Eisenia fetida/Eisenia andrei — comparison of two ringtests. In: Riepert, F., Kula, C. ²⁰⁵⁵(1996): Development of laboratory methods for testing effects of chemicals and pesticides on collembola and earthworms. Mitt. Biol. ²⁰⁵⁶Bundesamt. f. Land- Forstwirtsch. ²⁰⁵⁷Berlin-Dahlem, 320, S. 50-82. |
| (4) | Kapitel C.8 dieses Anhangs; Toxizität für Regenwürmer. |
| (5) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1996). Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung von Eisenia fetida/Eisenia andrei, Nr. 11268-2. ISO, Genf. |
| (6) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1993). ²⁰⁶²Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer (Eisenia Fetida) — Teil 1: Verfahren zur Bestimmung der akuten Toxizität unter Verwendung von künstlichem Bodensubstrat, Nr. 11268-1. ²⁰⁶³ISO, Genf. |
| (7) | SETAC (1998). ²⁰⁶⁵Advances in Earthworm Ecotoxicology. ²⁰⁶⁶Sheppard, S.C., Bembridge, J.D., Holmstrup, M. ²⁰⁶⁷und Posthuma, L. (Hrsg.). SETAC Press, 456 S. |
| (8) | EPA (1996). ²⁰⁶⁸Ecological effects test guidelines. ²⁰⁶⁹Earthworm Subchronic Toxicity Test (850.62.00). ²⁰⁷⁰United States Environmental Protection Agency. ²⁰⁷¹Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances. ²⁰⁷²EPA712-C-96-167, April 1996. |
| (9) | Bouché, M.B. (1972). Lombriciens de France, Ecologie et systématique.Institut National de la Recherche Agronomique. |
| (10) | Edwards, C.A. (1983). ²⁰⁷⁶Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms. ²⁰⁷⁷Report EUR 8714 EN, Kommission der Europäischen Gemeinschaften. |
| (11) | Greig-Smith, P.W., Becker, H., Edwards, P.J. und Heimbach, F. ²⁰⁷⁹(Hrsg.) (1992). ²⁰⁸⁰Ecotoxicology of Earthworms. ²⁰⁸¹Intercept. |
| (12) | Edwards, C.A. und Bohlen, J. P. (1996). ²⁰⁸³Biology and ecology of Earthworms, Dritte Ausgabe. ²⁰⁸⁴Chapman and Hall, London. |
| (13) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1994). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung des pH-Wertes, Nr. 10390. ISO, Genf. |
| (14) | Hund-Rinke, K, Römbke, J., Riepert, F. ²⁰⁸⁸und Achazi, R. ²⁰⁸⁹(2000): Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. ²⁰⁹⁰In: Toxikologische Beurteilung von Böden. ²⁰⁹¹Heiden, S., Erb, R., Dott, W. ²⁰⁹²und Eisentraeger, A. (Hrsg.). ²⁰⁹³Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. |
| (15) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1992). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung des Wasserrückhaltevermögens — Laborverfahren, Nr. 11274. ISO, Genf. |
| (16) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1993). Bodenbeschaffenheit; Bestimmung des Trockenrückstandes und des Wassergehaltes auf Grundlage der Masse; Gravimetrisches Verfahren, Nr. 11465. ISO, Genf. |
| (17) | Römbke, J. ²⁰⁹⁹und Moser, Th. (1999). ²¹⁰⁰Organisation and Performance of an International Ringtest for the validation of the Enchytraeid Reproduction Test. ²¹⁰¹UBA-Texte 4/99, S. 150+ 223. |
| (18) | Finney, D.J. (1971). ²¹⁰³Probit Analysis (Dritte Ausgabe), S. 19-76. ²¹⁰⁴Cambridge Univ. Press. |
| (19) | Finney, D.J. (1978). ²¹⁰⁶Statistical Method in Biological Assay. ²¹⁰⁷— Charles Griffin & Company Ltd, London. |
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Anlage 1Begriffsbestimmungen
Für diese Prüfmethode gelten folgende Definitionen:
Chemikalie: ein Stoff oder ein Gemisch.
ECx (Konzentration mit einer Wirkung von x %): Konzentration, bei der es innerhalb einer gegebenen Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle zu einer x %- Wirkung auf die Testorganismen kommt; EC50 beispielsweise ist die Konzentration, bei der bei 50 % einer exponierten Population während einer bestimmten Expositionsdauer von einer Wirkung auf einen Endpunkt der Prüfung ausgegangen wird. Bei diesem Test werden die Wirkungskonzentrationen als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens oder als Masse der Prüfchemikalie pro Flächeneinheit des Bodens ausgedrückt.
LC0 (Konzentration ohne letale Wirkung): die Konzentration einer Prüfchemikalie, bei der Testorganismen innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer nicht getötet werden; bei diesem Test wird LC0 als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.
LC50 (mittlere letale Konzentration): die Konzentration einer Prüfchemikalie, bei der Testorganismen innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer zu 50 % getötet werden; bei diesem Test wird LC50 als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens oder als Masse der Prüfchemikalie pro Flächeneinheit des Bodens ausgedrückt.
LC100 (absolut tödliche Konzentration): die Konzentration einer Prüfchemikalie, bei der Testorganismen innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer zu 100 % getötet werden; bei diesem Test wird LC100 als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.
LOEC: die niedrigste Konzentration der Prüfchemikalie mit statistisch signifikanter Wirkung (p < 0,05); in diesem Test wird die LOEC als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens oder als Masse der Prüfchemikalie pro Flächeneinheit des Bodens ausgedrückt. ²¹⁶⁰Bei allen Testkonzentrationen oberhalb der LOEC müsste normalerweise eine Wirkung auftreten, die sich statistisch von der jeweiligen Kontrolle unterscheidet. ²¹⁶¹Jegliche Abweichungen von diesen Vorgaben sind im Prüfbericht zu begründen.
NOEC: die höchste messbare Konzentration der Prüfchemikalie (unmittelbar unterhalb der LOEC) ohne statistisch signifikante Wirkung; bei diesem Test hat die der NOEC entsprechende Konzentration innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle keine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05).
Prüfchemikalie: jeder Stoff oder jedes Gemisch, der bzw. das mit dieser Methode geprüft wird.
Reproduktionsrate: durchschnittliche Anzahl der juvenilen Würmer, die im Testzeitraum aus einer bestimmten Anzahl an adulten Tieren hervorgegangen sind.
Anlage 2
Bestimmung der maximalen Wasserhaltekapazität des künstlichen Bodens
Die folgende Methode hat sich zur Bestimmung der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens bewährt. Eine nähere Beschreibung ist ISO DIS 11268-2 (1) Anhang C zu entnehmen.
²¹⁶⁷Mit einer geeigneten Vorrichtung zur Probenahme (Stechzylinder etc.) eine bestimmte Menge (z. B. 5 g) des Prüfbodens entnehmen. ²¹⁶⁸Den Zylinder auf der Unterseite mit Filterpapier abdecken, anschließend mit Wasser füllen und auf einem Gestell in ein Wasserbad setzen. ²¹⁶⁹Den Zylinder allmählich eintauchen, bis der Boden durch das Wasser bedeckt ist, und etwa drei Stunden im Wasser belassen. ²¹⁷⁰Da nicht alles durch die Bodenkapillare aufgenommene Wasser im Substrat gehalten werden kann, den Zylinder mit der Bodenprobe zur Entwässerung für zwei Stunden in einem geschlossenen Gefäß (um eine Austrocknung zu verhindern) auf sehr feuchten, fein gemahlenen Quarzsand stellen. ²¹⁷¹Anschließend die Probe wiegen und bei 105 °C bis zur Massekonstanz trocknen. Die Wasserhaltekapazität (Water Holding Capacity, WHC) kann dann wie folgt berechnet werden:
Dabei sind:
| S | = | das wassergesättigte Substrat + Masse des Zylinders + Masse des Filterpapiers | | T | = | Tara (Masse des Zylinders + Masse des Filterpapiers) | | D | = | Trockenmasse des Substrats |
LITERATUR: | (1) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1996). Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer — Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung von Eisenia fetida/Eisenia andrei, Nr. 11268-2. ISO, Genf. |
Anlage 3Bestimmung des pH-Wertes von Böden
Die folgende Methode zur Bestimmung des pH-Wertes von Böden beruht auf der Beschreibung in ISO DIS 10390: Bodenbeschaffenheit; Bestimmung des pH-Wertes (1).
²¹⁷⁴Eine gegebene Menge Boden mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur trocknen. Eine Suspension aus (mindestens 5 g) Boden in einer 1-M-Lösung analysenreines Kaliumchlorid (KCl) oder einer 0,01-M-Lösung analysenreines Calciumchlorid (CaCl2) im Verhältnis 1:5 herstellen. ²¹⁷⁵Anschließend die Suspension fünf Minuten kräftig schütteln und dann mindestens 2, aber nicht länger als 24 Stunden ruhen lassen. ²¹⁷⁶Der pH-Wert der flüssigen Phase wird mit einem pH-Messgerät gemessen, das vor jeder Messung mit einer geeigneten Reihe an Pufferlösungen (z. B. pH 4,0 und 7,0) kalibriert wurde.
LITERATUR:
| (1) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1994). Bodenbeschaffenheit; Bestimmung des pH-Wertes, Nr. 10390. ISO, Genf. |
Anlage 4Anzucht von Eisenia fetida /Eisenia andrei
Die Anzucht sollte vorzugsweise in einer Klimakammer bei einer Temperatur von 20 °C ± 2 °C erfolgen. Bei dieser Temperatur und mit hinreichend Futter sind die Würmer nach 2 bis 3 Monaten geschlechtsreif.
²¹⁸¹Beide Arten können in vielfältigen tierischen Exkrementen angezogen werden. ²¹⁸²Als Anzuchtmedium wird eine Mischung aus Pferde- oder Rinderdung und Torf im Verhältnis 50:50 empfohlen. ²¹⁸³Es muss sichergestellt werden, dass die Rinder oder Pferde, von denen der Dung stammt, nicht mit Arzneimitteln oder Chemikalien wie z. B. wachstumsfördernden Mitteln, Nematiziden oder sonstigen veterinärmedizinischen Produkten behandelt wurden, die die Entwicklung der Würmer während des Versuchs beeinträchtigen könnten. ²¹⁸⁴Nach Möglichkeit sollte selbstgesammelter Dung ‚organischer‘ Herkunft verwendet werden, da sich gezeigt hat, dass im Handel als Gartendünger angebotener Dung nachteilige Wirkungen auf die Würmer haben kann. ²¹⁸⁵Das Medium sollte einen pH-Wert von etwa 6 bis7 (eingestellt mit Calciumcarbonat) sowie eine niedrige Ionenleitfähigkeit (weniger als 6 mS/cm oder 0,5 % Salzkonzentration) haben und nicht übermäßig mit Ammonium oder tierischem Urin verunreinigt sein. ²¹⁸⁶Das Substrat sollte feucht, jedoch nicht zu nass sein. ²¹⁸⁷Zur Anzucht eignen sich Kästen mit einem Fassungsvermögen von 10 bis 50 l.
²¹⁸⁸Zur Gewinnung von Würmern gleichen Alters und gleicher Größe (Masse) ist es am besten, die Kultur mit Kokons zu beginnen. ²¹⁸⁹Sobald die Kultur etabliert ist, werden zur Aufrechterhaltung der Kultur adulte Würmer zur weiteren Kokonablage für 14 bis 28 Tage in einen Anzuchtkasten mit frischem Substrat gesetzt. ²¹⁹⁰Danach werden die adulten Würmer herausgenommen; die aus den Kokons geschlüpften juvenilen Tiere werden als Grundstamm für die nächste Kultur verwendet. ²¹⁹¹Die Würmer werden kontinuierlich mit tierischen Exkrementen gefüttert und von Zeit zu Zeit in frisches Substrat umgesetzt. ²¹⁹²Erfahrungsgemäß sind luftgetrockneter und fein gemahlener Rinder- und Pferdedung sowie Haferflocken als Futter geeignet. ²¹⁹³Es ist sicherzustellen, dass die Rinder oder Pferde, von denen der Dung stammt, nicht mit Chemikalien wie z. B. wachstumsfördernden Mitteln behandelt wurden, die in der Langzeitkultur nachteilige Wirkungen auf die Würmer haben könnten. ²¹⁹⁴Die aus den Kokons geschlüpften Würmer werden für den Versuch verwendet, wenn sie ein Alter von 2 bis 12 Monaten erreicht haben und als adult gelten.
²¹⁹⁵Die Würmer können als gesund betrachtet werden, wenn sie sich durch das Substrat bewegen, nicht versuchen, das Substrat zu verlassen und sich regelmäßig vermehren. ²¹⁹⁶Das Substrat ist dann erschöpft, wenn die Würmer sich sehr langsam bewegen und das hintere Ende gelblich aussieht. ²¹⁹⁷In diesem Fall sollte frisches Substrat bereitgestellt und/oder die Besatzdichte verringert werden.
Anlage 5
Verfahren zum Zählen der aus den Kokons geschlüpften juvenilen Würmer
Da die Handverlesung von Würmern aus dem Bodensubstrat sehr zeitaufwendig ist, werden zwei alternative Methoden empfohlen:
| (a) | Die Prüfbehälter werden in ein Wasserbad mit einer Temperatur von anfänglich 40 °C gesetzt, die danach auf 60 °C erhöht wird. Nach etwa 20 Minuten müssten die juvenilen Würmer an die Bodenoberfläche kommen; von dort können sie leicht abgelesen und gezählt werden. |
| (b) | Der Testboden kann nach der von van Gestel u. a. entwickelten Methode (1) durch ein Sieb gespült werden, sofern der Torf, der Dung oder das Haferflockenmehl, der bzw. das dem Boden hinzugegeben wurde, fein gemahlen wurden. ²²⁰¹Zwei Siebe mit einer Maschenweite von 0,5 mm (Durchmesser 30 cm) werden aufeinander gesetzt. ²²⁰²Der Inhalt eines Prüfbehälters wird mit einem kräftigen Leitungswasserstrahl durch die Siebe gespült, wobei die juvenilen Würmer und die Kokons hauptsächlich auf dem oberen Sieb verbleiben. ²²⁰³Die gesamte Oberfläche des oberen Siebs ist während des Siebvorgangs feucht zu halten, damit die juvenilen Würmer auf einem Wasserfilm schwimmen und nicht durch die Maschen des Siebs kriechen. ²²⁰⁴Am besten wird dazu ein Brauseaufsatz verwendet. |
²²⁰⁵Nachdem das gesamte Bodensubstrat durch das Sieb gespült wurde, können die juvenilen Tiere und die Kokons vom oberen Sieb in eine Schale gespült werden. ²²⁰⁶Der Inhalt der Schale wird stehen gelassen, damit leere Kokons zur Wasseroberfläche steigen und volle Kokons und juvenile Würmer auf den Boden sinken können. ²²⁰⁷Danach kann das überstehende Wasser abgegossen werden, und die juvenilen Würmer und die Kokons können in eine Petrischale mit etwas Wasser gesetzt werden. ²²⁰⁸Zur Auszählung können die Würmer mit einer Nadel oder einer Pinzette entnommen werden.Erfahrungsgemäß ist Methode (a) besser für die Entnahme juveniler Würmer geeignet, die sogar durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm gespült werden können.
²²¹⁰Grundsätzlich ist zu ermitteln, welche Methode für die Entnahme der Würmer (sowie ggf. ²²¹¹der Kokons) aus dem Bodensubstrat geeignet ist. ²²¹²Wenn juvenile Tiere von Hand abgesammelt werden, sollte der Vorgang bei allen Proben zweimal durchgeführt werden.
LITERATUR:
| (1) | Van Gestel, C.A.M., W.A. van Dis, E.M. van Breemen, P.M. Sparenburg (1988). ²²¹⁴Comparison of two methods determining the viability of cocoons produced in earthworm toxicity experiments. ²²¹⁵Pedobiologia 32:367-371. |
Anlage 6Übersicht über die statistische Auswertung der Daten (NOEC-Bestimmung)
 C.34. BESTIMMUNG DER HEMMUNG ANAEROBER BAKTERIEN — REDUKTION DER GASPRODUKTION VON ANAEROBEM FAULSCHLAMMEINLEITUNG
| 1. | ²²¹⁶Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 224 (2007). ²²¹⁷In Gewässer eingeleitete Chemikalien passieren sowohl aerobe als auch anaerobe Zonen, in denen sie abgebaut werden und/oder die Aktivität von Bakterien hemmen können; in bestimmten Fällen können sie über Jahrzehnte oder noch länger unverändert in anaeroben Zonen verbleiben. ²²¹⁸Bei der Abwasserbehandlung ist die erste Stufe (Vorklärung) im Überstandswasser aerob und im abgesetzten Schlamm anaerob. ²²¹⁹Es folgt die zweite Stufe mit einer aeroben Zone im Belebtschlamm-Belüftungsbecken und einer anaeroben Zone im nachfolgenden Absetzbecken (Nachklärung). ²²²⁰Schlamm aus beiden Stufen wird in der Regel einer anaeroben Behandlung unterzogen; dabei entstehen Methan und Kohlenstoffdioxid, die gewöhnlich zur Stromerzeugung genutzt werden. ²²²¹In der natürlichen Umwelt verbleiben Chemikalien, die sich in Sedimenten in Buchten, Ästuarien und im Meer ablagern, wahrscheinlich auf unbestimmte Zeit in diesen anaeroben Zonen, wenn sie nicht biologisch abbaubar sind. ²²²²Große Anteile dieser Chemikalien gelangen hauptsächlich aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften (z. B. schlechte Wasserlöslichkeit, starke Adsorption an suspendierte Feststoffe und keine biologische Abbaubarkeit unter aeroben Bedingungen) in diese Zonen. |
| 2. | ²²²³In die Umwelt eingeleitete Chemikalien sollten zwar sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen abbaubar sein, doch ist es wichtig, dass in beiden Zonen die mikrobielle Aktivität durch diese Chemikalien nicht gehemmt wird. ²²²⁴Im Vereinigten Königreich kam es in einigen Fällen zu einer vollständigen Hemmung der Methanproduktion, beispielsweise verursacht durch Pentachlorphenol in Industrieabwässern; hier mussten die betreffenden Schlämme aus den Faultürmen unter hohem Kostenaufwand an ‚sichere‘ Standorte gebracht und es musste gesunder Faulschlamm aus benachbarten Anlagen importiert werden. ²²²⁵Es gab jedoch viele weniger drastische Fälle der Faulschlammhemmung durch andere Chemikalien, darunter aliphatische Halogenkohlenwasserstoffe (aus der chemischen Reinigung) und Reinigungsmittel), die den Faulungsprozess dennoch erheblich beeinträchtigten. |
| 3. | ²²²⁶Nur eine Prüfmethode (C.11) (1) befasst sich mit der Hemmung der Bakterienaktivität (Atmung von Belebtschlamm) und bewertet die Wirkung von Prüfchemikalien auf die Sauerstoffzehrung bei Vorhandensein von Substrat. ²²²⁷Die Methode wird allgemein angewandt, um die mögliche schädliche Wirkung chemischer Stoffe auf die aerobe Behandlung von Abwässern möglichst frühzeitig zu erkennen und nicht hemmende Konzentrationen der Prüfchemikalien zur Verwendung in verschiedenen Bioabbaubarkeitstests abzuschätzen. ²²²⁸Mit der Prüfmethode C.43 (2) ist es begrenzt möglich, die toxische Wirkung einer Prüfchemikalie auf die Gasproduktion anaeroben Schlamms zu bestimmen, der auf ein Zehntel seiner normalen Feststoffkonzentration verdünnt wurde, um bei der Bewertung des Zersetzungsprozentsatzes die erforderliche Genauigkeit zu gewährleisten. ²²²⁹Da verdünnter Schlamm empfindlicher auf hemmende Chemikalien regieren könnte, entschied sich die zuständige ISO-Gruppe für die Entwicklung einer Methode mit unverdünntem Schlamm. ²²³⁰Mindestens drei Texte wurden geprüft (aus Dänemark, Deutschland und dem Vereinigten Königreich), und schließlich wurden zwei ISO-Normen erarbeitet — eine für unverdünnten Schlamm (ISO 13 641-1) (3) und eine für hundertfach verdünnten Schlamm (ISO 13 641-2) (4), um Schlämme und Sedimente mit geringen Bakterienpopulationen zu repräsentieren. ²²³¹Beide Methoden wurden im Ringtest geprüft (5), wobei Teil 1 als akzeptable Norm bestätigt wurde, bei Teil 2 jedoch Uneinigkeit bestand. ²²³²Das Vereinigte Königreich war der Auffassung, diese Methode müsse weiter untersucht werden, da ein erheblicher Anteil der Teilnehmerlabors von sehr wenig oder keinerlei Gasproduktion berichtete, was zum Teil darauf zurückgeführt wurde, dass der Test aufgrund des zu hohen Gasanteils (75 %) nicht empfindlich genug war. |
| 4. | ²²³³In früheren Arbeiten aus dem Vereinigten Königreich (6)(7) wurde ein manometrisches Verfahren beschrieben, bei dem unverdünnter Faulschlamm (plus roher Klärschlamm als Substrat) in 500-ml-Gefäßen verwendet wurde; die Apparatur war sperrig, und der Rohschlamm ging mit einer erheblichen Geruchsbelästigung einher. ²²³⁴Später wurde die kompaktere und einfacher zu handhabende Apparatur von Shelton und Tiedje (8) (in der von Battersby und Wilson (9) entwickelten Form) von Wilson et al. ²²³⁵(10) erfolgreich angewendet. ²²³⁶Kawahara et al. ²²³⁷(11) gelang im Labor die Herstellung weiterer Standardschlämme, die zur Verwendung in Tests auf anaerobe biologische Abbaubarkeit und die Hemmwirkung bestimmter Chemikalien geeignet sind. ²²³⁸Außerdem wurde der Rohschlamm durch anaerobem Schlamm in hundertfacher Verdünnung bzw. durch Schlämme oder Sedimente bzw. vergleichbare Substrate mit niedriger bakterieller Aktivität als Testsubstrat ersetzt. |
| 5. | ²²³⁹Mit dieser Prüfmethode können Daten generiert werden, die für die Prognostizierung der wahrscheinlichen Wirkung einer Prüfchemikalie auf die Gasproduktion in anaeroben Faultürmen hilfreich sind. ²²⁴⁰Nur Langzeittests, bei denen aktive Faultürme realistischer simuliert werden, können jedoch Aufschluss darüber geben, ob es zu einer Anpassung der Mikroorganismen an die Prüfchemikalie kommen kann oder ob sich Chemikalien, mit hoher Adsorptionsneigung, die an den Schlamm adsorbiert werden, über einen über die Versuchsdauer hinausgehenden Zeitraum zu einer toxischen Konzentration anreichern können. |
PRINZIP DER PRÜFUNG | 6. | ²²⁴¹Aliquoten einer Mischung aus anaerobem Faulschlamm (20-40 g/l Gesamtfeststoffgehalt) und einer abbaubaren Substratlösung einzeln und gleichzeitig in verschiedenen Prüfchemikalienkonzentrationen drei Tage lang in geschlossenen Gefäßen inkubieren. ²²⁴²Die erzeugte Gasmenge (Methan und Kohlenstoffdioxid) anhand des Druckanstiegs (Pa) in den Flaschen messen. ²²⁴³Die prozentuale Hemmung der Gaserzeugung durch die verschiedenen Prüfchemikalienkonzentrationen anhand der in den jeweiligen Prüf- und Kontrollgefäßen erzeugten Mengen berechnen. Den EC50-Wert und andere Wirkkonzentrationen anhand von Kurven der prozentualen Hemmung bezogen auf die verschiedenen Prüfchemikalienkonzentrationen oder (häufiger) ihre Logarithmen berechnen. |
ANGABEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 7. | ²²⁴⁴Prüfchemikalien sollten im Allgemeinen in der reinsten erhältlichen Form verwendet werden; denn Verunreinigungen in bestimmten Chemikalien (z. B. bei Chlorphenolen) können sehr viel toxischer wirken als die Prüfchemikalie als solche. ²²⁴⁵Die Prüfchemikalien sollten jedoch in der Form untersucht werden, in der sie hergestellt/im Handel angeboten werden. ²²⁴⁶Die Verwendung von Formulierungen wird in der Regel nicht empfohlen, kann aber bei schlecht löslichen Prüfchemikalien angemessen sein. ²²⁴⁷Folgende Eigenschaften der Prüfchemikalie sollten bekannt sein: Löslichkeit in Wasser und in einigen organischen Lösungsmitteln, Dampfdruck, Adsorptionskoeffizient, Hydrolyse und biologische Abbaubarkeit unter anaeroben Bedingungen. |
ANWENDUNGSBEREICH DER METHODE | 8. | ²²⁴⁸Der Test kann mit wasserlöslichen, wasserunlöslichen und mit flüchtigen Chemikalien durchgeführt werden. ²²⁴⁹Besondere Vorsicht ist bei Materialien mit geringer Wasserlöslichkeit (siehe Literaturangabe (12)) und von hoher Flüchtigkeit geboten. ²²⁵⁰Es können auch Inokula aus anderen anaeroben Quellen (z. B. Schlämme, wassergesättigte Böden und Sedimente) verwendet werden. ²²⁵¹Anaerobe Bakteriensysteme, die zuvor toxischen Chemikalien ausgesetzt waren, können sich so angepasst haben, dass sie auch unter Einwirkung xenobiotischer Chemikalien noch aktiv sind. ²²⁵²Inokula aus angepassten Bakteriensystemen können eine höhere Toleranz gegenüber Prüfchemikalien aufweisen als Inokula aus nicht angepassten Systemen. |
REFERENZCHEMIKALIEN | 9. | ²²⁵³Zur Verfahrenskontrolle wird eine Referenzchemikalie in parallel zu den normalen Testdurchläufen aufgestellten geeigneten Gefäßen getestet. ²²⁵⁴3,5-Dichlorphenol hat sich als eine Chemikalie erwiesen, die die anaerobe Gaserzeugung sowie die Sauerstoffzehrung des Belebtschlamms und diverse andere biochemische Reaktionen konsistent hemmt. ²²⁵⁵Es konnte außerdem gezeigt werden, dass zwei weitere Chemikalien, Methylen-bis-thiocyanat und Pentachlorphenol, die Methanerzeugung stärker hemmen als 3,5-Dichlorphenol. ²²⁵⁶Die mit diesen Chemikalien erzielten Ergebnisse wurden aber noch nicht validiert. ²²⁵⁷Pentachlorphenol wird nicht empfohlen, weil es in reiner Form schwer zu beschaffen ist. |
REPRODUZIERBARKEIT VON TESTERGEBNISSEN | 10. | In einem internationalen Ringtest (5) konnten die 10 beteiligten Labore EC50-Werte der für 3,5-Dichlorphenol und 2-Bromethansulfonsäure nur hinreichend reproduzieren. (Der Wertebereich für Dichlorphenol lag bei 32-502 mg/l und für Bromethansulfonsäure bei 220-2 190 mg/l.)| Zahl der Teilnehmer-labors | mg/l | mg/g Schlamm | | Mittelwert | Standardabwei-chung | VK (%) | Mittelwert | Standardabwei-chung | VK (%) | | 3,5-Dichlorphenol | | 10 | 153 | 158 | 103 | 5 | 4,6 | 92 | | 2-Bromethansulfonsäure | | 10 | 1 058 | 896 | 85 | 34 | 26 | 76 |
|
EC50-Daten aus dem Ringtest — unverdünnter Schlamm | 11. | ²²⁵⁹Die hohen Variationskoeffizienten zwischen den Labors spiegeln zu einem großen Teil die unterschiedliche Empfindlichkeit der im Schlamm enthaltenen Mikroorganismen wider, die durch eine Präexposition oder eine fehlende Präexposition gegenüber der Prüfchemikalie oder anderen chemisch verwandten Chemikalien verursacht wurde. Die Genauigkeit, mit der der EC50-Wert anhand der Schlammkonzentration bestimmt wurde, war kaum besser als der ‚volumetrische‘ Wert (mg/l). Die Variationskoeffizienten (22, 9 und 18 % für EC50 mg/g) der EC50-Werte für 3,5-Dichlorphenol der drei Labore, die Angaben zur Genauigkeit Ihrer EC50 Werte übermittelten, waren erheblich niedriger als die Mittelwerte aller zehn Labors zusammen. ²²⁶⁰Die Mittelwerte der drei Labors waren jeweils 3,1; 3,2 und 2,8 mg/g. ²²⁶¹Die niedrigeren, annehmbaren Variationskoeffizienten innerhalb der Labors zeigen im Vergleich zu den erheblich höheren Variationskoeffizienten zwischen den Labors (9-22 % gegenüber 92 %) erhebliche Unterschiede bei den Eigenschaften der einzelnen Schlämme. |
BESCHREIBUNG DER METHODEApparatur
| 12. | Benötigt werden die übliche Laborausrüstung sowie die folgenden Geräte und Hilfsmittel:- a)
- Inkubator — funkensicher und auf 35 ± 2 °C geregelt;
- b)
- druckbeständige Prüfgefäße aus Glas in angemessener Nenngröße, jeweils mit gasdicht beschichtetem Septum, belastbar bis zu 2 bar oder 2 × 105 Pa (Beschichtung beispielsweise mit PTFE (Polytetrafluorethen)). Empfohlen werden gläserne Serumflaschen mit einem nominellen Volumen von 125 ml und einem tatsächlichen Volumen von etwa 160 ml mit Durchstichseptum und gebördelten Aluminiumringen; es können aber auch Flaschen mit einem Gesamtinhalt von 0,1-1 l verwendet werden;
- c)
- Präzisionsdruckmessermit Nadelanschluss;Druckmesser, eingestellt für die Messung und Entlüftung des gesamten erzeugten Gases (Methan und Kohlenstoffdioxid); geeignet ist beispielsweise ein tragbarer Präzisionsdruckmesser mit Spritzennadelanschluss; ein gasdichtes 3-Wege-Ventil gestattet zum Ablassen von überschüssigem Druck (Anlage 1). Das Innenvolumen von Schlauch und Ventil des Druckmessgeräts muss möglichst gering sein, damit Fehler wegen Nichtbeachtung des Gerätevolumens nicht ins Gewicht fallen;
- d)
- Isolationsbehälter zum Transportieren des Faulschlamms;
- e)
- 3-Wege-Druckventile;
- f)
- Sieb, 1 mm Quadratmaschen;
- g)
- Behälter zur Aufnahme des Faulschlamms; ein Glas oder eine Flasche aus hochdichtem Polyethylen; Inhalt etwa 5 l, ausgestattet mit Rührer und der Möglichkeit zur Belüftung des Kopfraumes mit Stickstoffgas (siehe Nummer 13);
- h)
- Membranfilter (0,2 μm) zum Sterilisieren des Substrats;
- i)
- Mikrospritzen zum gasdichten Anschluss des Druckmessgeräts (siehe Nummer 12(c)) an den Kopfraum in den Flaschen (siehe Nummer 12(b)); auch für die Zugabe nicht löslicher flüssiger Testmaterialien in die Flaschen;
- j)
- Handschuhkasten (Glovebox), optional, aber empfohlen, mit leichtem Stickstoffüberdruck.
|
Reagenzien | 13. | ²²⁶⁴Für die Prüfung sind ausschließlich Reagenzien in Analysequalität zu verwenden. ²²⁶⁵Es muss grundsätzlich Stickstoffgas hoher Reinheit mit weniger als 5μl/l Sauerstoff verwendet werden. |
Wasser | 14. | ²²⁶⁶Wenn in einer Prüfungsphase eine Verdünnung vorgenommen werden muss, ist entlüftetes entionisiertes Wasser zu verwenden. ²²⁶⁷Eine Analyse dieses Wassers zur Kontrolle ist nicht notwendig; es ist jedoch sicherzustellen, dass die Entionisierungsvorrichtung regelmäßig gewartet wird. ²²⁶⁸Entionisiertes Wasser wird auch für die Herstellung von Stammlösungen verwendet. ²²⁶⁹Vor der Zugabe des anaeroben Inokulums zu einer Lösung oder zu einer Verdünnung des Prüfmaterials ist sicherzustellen, dass die Lösung bzw. die Verdünnung frei von Sauerstoff ist. ²²⁷⁰Dazu wird entweder eine Stunde vor Zugabe des Inokulums Stickstoffgas durch das Verdünnungswasser (bzw. durch die Verdünnungen) geblasen oder das Verdünnungswasser wird in sauerstofffreier Atmosphäre bis zum Siedepunkt erhitzt und anschließend weiterhin unter sauerstofffreier Atmosphäre auf Raumtemperatur abgekühlt. |
Faulschlamm | 15. | ²²⁷¹Aktiven Faulschlamm aus einem Faulbehälter einer Kläranlage (oder aus einem Laborfermenter) entnehmen, in der vorwiegend Schlamm aus häuslichen Abwässern behandelt wird. ²²⁷²Praktische Informationen zu Schlämmen aus Laborfermentern sind anderen Quellen zu entnehmen (11). ²²⁷³Wenn ein adaptiertes Inokulum verwendet werden soll, kann der Faulschlamm auch aus einer Anlage zur Klärung von Industrieabwässern entnommen werden. ²²⁷⁴Zur Entnahme des Schlamms Flaschen mit weitem Hals aus hochdichtem Polyethylen oder ähnlich dehnbarem Material verwenden. ²²⁷⁵Den Schlamm bis zu einer Höhe von etwa 1 cm unter der Oberkante der Flaschen einfüllen; anschließend die Flaschen dicht verschließen, vorzugsweise mit einem Druckventil (Nummer 12(e)), und in isolierte Behälter stellen (Nummer 12(d)), um Temperaturschocks zu minimieren, bis die Flaschen in einen Inkubator mit konstanter Temperatur von 35 ± 2 °C überführt werden. ²²⁷⁶Beim Öffnen der Flaschen darauf achten, dass der überschüssige Gasdruck entweder durch vorsichtiges Lösen des Verschlusses oder über das 3-Wege-Druckventil (Nummer 12(e)) entweichen kann. ²²⁷⁷Den Schlamm möglichst innerhalb weniger Stunden nach der Entnahme verwenden; ist dies nicht möglich, kann er bis zu drei Tage bei 35 ± 2 °C unter Stickstoffatmosphäre im Kopfraum aufbewahrt werden. (In dieser Zeit wird die Aktivität der Mikroorganismen normalerweise nur geringfügig beeinträchtigt.)Achtung! — Faulschlamm erzeugt entzündbare Gase, die einen Brand oder eine Explosion auslösen können. ²²⁷⁸Da der Schlamm außerdem potenziell pathogene Organismen enthält, sind beim Umgang mit Faulschlamm entsprechende Vorsichtsmaßnahmen zu treffen. ²²⁷⁹Aus Sicherheitsgründen dürfen zur Entnahme des Schlamms keine Glasgefäße verwendet werden.
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Inokulum | 16. | ²²⁸⁰Unmittelbar vor der Verwendung den Schlamm vorsichtig umrühren und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm2 (Nummer 12(f)) in eine geeignete Flasche passieren (Nummer 12(g)), deren Kopfraum mit einem Stickstoffstrom begast wird. ²²⁸¹Für die Messung der Konzentration des gesamten Trockenstoffes (siehe z. B. ISO 11 923 (13) bzw. die entsprechende EU-Norm) eine Probe zur Seite stellen. ²²⁸²Im Allgemeinen wird der Schlamm unverdünnt verwendet. ²²⁸³Die Feststoffkonzentration liegt gewöhnlich zwischen 2 und 4 % (w/w). ²²⁸⁴Den pH-Wert des Schlamms prüfen und erforderlichenfalls auf 7 ± 0,5 einstellen. |
Prüfsubstrat | 17. | ²²⁸⁵10 g Nährbouillon (z. B. Oxoid), 10 g Hefeextrakt und 10 g D-Glucose in entionisiertem Wasser lösen und auf 100 ml verdünnen. ²²⁸⁶Die Lösung durch Filtration durch einen 0,2-μm-Membranfilter (Nummer 12(h)) sterilisieren und entweder sofort verwenden oder höchstens einen Tag lang bei 4 °C lagern. |
Prüfchemikalie | 18. | ²²⁸⁷Für jede wasserlösliche Prüfchemikalie eine separate Stammlösung, z. B. mit 10 g/l der Chemikalie in sauerstofffreiem Verdünnungswasser, herstellen (Nummer 14). ²²⁸⁸Von dieser Stammlösung geeignete Mengen für die Herstellung der Testmischungen in abgestuften Konzentrationen verwenden. ²²⁸⁹Alternativ kann von jeder Stammlösung eine Verdünnungsreihe so hergestellt werden, dass die in die Testflaschen hinzuzugebende Menge für alle benötigten Endkonzentrationen gleich ist. ²²⁹⁰Der pH-Wert der Stammlösungen erforderlichenfalls auf 7 ± 0,2 einstellen. |
| 19. | ²²⁹¹Bei Prüfchemikalien, die in Wasser nicht hinreichend löslich sind, nach den Anweisungen in ISO 10 634 (12) bzw. der entsprechenden EU-Norm verfahren. ²²⁹²Wenn ein organisches Lösungsmittel verwendet werden muss, sind Lösungsmittel wie etwa Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff zu vermeiden, da diese die Methanproduktion erfahrungsgemäß deutlich hemmen. ²²⁹³In einem geeigneten flüchtigen Lösungsmittel (z. B. Aceton oder Diethylether) eine Lösung mit einer geeigneten Konzentration einer nicht wasserlöslichen Chemikalie herstellen. ²²⁹⁴In die leeren Testflaschen die benötigten Mengen an in Lösungsmittel gelöster Chemikalie geben (Nummer 12(b)) und das Lösungsmittel vor Zugabe des Faulschlamms verdampfen lassen. ²²⁹⁵Bei anderen Methoden gemäß ISO 10 634 (12) bzw. nach der entsprechenden EU-Norm verfahren; dabei ist allerdings zu berücksichtigen, dass zur Herstellung von Emulsionen verwendete Tenside die anaerobe Gasproduktion hemmen können. ²²⁹⁶Wenn davon ausgegangen wird, dass das Vorhandensein organischer Lösungsmittel und Emulgatoren Artefakte verursachen könnte, kann die Prüfchemikalie auch als Pulver oder Flüssigkeit direkt in das Prüfgemisch gegeben werden. ²²⁹⁷Flüchtige Chemikalien und wasserunlösliche flüssige Prüfchemikalien können mit Mikrospritzen in beimpfte Serumflaschen eingespritzt werden (Nummer 12(i)). |
| 20. | ²²⁹⁸Die Prüfchemikalien werden so in die Flaschen gegeben, dass eine geometrische Konzentrationsreihe entsteht (z. B. 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/l and 15,6 mg/l). ²²⁹⁹Wenn der Toxizitätsbereich nicht von ähnlichen Chemikalien her bekannt ist, sollte zunächst einen Vorversuch mit Konzentrationen von 1 000 mg/l, 100 mg/l und 10 mg/l durchführt werden, um den benötigten Konzentrationsbereich zu ermitteln. |
Referenzchemikalie | 21. | ²³⁰⁰Zur Herstellung einer wässrigen Lösung mit 3,5-Dichlorphenol (10 g/l) schrittweise Natriumhydroxidlösung in einer Mindestmenge von 5 mol/l zu dem Feststoff geben und dabei die Lösung so lange schütteln, bis dieser sich aufgelöst hat. ²³⁰¹Anschließend die Lösung bis zum benötigten Volumen mit sauerstofffreiem Verdünnungswasser (Nummer 14) auffüllen; der Lösungsvorgang kann durch eine Ultraschallbehandlung unterstützt werden. Wenn der mittlere Bereich der EC50-Werte in mindestens drei Tests mit unterschiedlichen Inokula (unterschiedliche Herkunft oder zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen) bestimmt wurde, können auch andere Referenzchemikalien verwendet werden. |
INTERFERENZEN/FEHLER | 22. | ²³⁰²Manche Bestandteile des Schlamms können mit potenziellen Hemmstoffen reagieren, die dann für Mikroorganismen nicht mehr verfügbar sind; die Hemmung wird dadurch entsprechend reduziert oder völlig unterbunden. ²³⁰³Wenn der Schlamm bereits eine hemmende Chemikalie enthält, kann es bei der Prüfung ebenfalls zu falschen Ergebnissen kommen, wenn dieser Stoff getestet wird. ²³⁰⁴Daneben gibt es noch eine Reihe weiterer Faktoren, die Ergebnisse verfälschen können. ²³⁰⁵Diese sind (zusammen mit Methoden zur Vermeidung oder zumindest zur Reduzierung von Fehlern) in Anlage 3 aufgelistet. |
PRÜFVERFAHREN | 23. | ²³⁰⁶Die Zahl der erforderlichen Replikate hängt vom erforderlichen Genauigkeitsgrad der Inhibitionsindizes ab. ²³⁰⁷Sind die Verschlüsse der Flaschen während der gesamten Versuchsdauer gasdicht genug, ist nur eine Charge (mindestens drei Replikate) Testflaschen pro getesteter Konzentration notwendig. ²³⁰⁸Ebenso wird auch für jede Referenzchemikalie und für jede Kontrollreihe nur jeweils eine Charge Flaschen benötigt. ²³⁰⁹Wenn die Verschlüsse der Flaschen jedoch nach ein- oder mehrmaligem Durchstechen nicht mehr dicht sind, muss für jede Zeitspanne (t), für die Ergebnisse ermittelt werden sollen, und für alle zu prüfenden Konzentrationen einer Prüfchemikalie eine Charge Testflaschen (z. B. drei Flaschen) bereitgestellt werden. ²³¹⁰Gleichermaßen sind ‚t‘-Chargen von Flaschen für die Referenzchemikalie und für die Kontrollen vorzubereiten. |
| 24. | ²³¹¹Die Verwendung einer Glove-Box (Nummer 12(j)) wird empfohlen. ²³¹²Mindestens 30 Minuten vor Beginn des Versuchs wird mit der Einleitung eines Stickstoffstroms durch die Glove-Box, die die gesamte erforderliche Ausrüstung enthält, begonnen. ²³¹³Beim Handhaben und Verschließen der Flaschen ist sicherzustellen, dass die Temperatur des Schlamms im Bereich 35 ± 2 °C bleibt. |
Vorversuch | 25. | ²³¹⁴Wenn über die Aktivität des Faulschlamms nichts bekannt ist, sollte ein Vorversuch durchgeführt werden. ²³¹⁵Dazu Kontrollen beispielsweise mit Feststoffkonzentrationen von 10 g/l, 20 g/l und 40 g/l und mit einem Substrat, jedoch ohne die Prüfchemikalie herstellen. ²³¹⁶Zudem verschiedene Mengen an Reaktionsgemisch verwenden, um drei oder vier verschiedene Verhältnisse an Kopfraum- zu Flüssigkeitsvolumen- zu erhalten. Anhand der Gasvolumina, die in den verschiedenen Zeitintervallen erzeugt werden, die optimalen Bedingungen ermitteln, unter denen zweimal täglich signifikante Gasvolumina und eine Druckentlastung pro Tag bei optimaler Empfindlichkeit und ohne Explosionsgefahr gemessen werden können. |
Zugabe der Prüfchemikalien | 26. | ²³¹⁷Wasserlösliche Prüfchemikalien als wässrige Lösungen (Nummer 18) in leere Testflaschen (Nummer 12(b)) geben. ²³¹⁸Jeden Konzentrationsbereich mindestens in dreifacher Ausführung ansetzen (Nummer 20). ²³¹⁹Bei nicht oder schlecht löslichen Prüfchemikalien Lösungen der Prüfchemikalie in organischen Lösungsmitteln mit einer Mikrospritze in leere Flaschen injizieren, um Replikate von jeweils fünf Konzentrationen der Prüfchemikalie herzustellen. ²³²⁰Das Lösungsmittel verdampfen, indem Stickstoffgas über die Oberfläche der Lösungen in die Testflaschen geleitet wird. ²³²¹Alternativ können nicht lösliche feste Chemikalien als abgewogene Feststoffmengen auch direkt in die Testflaschen gegeben werden. |
| 27. | ²³²²Werden wasserunlösliche oder schlecht wasserlösliche flüssige Prüfchemikalien mithilfe eines Lösungsmittels hinzugegeben, so sind sie nach Zugabe des Inokulums und des Prüfsubstrats (siehe Nummer 30) mit einer Mikrospritze direkt in die Testflaschen zu injizieren. ²³²³Flüchtige Prüfchemikalien können auf dieselbe Weise hinzugegeben werden. |
Zugabe von Inokulum und Substrat | 28. | ²³²⁴Eine geeignete Menge gesiebten Faulschlamms (siehe Nummer 16) in einer 5-l-Flasche (Nummer 12(g)) rühren; dabei gleichzeitig den Kopfraum mit Stickstoffgas begasen. ²³²⁵Testflaschen mit wässrigen Lösungen oder mit verdampften Lösungsmittellösungen der Prüfchemikalien etwa zwei Minuten mit gasförmigem Stickstoff spülen, um vorhandene Luft zu entfernen. ²³²⁶Aliquoten (z. B. 100 ml) des gut durchmischten Schlamms mit einer Pipette mit weiter Öffnung oder mit einem Messzylinder in die Testflaschen geben. ²³²⁷Wichtig ist, dass die Pipette in einem einzigen Schritt mit der exakt benötigten Schlammmenge gefüllt wird, da sich die im Schlamm enthaltenen Feststoffe leicht absetzen können. ²³²⁸Wenn eine zu große Menge aufgenommen wird, muss die Pipette entleert und neu befüllt werden. |
| 29. | Anschließend so viel Substratlösung (Nummer 17) hinzugeben, dass sich in dem Gemisch eine Konzentration von jeweils 2 g/l Nährbouillon, Hefeextrakt und D-Glucose ergibt; die Testflaschen dabei kontinuierlich mit gasförmigem Stickstoff spülen. Die Testchargen könnten z. B. so aussehen:Endgültige Massekonzentration der Prüfchemikalie in den Prüfgefäßen(mg/l)
| Volumen der Prüfchemikalie(ml)
| Reagenzien und Medien(ml)
| Stammlösunga)10 g/lNr. 18
| Stammlösungb)1 g/lNr. 18
| VerdünnungswasserNr. 14
| InokulumNr. 16
| SubstratNr. 17
| | 0 | - | 0 | 1,0 | 100 | 2 | | 1 | - | 0,1 | 0,9 | 100 | 2 | | 3,3 | - | 0,33 | 0,67 | 100 | 2 | | 10 | 0,1 | - | 0,9 | 100 | 2 | | 33 | 0,33 | - | 0,67 | 100 | 2 | | 100 | 1,0 | - | 0 | 100 | 2 | Gesamtinhalt der Flasche = 160 ml, Flüssigkeitsvolumen = 103 ml,Gasvolumen = 57 ml oder 35,6 % des Gesamtvolumens.
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| 30. | Gleichermaßen ausreichend leere Testflaschen mit gasförmigem Stickstoff ausspülen, um flüchtige und unlösliche flüssige Prüfchemikalien zu entfernen (siehe Nummer 27). |
Kontrollen und Referenzchemikalie | 31. | ²³³¹Mindestens drei Replikate an Flaschen, die jeweils nur Schlamm und Substrat enthalten, als Kontrollen ansetzen. ²³³²Des Weiteren Replikate an Flaschen mit Schlamm, Substrat und hinreichend Stammlösung der Referenzchemikalie — 3,5-Dichlorphenol (Nummer 21) — mit einer Endkonzentration von 150 mg/l vorbereiten. ²³³³Diese Konzentration sollte die Gasproduktion um etwa 50 % hemmen. ²³³⁴Alternativ kann eine Konzentrationsreihe mit der Referenzchemikalie hergestellt werden. ²³³⁵Zudem vier zusätzliche Flaschen mit Schlamm, sauerstofffreiem Wasser und Substrat für pH-Messungen ansetzen. ²³³⁶In zwei der Flaschen die Prüfchemikalie in der höchsten zu prüfenden Konzentration geben; zu den beiden übrigen Flaschen sauerstofffreies Wasser geben. |
| 32. | ²³³⁷Es ist sicherzustellen, dass alle Flaschen — die Flaschen mit der Prüfchemikalie und die Kontrollen — dasselbe Flüssigkeitsvolumen (VR) enthalten; erforderlichenfalls die Flüssigkeit mit sauerstofffreiem entionisiertem Wasser (Nummer 14) auffüllen. ²³³⁸Der Kopfraum sollte zwischen 10 % und 40 % des Flaschenvolumens ausmachen; der tatsächliche Wert richtet sich nach den Ergebnissen des Vorversuchs. ²³³⁹Nach Zugabe aller Bestandteile in die Flaschen die Nadel, mit der das Gas injiziert wurde, herausziehen, und die Flaschen mit einem Gummistopfen und einer Aluminiumkappe (Nummer 12(b)) verschließen; hierzu den Stopfen mit einem Tropfen entionisiertem Wasser anfeuchten, damit er leichter eingeschoben werden kann. ²³⁴⁰Den Inhalt der einzelnen Flaschen durch Schütteln vermischen. |
Inkubation der Flaschen | 33. | ²³⁴¹Die Flaschen in einen thermostatgeregelten Inkubator stellen, der möglichst mit einer Schüttelvorrichtung ausgestattet sein sollte; die Temperatur auf 35 ± 2 °C einstellen. ²³⁴²Die Flaschen im Dunkeln inkubieren. ²³⁴³Nach etwa einer Stunde den Druck in den Flaschen mit dem Atmosphärendruck abgleichen. ²³⁴⁴Dazu die mit dem Druckmesser (Nummer 12(c)) verbundene Spritzennadel durch die einzelnen Flaschenverschlüsse stechen und das Ventil so lange öffnen, bis der Druckmesser auf Null steht; danach das Ventil wieder schließen. ²³⁴⁵Die Nadel ist im Winkel von etwa 45° einzuführen, damit kein Gas aus den Flaschen austreten kann. ²³⁴⁶Wenn der Inkubator nicht über eine Schüttelvorrichtung verfügt, müssen die Flaschen während der gesamten Inkubationsdauer zweimal täglich manuell geschüttelt werden, um das System zu äquilibrieren. ²³⁴⁷Die Flaschen inkubieren und umdrehen, damit kein Gas durch das Septum austreten kann. ²³⁴⁸Falls nicht lösliche Prüfchemikalien am Boden der Flasche anhaften könnten, sollten die Flaschen nicht umgedreht werden. |
Druckmessung | 34. | ²³⁴⁹Wenn die Flaschen eine Temperatur von 35 ± 2 °C erreicht haben, den pH-Wert des Inhalts von zwei der vier für diesen Zweck angesetzten Flaschen messen und aufzeichnen; den Flascheninhalt anschließend entsorgen. ²³⁵⁰Die restlichen Flaschen weiter im Dunkeln inkubieren. ²³⁵¹Den Druck in den Flaschen in den nächsten 48 bis 72 Stunden zweimal täglich messen; dazu die Nadel des Druckmessers durch den Verschluss der einzelnen Flaschen stechen und die Nadel zwischen den Messungen trocknen. ²³⁵²Während der Messung, die möglichst zügig erfolgen sollte, sollte die Inkubationstemperatur in allen Bereichen der Flaschen aufrechterhalten werden. ²³⁵³Sobald der angezeigte Druck stabil ist, den angezeigten Wert aufzeichnen. ²³⁵⁴Danach das Ventil zur Entlüftung öffnen und wieder schließen, wenn der Druckmesser auf Null steht. ²³⁵⁵Der Versuch wird nach dem Zeitpunkt des ersten Druckausgleichs (‚Zeit 0‘) gewöhnlich für 48 Stunden fortgesetzt. ²³⁵⁶Bei flüchtigen Chemikalien sind nur eine Messung und nur eine Entlüftung (am Ende der Inkubationszeit) bzw. höchstens zwei Messungen und Entlüftungen vorzunehmen, um einen Verlust der Prüfchemikalie zu vermeiden (10). |
| 35. | ²³⁵⁷Bei negativer Druckanzeige darf das Ventil nicht geöffnet werden. ²³⁵⁸Manchmal sammelt sich Feuchtigkeit in der Spritzennadel und in der Schlauchleitung, was durch einen geringen Unterdruck angezeigt wird. ²³⁵⁹In diesen Fall die Nadel herausziehen, den Schlauch schütteln, mit einem Papiertuch trocknen und eine neue Nadel aufsetzen. |
Messung des pH-Werts | 36. | Nach der letzten Druckmessung die pH-Werte der Flascheninhalte lesen und aufzeichnen. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGDarstellung der Ergebnisse
| 37. | ²³⁶¹Für jeden Satz Replikatflaschen Summe und Mittelwert der nach jedem Zeitintervall aufgezeichneten Druckergebnisse und für jedes Replikat nach jedem Zeitintervall den mittleren kumulativen Bruttogasdruck berechnen. ²³⁶²Dazu Kurven der mittleren kumulativen Gasproduktion (Pa) gegen die Zeit für die Kontrollen, die Flaschen mit den Prüfchemikalien und die Referenzflaschen zeichnen. Auf dem linearen Abschnitt der Kurve einen Zeitpunkt (gewöhnlich 48 Stunden) wählen und für jede Konzentration mit der Gleichung [1] dieHemmung (I) in Prozent bestimmen:| I = (1 – Pt/PC) × 100 | [1], |
Dabei sind:| I | = | Hemmung in Prozent ( %); | | Pt | = | der erzeugte Gasdruck in Pascal (Pa) in den Flaschen mit Prüfmaterial zum gewählten Zeitpunkt; | | Pc | = | der erzeugte Gasdruck in Pascal (Pa) in der Kontrolle zum selben Zeitpunkt. |
²³⁶³Nach Möglichkeit sollten zur Bestimmung von I zwei Kurven gezeichnet werden, d. h. eine Kurve bezogen auf die Konzentration und eine bezogen auf den Logarithmus der Konzentration, um die Kurve mit der besseren Linearität wählen zu können. Den EC50-Wert (mg/l) visuell oder durch Regressionsanalyse anhand der Kurve mit der besseren Linearität bestimmen. ²³⁶⁴Zu Vergleichszwecken kann es hilfreich sein, die Konzentration der Chemikalie in mg Chemikalie/g der gesamten Trockenfeststoffe auszudrücken. ²³⁶⁵Um diese Konzentration zu erhalten, die Volumenkonzentration (mg/l) durch die Volumenkonzentration der trockenen Feststoffe des Schlamms (g/l) (Nummer 16) dividieren. |
| 38. | Berechnet wird entweder die durch die Konzentration der Referenzchemikalie bewirkte prozentuale Hemmung (wenn nur eine Konzentration verwendet wurde) oder der EC50-Wert (wenn eine hinreichende Anzahl an Konzentrationen untersucht wurde). |
| 39. | Den mittleren Druck des in der Kontrolle erzeugten Gases Pc(Pa) mit Hilfe der Kalibrierkurve des Druckmessers (Anlage 2) in Volumen umrechnen; aus dem erhaltenen Wert sodann die Gasproduktioninnerhalb von 48 Stunden als für 100 ml unverdünntem Schlamm mit einer Feststoffkonzentration von 2 % (20 g/l) bis 4 % (40 g/l) erzeugtes Volumen berechnen. |
Validitätskriterien | 40. | ²³⁶⁸Die Ergebnisse des ISO-Interlabortests (5) haben gezeigt, dass die Referenzchemikalie (3,5-Dichlorphenol) die Gasproduktion bei Konzentrationen von 32 mg/l bis 510 mg/l (Mittelwert 153 mg/l) um 50 % hemmt (Nummer 10). ²³⁶⁹Diese Konzentrationsspanne ist so breit, dass keine genauen Grenzwerte für die Hemmung als zuverlässige Validitätskriterien festgesetzt werden können; dies sollte jedoch möglich sein, sobald Verfahren für die Herstellung einheitlicherer Inokula entwickelt wurden. ²³⁷⁰Die in Kontrollflaschen innerhalb von 48 Stunden erzeugten Gasvolumina reichten von 21 ml/g bis zu 149 ml/g Schlammfeststoff (Mittelwert 72 ml/g). Ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen dem erzeugten Gasvolumen und dem entsprechenden EC50-Wert bestand nicht. ²³⁷¹Beim Abschluss der Tests lag der pH-Wert zwischen 6,1 und 7,5. |
| 41. | Der Test wird als gültig betrachtet, wenn es in der Referenzkontrolle mit 150 mg/l 3,5-Dichlorphenol zu einer Hemmung von über 20 % kommt, in der Blindkontrolle mehr als 50 ml Gas pro g Trockenmasse produziert werden und der pH-Wert bei Testende im Bereich zwischen 6,2 und 7,5 liegt. |
Prüfbericht | 42. | Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: | Prüfchemikalie- —
- Handelsüblicher Name, chemische Bezeichnung, CAS-Nummer, Strukturformel und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;
- —
- Reinheit (Verunreinigungen) der Prüfchemikalie.
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| Prüfbedingungen- —
- Volumina der flüssigen Bestandteile und des Kopfraums in den Prüfgefäßen;
- —
- Beschreibungen der Prüfgefäße und der Gasmessung (z. B. Druckmessertyp);
- —
- Einbringung der Prüfchemikalie und der Referenzchemikalie in das Testsystem, verwendete Testkonzentrationen und Verwendung von Lösungsmitteln;
- —
- Angaben zum verwendeten Inokulum: Name der Kläranlage, Beschreibung der Herkunft (Bezugsquelle) des behandelten Abwassers (z. B. Betriebstemperatur, Rückhaltezeit des Schlamms, vorwiegend häusliche oder vorwiegend industrielle Abwässer usw.), Konzentration der Feststoffe, Gasproduktion im anaeroben Faulturm, vorherige Exposition oder vielleicht bereits erfolgte Anpassung an toxische Chemikalien, Ort der Entnahme des Schlamms, Sediments usw.;
- —
- Inkubationstemperatur und Temperaturspanne;
- —
- Zahl der Replikate.
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| Ergebnisse- —
- pH-Werte bei Versuchsende;
- —
- alle gemessenen Daten aus den Prüf-, Kontroll- und Referenzgefäßen (z. B. in Pa oder in Millibar) in tabellarischer Form;
- —
- prozentuale Hemmung in den Test- und Referenzflaschen und Darstellung der Hemmungs-Konzentrations-Kurven;
- —
- Berechnung der EC50-Werte, ausgedrückt in mg/l und mg/g;
- —
- Gasproduktion pro g Schlamm innerhalb von 48 Stunden;
- —
- Angabe von Gründen, falls die Prüfergebnisse verworfen werden;
- —
- Diskussion der Ergebnisse einschließlich sämtlicher Abweichungen von den Verfahren im Rahmen dieser Prüfmethode sowie Diskussion aller durch Interferenzen und Fehler bedingten Abweichungen der Testergebnisse von den erwarteten Ergebnissen;
- —
- Angabe, ob in dem Test die Toxizität gegenüber präexponierten oder nicht präexponierten Mikroorganismen gemessen werden sollte.
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LITERATUR | (1) | Kapitel C.11 dieses Anhangs: Belebtschlamm, Prüfung der Atmungshemmung. |
| (2) | Kapitel C.43 dieses Anhangs: Anaerobe biologische Abbaubarkeit organischer Verbindungen in Klärschlamm: durch Messung der Gaserzeugung. |
| (3) | Internationale Organisation für Normung (2003) ISO 13 641-1 Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der Hemmwirkung der Gasproduktion auf anaerobe Bakterien — Teil 1: Allgemeiner Test [EN] |
| (4) | Internationale Organisation für Normung (2003) ISO 13 641-2 Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der Hemmwirkung der Gasproduktion auf anaerobe Bakterien — Teil 2: Untersuchung bei niedrigen Biomassekonzentrationen. [EN] |
| (5) | ISO (2000) Ring test of ISO 13 641-1 and ISO 13 641-2. ²³⁷⁹Determination of inhibition of activity of anaerobic bacteria. ²³⁸⁰BL 6958/A. ²³⁸¹Evans MR, Painter HA. ²³⁸²Brixham Environmental Laboratory, AstraZeneca UK Ltd., Brixham, TQ5 8BA UK. |
| (6) | Swanwick JD, Foulkes M (1971). ²³⁸⁴Inhibition of anaerobic digestion of sewage sludge by chlorinated hydrocarbons. Wat. Pollut. ²³⁸⁵Control, 70, 58-70. |
| (7) | HMSO (1986) Determination of the inhibitory effects of chemicals and waste waters on the anaerobic digestion of sewage sludge. ISBN 0 117519 43 X, In: Methods for the Examination of Waters and Associated Materials UK. |
| (8) | Shelton DR, Tiedje JM (1984). ²³⁸⁹General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Env. ²³⁹⁰Microbiol. ²³⁹¹47 850-857. |
| (9) | Battersby NS., und Wilson, V. (1988). ²³⁹³Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic compounds under methanogenic conditions. ²³⁹⁴Chemosphere 17, 2441-2460. |
| (10) | Wilson V., Painter, HA., und Battersby, NS. (1992). ²³⁹⁶A screening method for assessing the inhibition of the anaerobic gas production from sewage sludge. Proc. Int. Symp. ²³⁹⁷on Ecotoxicology. ²³⁹⁸Ecotoxicological Relevance of Test Methods, GSF Forschungzentrum, Neuherberg, Deutschland (1990). ²³⁹⁹Verlag: Steinberg, C., und Kettrup, A, S. 117-132 (1992). |
| (11) | Kawahara K, Yakabe Y, Chida T, und Kida K (1999). ²⁴⁰¹Evaluation of laboratory-made sludge for an anaerobic biodegradability test and its use for assessment of 13 chemicals. ²⁴⁰²Chemosphere, 39 (12), 2007-2018. |
| (12) | Internationale Organisation für Normung (1995) ISO 10634, Wasserbeschaffenheit — Anleitung für die Vorbereitung und Behandlung von in Wasser schwer löslichen organischen Verbindungen für die nachfolgende Bestimmung ihrer biologischen Abbaubarkeit in einem wässrigen Medium, |
| (13) | Internationale Organisation für Normung (1997) ISO 11 923 Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der Schwebstoffe mittels Filtration durch ein Glasfaserfilter. |
Anlage 1Muster einer Apparatur zur Messung der Biogasproduktion anhand des Gasdrucks
 Legende:| 1 | — | Druckmesser | | 2 | — | Gasdichtes 3-Wege-Ventil | | 3 | — | Spritzennadel | | 4 | — | Gasdichter Verschluss (gebördelte Kappe und Septum) | | 5 | — | Kopfraum | | 6 | — | Faulschlamm-Inokulum |
Prüfgefäße in einem Temperaturumfeld von 35 ± 2 °CAnlage 2
Umrechnung der Druckmesswerte
Die Messwerte des Druckmessers können mithilfe einer Standardkurve zum Gasvolumen in Bezug gesetzt werden. ²⁴⁰⁵Anhand dieser Kurve lässt sich das Volumen des innerhalb von 48 Stunden pro Gramm Trockenschlamm erzeugten Gases berechnen. ²⁴⁰⁶Dieser Aktivitätsindex wird als eines der Kriterien für die Validitätsbewertung der Testergebnisse verwendet. Die Kalibrierkurve wird erstellt, indem bekannte Gasvolumina bei 35 ± 2 °C in Serumflaschen injiziert werden, die mit einer Wassermenge entsprechend dem Volumen des Reaktionsgemischs VR gefüllt sind:
- —
- Auf 35 ± 2 °C temperierte Wasseraliquoten mit einem Volumen von VR ml in fünf Serumflaschen geben. Die Flaschen verschließen und 1 Stunde zum Äquilibrieren in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 35 ± 2 °C stellen;
- —
- den Druckmesser einschalten; nach Stabilisierung der Anzeige das Gerät auf Null stellen;
- —
- die Spritzennadel durch den Verschluss einer der Flaschen stechen und das Ventil öffnen. Wenn der Druckmesser den Wert Null anzeigt, das Ventil wieder schließen;
- —
- dieses Verfahren mit den übrigen Flaschen wiederholen;
- —
- in jede Flasche 1 ml Luft einer Temperatur von 35 ± 2 °C injizieren. ²⁴⁰⁸Die am Druckmesser befestigte Nadel durch den Verschluss einer Flasche stechen und abwarten, bis sich die Druckanzeige stabilisiert hat. ²⁴⁰⁹Nach Aufzeichnung des Druckwertes das Ventil so lange öffnen, bis die Anzeige wieder auf Null steht. Danach das Ventil schließen;
- —
- dieses Verfahren mit den übrigen Flaschen wiederholen;
- —
- anschließend das gesamte Verfahren mit 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml und 50 ml Luft wiederholen;
- —
- die Konversionskurve als Druck (Pa) gegen das injizierte Gasvolumen (ml) zeichnen. Das Messgerät reagiert im Bereich von 0-70 000 Pa und bei einer Gasproduktion von 0-50 ml linear.
Anlage 3Bekannte Faktoren, die Ergebnisse verfälschen können
a) Qualität der Flaschenverschlüsse
Für die Serumflaschen sind im Handel verschiedene Septa erhältlich. ²⁴¹²Viele Septa (u. a. aus Butylkautschuk) sind nicht mehr dicht, wenn sie unter den Bedingungen dieses Versuchs mit einer Nadel durchstochen wurden. ²⁴¹³Manchmal fällt der Druck nach dem Durchstechen sehr langsam ab. ²⁴¹⁴Um Dichtheitsproblemen vorzubeugen, wird die Verwendung gasdichter Septa empfohlen (Nummer 12(b)).
b) Feuchtigkeit in der Spritzennadel
Manchmal sammelt sich Feuchtigkeit in Spritzennadel und Schlauchleitung, was sich durch einen geringen Unterdruck angezeigt wird. Um das Problem zu beheben, die Nadel herausziehen und die Schlauchleitung schütteln, mit Zellstoffpapier abtrocknen und eine neue Nadel aufsetzen (Nummern 12(c) und 35).
c) Verunreinigung durch Sauerstoff
Die Ergebnisse anaerober Methoden können durch Kontamination mit Sauerstoff verfälscht werden, da dies die Gasproduktion beeinträchtigen kann. Bei dieser Methode sollte dieses Risiko durch Anwendung strikt anaerober Verfahren (u. a. unter Verwendung einer Glove-Box) minimiert werden.
d) Grobe Substratpartikel im Schlamm
Die anaerobe Gasproduktion und die Empfindlichkeit des Schlamms werden durch Substrate beeinflusst, die mit dem Inokulum in die Testflaschen gelangen können. ²⁴¹⁹Faulschlamm aus anaeroben Faultürmen zur Behandlung häuslicher Abwässer enthält oft noch erkennbare Partikel (wie Haare und Zelluloserückstände), die die Entnahme repräsentativer Proben erschweren. ²⁴²⁰Durch Sieben des Schlamms können größere nicht lösliche Bestandteile abgetrennt werden; auf diese Weise wird die Repräsentativität der Proben verbessert (Nummer 16).
e) Flüchtige Prüfchemikalien
Flüchtige Prüfchemikalien werden im Kopfraum der Testflaschen freigesetzt. Dadurch können beim Entlüften nach den Druckmessungen geringe Anteile des Prüfmaterials verloren gehen, was zu fehlerhaft hohen EC50-Werte führt. Durch Wahl eines geeigneten Kopfraum-/Flüssigkeitsvolumen-Verhältnisses und durch Verzicht auf die Entlüftung nach den Druckmessungen kann dieser Fehler minimiert werden (10).
f) Nichtlinearität der Gasproduktion
Ist die Kurve der mittleren kumulativen Gasproduktion bezogen auf die Inkubationszeit über den Zeitraum von 48 Stunden nicht mehr oder weniger linear, so kann dies die Genauigkeit der Prüfung beeinträchtigen. Um dies zu vermeiden, empfiehlt es sich unter Umständen, Faulschlamm anderer Herkunft zu verwenden und/oder die Lösung aus Testsubstrat/Nährbouillon, Hefeextrakt und Glucose (Nummer 29) in höherer Konzentration zu verwenden.
Anlage 4
Anwendung auf Umweltproben mit niedriger Biomassekonzentration — Anaerobe Schlämme, Sedimente usw.
EINLEITUNG
A.1 Im Allgemeinen ist die spezifische mikrobielle Aktivität (erzeugtes Gasvolumen pro g trockener Feststoffe) in natürlich vorkommenden anaeroben Schlämmen, Sedimenten, Böden usw. ²⁴²⁷deutlich geringer als bei anaeroben Faulschlämmen aus Abwässern. ²⁴²⁸Wenn die Hemmwirkung von Chemikalien bei diesen weniger aktiven Proben gemessen werden soll, müssen daher einige Versuchsparameter modifiziert werden. Bei diesen weniger aktiven Proben kommen zwei allgemeine Vorgehensweisen in Betracht:
- a)
- Um eine genauere Simulation (siehe ISO 13 641, Teil 1) zu ermöglichen, einen modifizierten Vorversuch (Nummer 25) mit der unverdünnten Probe Schlamm, Boden usw. bei 35 ± 2 °C oder der am Ort der Probenahme vorherrschenden Temperatur durchführen;
- b)
- oder die Prüfung mit einem (im Verhältnis 1:100) verdünnten Faulschlamm durchführen, um die von der Umweltprobe erwartete geringere Aktivität zu simulieren; dabei allerdings die Temperatur von 35 ± 2 °C beibehalten (siehe ISO 13 641, Teil 2).
²⁴³⁰A.2 Option a) kann nach der hier beschriebenen Methode (wie ISO 13 641, Teil 1) durchgeführt werden; entscheidend ist jedoch, dass im Vorversuch (Nummer 25) optimale Bedingungen bestimmt werden (wenn diese nicht bereits aus früheren Versuchen bekannt sind). ²⁴³¹Die Schlamm- oder die Sedimentprobe gründlich mischen (z. B. in einem Mischer) und falls notwendig mit einer kleinen Menge entlüfteten Verdünnungswassers (Nummer 14) so verdünnen, dass sie flüssig genug ist, um von einer Pipette mit großer Öffnung oder von einem Messzylinder aufgenommen zu werden. ²⁴³²Ist davon auszugehen, dass Nährstoffe fehlen könnten, kann die Schlammprobe (unter anaeroben Bedingungen) zentrifugiert und in dem mit dem Hefeextrakt versetzten mineralischen Medium (A.11) neu suspendiert werden.²⁴³³A.3 Option b): Dieses Vorgehen gewährleistet die Simulation von schwach aktiven Umweltproben in ausreichender Art und Weise, allerdings fehlt bei diesen Proben die hohe Konzentration an suspendierten Feststoffen. ²⁴³⁴Die Bedeutung dieser Feststoffe im Hinblick auf die Hemmung ist nicht bekannt, die Reaktion zwischen den Prüfchemikalien und den Schlammbestandteilen sowie die Adsorption der Prüfchemikalien an die Feststoffe könnte jedoch die Toxizität der Prüfchemikalie verringern.
A.4 Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Temperatur: Im Interesse einer genauen Simulation sollten die Tests bei der am Ort der Probenahme vorherrschenden Temperatur durchgeführt werden, da andere Gruppen methanproduzierender Bakteriengemeinschaften bekanntermaßen innerhalb anderer Temperaturbereiche aktiv sind; so z. B. thermophile Bakterien bei ~30-35 °C, mesophile Bakterien bei 20-25 °C und psychrophile Bakterien bei < 20 °C; entsprechend können sich unterschiedliche Verläufe der Hemmungseffekte ergeben.
²⁴³⁶A.5 Dauer: Bei der allgemeinen Prüfung, Teil 1, (mit unverdünntem Schlamm) wurde in den vorgesehenen 2-4 Tagen stets genügend Gas produziert, während die Gasproduktion bei Teil 2 (mit hundertfach verdünntem Schlamm) im Ringtest nicht ausreichend war (soweit überhaupt Gas produziert wurde). ²⁴³⁷Madsen et. al. (1996) erklären in ihrer Beschreibung des letztgenannten Tests, dass mindestens 7 Tage vorgesehen werden sollten.
Test mit niedriger Biomassekonzentration (Option b)
Es sollten folgende Änderungen und Ergänzungen vorgenommen werden, d. h. einige Absätze und Unterabsätze des Haupttexts sind zu ergänzen bzw. zu ersetzen.
A.6 Unter Nummer 6 ist der folgende Absatz anzufügen: Testprinzip:
‚Dieses Verfahren kann mit hundertfach verdünntem anaerobem Schlamm angewendet werden, u. a., um die geringe Aktivität von Schlämmen und Sedimenten zu simulieren. Die Inkubation erfolgt entweder bei 35 °C oder bei der am Probenahmeort vorherrschenden Temperatur. Da die bakterielle Aktivität erheblich geringer ist als bei unverdünntem Faulschlamm, sollte die Inkubationsdauer auf mindestens 7 Tage verlängert werden.‘
A.7 Unter Nummer 12 Buchstabe a ist folgender Satz anzufügen:
‚Der Inkubator sollte auch bei Temperaturen von 15 °C noch betrieben werden können.‘
A.8 Nummer 13 ist um ein weiteres Reagenz zu ergänzen:
‚Phosphorsäure (H3PO4), 85 Masse- % in Wasser.‘
A.9 Am Ende von Nummer 16 ist folgender Satz anzufügen:
‚Für diesen Test ist eine Endkonzentration von 0,20 ± 0,05 g/l Gesamttrockenfeststoff insgesamt zu verwenden.‘
A.10 Nummer 17. Prüfsubstrat
Dieses Substrat darf nicht verwendet werden; es ist durch Hefextrakt zu ersetzen (siehe Nummern 17, A.11, A.12, A.13).
A.11 Zur Verdünnung des anaeroben Schlamms muss ein mineralisches Medium mit Spurenelementen verwendet werden; der Einfachheit halber wird das organische Substrat (Hefeextrakt) diesem Medium hinzugegeben.
Nach Nummer 17 ist folgender Text anzufügen:
| ‚a) | Mineralisches Prüfmedium, mit Hefeextrakt |
Die Herstellung erfolgt aus 10-fach konzentriertem Prüfmedium (Nummer 17 Buchstabe b; A.12) mit einer Lösung aus Spurenelementen (Nummer 17 Buchstabe c, A.13). ²⁴⁴³Dazu ist Natriumsulfid-Nonahydrat (Nummer 17 Buchstabe b; A.12) verwenden, das entweder erst vor Kurzem erworben oder vor der Verwendung gewaschen und getrocknet wurde, um eine hinreichende Reduzierungswirkung zu gewährleisten. Wenn der Test nicht mit einer Glove-Box (Nummer 12 Buchstabe j) durchgeführt wird, sollte die Konzentration des Natriumsulfids in der Stammlösung (von 1 g/l) auf 2 g/l erhöht werden. ²⁴⁴⁴Natriumsulfid kann bis zu einer Endkonzentration von 0,2 g/l auch aus einer geeigneten Stammlösung durch das Septum der verschlossenen Testflaschen injiziert werden, weil dadurch das Oxidationsrisiko reduziert wird. ²⁴⁴⁵Alternativ kann Titan-(III)-citrat (Nummer 17 Buchstabe b) verwendet werden. ²⁴⁴⁶Die Chemikalie bis zu einer Endkonzentration von 0,8 bis 1,0 mmol/l durch das Septum der verschlossenen Testflaschen injizieren. ²⁴⁴⁷Titan-(III)-citrat ist ein hochwirksames Reduziermittel mit geringer Toxizität, das wie folgt hergestellt wird: 2,94 g Trinatriumcitrat-Dihydrat in 50 ml sauerstofffreiem Verdünnungswasser (Nummer 14) lösen (resultierende Konzentration = 200 mmol/l); danach 5 ml einer Titan-(III)-chlorid-Lösung (15 g/100 l Verdünnungswasser) hinzugeben. ²⁴⁴⁸Den pH-Wert mit Natriumcarbonat auf 7 ± 0,5 neutralisieren und die Lösung unter einem Stickstoff-Gasstrom in eine geeignete Serumflasche geben. ²⁴⁴⁹Die Konzentration des Titan-(III)-citrats in dieser Stammlösung beträgt 164 mmol/l. ²⁴⁵⁰Das Prüfmedium entweder umgehend verwenden oder höchstens einen Tag lang bei einer Temperatur von 4 °C lagern.| A.12 | b) | 10-fach konzentriertes Prüfmedium, hergestellt aus:| wasserfreiem Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) | 2,7 g | | Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) | 4,4 g | (oder 11,2 g Dodecahydrat)Ammoniumchlorid (NH4Cl)
| 5,3 g | | Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 2H2O) | 0,75 g | | Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2 6H2O) | 1,0 g | | Eisen(II)-Chloridtetrahydrat (FeCl2 4H2O) | 0,2 g | | Resazurin (Redoxindikator) | 0,01 g | | Natriumsulfid-Nonahydrat (Na2S.9H2O) | 1,0 g | | (oder Titan-(III)-citrat) Endkonzentration | 0,8 mmol/l bis 1,0 mmol/l | | Spurenelementelösung (siehe Nummer 17 Buchstabe c; A.13) | 10,0 ml | | Hefeextrakt | 100 g | | In Verdünnungswasser lösen (Nummer 14) und auf 1 000 ml auffüllen. |
|
| A.13 | c) | Spurenelementelösung, hergestellt aus:| Mangan-(II)-chlorid-Tetrahydrat (MnCl2.4H2O) | 0,5 g | | Orthoborsäure (H3BO3) | 0,05 g | | Zinkchlorid (ZnCl2) | 0,05 g | | Kupfer-(II)-chlorid (CuCl2) | 0,03 g | | Natriummolybdat-Dihydrat (Na2MoO4.2H2O) | 0,01 g | | Kobalt-(II)-chlorid-Hexahydrat (CoCl2.6H2O) | 1,0 g | | Nickel-(II)-chlorid-Hexahydrat (NiCl2.6H2O) | 0,1 g | | Dinatriumselenit (Na2SeO3) | 0,05 g | | In Verdünnungswasser lösen (Nummer 14) und auf 1 000 ml auffüllen.‘ |
|
A.14 Nummer 25: VorversuchEin Vorversuch, wie unter Nummer 24 beschrieben, ist unerlässlich; allerdings sollte die Feststoffkonzentration des Schlamms ein Hundertstel der dort genannten Konzentration betragen (d. h. 0,1g/l, 0,2g/l und 0,4g/l). Die Inkubation sollte mindestens 7 Tage dauern.
Hinweis: Im Ringtest (5) war das Volumen des Kopfraums mit 75 % des Gesamtvolumens erheblich zu groß; es sollte im empfohlenen Bereich von 10 bis 40 % liegen. Das Volumen des Kopfraums sollte so gewählt werden, dass die produzierte Gasmenge bei einer Hemmung von etwa 80 % noch mit annehmbarer Genauigkeit (z. B. ± 5 bis ± 10 %) gemessen werden kann.
A.15 Nummern 26 bis 30: Zugabe der Prüfchemikalie, des Inokulums und des Substrats
Die Zugabe erfolgt wie unter den genannten Nummern beschrieben; die Substratlösung (Nummer 17) wird jedoch durch das Prüfmedium mit dem Hefeextrakt-Substrat ersetzt (A.11).
Außerdem wird die Endkonzentration der trockenen Schlammfeststoffe von 2-4 g/l auf 0,2 ± 0,05 g/l (A.9) reduziert. Tabelle A.1 enthält zwei Beispiele für die Zugabe von Bestandteilen zum Prüfgemisch; diese Tabelle ersetzt die Tabelle unter Nummer 29.
A.16 Nummer 33: Inkubation der Flaschen
Da eine geringere Gasproduktion zu erwarten ist, sollte die Inkubationsdauer auf mindestens 7 Tage verlängert werden.
A.17 Nummer 34: Druckmessungen
Die Messung des Drucks im Kopfraum der Flaschen erfolgt nach dem unter Nummer 34 beschriebenen Verfahren, wenn die Mengenangaben in der gasförmige Phase benötigt werden. Sollen die CO2- plus CH4-Gesamtmengen gemessen werden, zunächst den pH-Wert der flüssigen Phase auf etwa pH 2 reduzieren, indem H3PO4 in die jeweiligen Flaschen injiziert wird; anschließend nach 30-minütigem Schütteln bei Testtemperatur der Druck messen. Mehr Informationen zur Qualität des Inokulums können allerdings ermittelt werden, indem der Druck in den einzelnen Flaschen vor und nach der Reduzierung des pH-Werts gemessen wird. Wenn beispielsweise die CO2-Produktionrate erheblich über der Methan-Produktionsrate liegt, kann dies die Empfindlichkeit der fermentativen Bakterien verändern und/oder die Prüfchemikalie wirkt vor allem auf methanogene Bakterien.
A.18 Nummer 36: Messung des pH-Werts
Wenn H3PO4 verwendet werden soll, sind speziell für die pH-Messungen einige zusätzliche Flaschen ohne H3PO4 vorzubereiten.
LITERATUR:
Madsen, T, Rasmussen, H.B., und Nilsson, L. ²⁴⁶²(1996), Methods for screening anaerobic biodegradability and toxicity of organic chemicals. ²⁴⁶³Project No.336, Water Quality Institute, Dänische Umweltagentur, Kopenhagen.
Tabelle A.1.
Versuchspläne für Testchargen — Beispiele
| Bestandteile des Reaktionsgemischs | Beispiel 1 | Beispiel 2 | Normale Reihenfolge der Zugabe | | Konzentration des präparierten Inokulums (g/l) | 0,42 | 2,1 | — | | Volumen des zugegebenen Inokulums (ml) | 45 | 9 | 4 | | Konzentration des Inokulums in den Testflaschen (g/l) | 0,20 | 0,20 | — | | Volumen des zugegebenen Prüfmediums (ml) | 9 | 9 | 2 | | Volumen des zugegebenen Verdünnungswassers (ml) | 36 | 72 | 3 | | Konzentration des Hefeextrakts in den zu Testflaschen (g/l) | 9,7 | 9,7 | — | | Volumen der Stammlösung mit der Prüfchemikalie (ml) | 3 | 3 | 1 | | Gesamtflüssigkeitsvolumen (ml) | 93 | 93 | — |
Anlage 5Begriffsbestimmungen
Für diese Prüfmethode gelten die folgenden Definitionen:
Chemikalie: ein Stoff oder ein Gemisch.
Prüfchemikalie: ein beliebiger Stoff oder ein beliebiges Gemisch, der bzw. das nach dieser Methode geprüft wird.
C.35 SEDIMENT-WASSER-TOXIZITÄTSSTUDIE MIT DOTIERTEM SEDIMENT AN LUMBRICULUS
EINLEITUNG
| 1. | ²⁴⁶⁶Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 225 (2007). ²⁴⁶⁷Sedimentfressende endobenthische Tiere werden durch in Sedimenten gebundene Chemikalien potenziell stark belastet und verdienen folglich besonderes Augenmerk (z. B. (1)(2)(3)). ²⁴⁶⁸Unter diesen Sedimentfressern nehmen aquatische Oligochaeten in den Sedimenten aquatischer Systeme einen bedeutenden Platz ein. ²⁴⁶⁹Durch Bioturbation der Sedimente und als Beutetiere haben diese Tiere erheblichen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit sedimentgebundener Chemikalien für andere Organismen (z. B. benthivore Fische). Im Gegensatz zu epibenthischen Organismen graben sich endobenthische aquatische Oligochaeten (z. B. Lumbriculus variegatus) in die Sedimente ein und nehmen Partikel unterhalb der Sedimentoberfläche auf. ²⁴⁷⁰Dies gewährleistet, dass die Testorganismen der Prüfchemikalie über alle möglichen Aufnahmewege ausgesetzt werden (z. B. Kontakt mit kontaminierten Sedimentpartikeln und orale Aufnahme dieser Partikel, aber auch Aufnahme über Poren- und Überstandswasser). |
| 2. | ²⁴⁷¹Diese Prüfmethode wurde zur Bewertung der Wirkung einer längerfristigen Exposition des endobenthischen Oligochaeten Lumbriculus variegatus (Müller) gegenüber sedimentgebundenen Chemikalien entwickelt. ²⁴⁷²Sie beruht auf bereits bestehenden Testprotokollen für Sedimenttoxizität und -bioakkumulation (z. B. (3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)). ²⁴⁷³Die Methode wird für statische Prüfbedingungen beschrieben. ²⁴⁷⁴Bei dem für diese Prüfmethode verwendeten Expositionsszenario wird das Sediment mit der Prüfchemikalie dotiert. ²⁴⁷⁵Mit dotierten Sedimenten soll ein mit der Prüfchemikalie kontaminiertes Sediment simuliert werden. |
| 3. | ²⁴⁷⁶In der Regel haben auf Toxizität bei sedimentbewohnenden Organismen zu prüfende Chemikalien eine lange Verweildauer in diesem Kompartiment. ²⁴⁷⁷Sedimentbewohner können über verschiedene Wege exponiert werden. ²⁴⁷⁸Die relative Bedeutung der einzelnen Expositionspfade und die Geschwindigkeit, mit der diese jeweils zu den gesamten toxischen Wirkungen beitragen, hängen von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des betreffenden Stoffes und seinem Verhalten im tierischen Organismus ab. Für stark adsorbierende Chemikalien (z. B. log Kow > 5) oder für kovalent an das Sediment gebundene Chemikalien kann die Aufnahme über die Nahrung ein wichtiger Expositionspfad sein. ²⁴⁷⁹Um die Toxizität dieser Chemikalien nicht unterzubewerten, wird das für die Vermehrung und das Wachstum der Testorganismen erforderliche Futter dem Sediment zugegeben, bevor es mit der Prüfchemikalie dotiert wird (11). ²⁴⁸⁰Die beschriebene Prüfmethode ist detailliert genug, um die Prüfung durchführen und den Versuchsplan je nach Bedingungen in den einzelnen Labors und den unterschiedlichen Eigenschaften der Prüfchemikalien anpassen zu können. |
| 4. | ²⁴⁸¹Die Prüfmethode dient der Ermittlung der Wirkungen einer Prüfchemikalie auf die Reproduktion und die Biomasse der Testorganismen. ²⁴⁸²Als biologische Parameter werden die Gesamtzahl der überlebenden Würmer und die Biomasse (Trockenmasse) am Ende der Expositionsdauer gemessen. ²⁴⁸³Diese Daten werden entweder anhand eines Regressionsmodells zur Ermittlung der Konzentration analysiert, bei der eine Wirkung von x % auftreten würde (z. B. EC50, EC25 und EC10), oder es wird eine statistische Hypothesenprüfung vorgenommen, um die höchste messbare Expositionskonzentration ohne statistisch signifikante Wirkung (NOEC-Wert) und die niedrigste messbare Konzentration, bei der noch statistisch signifikante Wirkungen beobachtet werden (LOEC-Wert), zu bestimmen. |
| 5. | ²⁴⁸⁴Kapitel C.27 dieses Anhangs (‚Sediment-Wasser-Toxizitätstest mit gespiktem Sediment an Chironomiden‘ (6)) enthält viele wichtige und nützliche Informationen zur Durchführung der vorliegenden Sedimenttoxizitätsstudie. Dieses Dokument dient daher als Grundlage für die zur Durchführung von Sedimenttoxizitätstests mit Lumbriculus variegatus erforderlichen Modifikationen. Weitere Referenzdokumente sind z. B. der ASTM Standard Guide for Determination of the Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants by Benthic Invertebrates (3), die U.S. EPA Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates (7) und die ASTM Standard Guide for Collection, Storage, Characterization, and Manipulation of Sediments for Toxicological Testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates (12). ²⁴⁸⁵Wichtige Informationsquellen für die Erarbeitung dieses Dokuments waren außerdem die in Ringtests der Prüfmethode ((13), Ringtest-Bericht) gewonnenen praktischen Erfahrungen sowie Informationen aus der Fachliteratur. |
VORAUSSETZUNGEN UND PRAKTISCHE HINWEISE | 6. | ²⁴⁸⁶Vor Beginn der Studie sind Informationen zur Prüfchemikalie (z. B. Sicherheitsvorkehrungen, geeignete Lagerbedingungen und Analysemethoden) einzuholen. ²⁴⁸⁷Für Leitlinien für Prüfchemikalien mit physikalisch-chemischen Eigenschaften, die die Durchführung des Tests erschweren, siehe (14). |
| 7. | Vor der Durchführung einer Prüfung sollte Folgendes über die Prüfchemikalie bekannt sein:- —
- Name, chemische Bezeichnung (vorzugsweise IUPAC-Bezeichnung), Strukturformel, CAS-Nummer, Reinheit;
- —
- Dampfdruck;
- —
- Wasserlöslichkeit;
|
| 8. | Die folgenden zusätzlichen Informationen gelten als hilfreich:- —
- Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, Kow;
- —
- organischer Kohlenstoff/Wasser-Verteilungskoeffizient, ausgedrückt als Koc;
- —
- Hydrolyse;
- —
- Phototransformation in Wasser;
- —
- biologische Abbaubarkeit;
- —
- Oberflächenspannung.
|
| 9. | Informationen über bestimmte Eigenschaften des zu verwendenden Sediments sollten ebenfalls vor Beginn des Versuchs vorliegen (7). Für Einzelheiten siehe Nummern 22 bis 25. |
TESTPRINZIP | 10. | ²⁴⁹⁰Würmer in vergleichbarem physiologischem Zustand (synchronisiert wie in Anlage 5 beschrieben) werden einer Reihe von Giftstoffkonzentrationen ausgesetzt, die der Sedimentphase eines Sediment-Wasser-Systems zugesetzt wurden. ²⁴⁹¹Als Medien sollten künstliches Sediment und rekonstituiertes Wasser verwendet werden. ²⁴⁹²Als Kontrollen werden Prüfgefäße ohne Prüfchemikalie verwendet. ²⁴⁹³Die Prüfchemikalie wird für jede Konzentration in einem einzigen Schritt in das Sediment dotiert, um Schwankungen zwischen Replikaten der einzelnen Konzentrationen zu minimieren; die Testorganismen werden anschließend in die Prüfgefäße gesetzt, in denen Sediment-Wasser-Konzentrationen äquilibriert wurden (siehe Nummer 29). ²⁴⁹⁴Die Testtiere werden in den Sediment-Wasser-Systemen 28 Tage lang exponiert. ²⁴⁹⁵Aufgrund seines niedrigen Nährstoffgehalts sollte das künstliche Sediment mit Futter angereichert werden (siehe Nummern 22 und 23 sowie Anlage 4), um sicherzustellen, dass die Würmer unter kontrollierten Bedingungen wachsen und sich vermehren. ²⁴⁹⁶Auf diese Weise wird gewährleistet, dass die Tiere sowohl über das Wasser und das Sediment als auch über das Futter exponiert werden. |
| 11. | ²⁴⁹⁷Bevorzugter Endpunkt bei dieser Art von Studie ist der ECx-Wert (z. B. EC50, EC25 und EC10, d. h. die Konzentration, bei der eine Wirkung von x % bei den Testorganismen beobachtet wird) für die Reproduktion bzw. die Biomasse im Vergleich zur Kontrolle. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass der EC50-Wert — angesichts der hohen Unsicherheit niedriger ECx-Werte (z. B. EC10 oder EC25) mit extrem hohem 95 %-Konfidenzintervall (z. B. (15)) und der durch Hypothesenprüfungen ermittelten statistischen Aussagekraft — als robustester Endpunkt betrachtet wird. ²⁴⁹⁸Außerdem lassen sich für Biomasse und Reproduktion NOEC- und LOEC-Werte ermitteln, wenn Versuchsplan und verfügbares Datenmaterial diese Berechnungen gestatten (siehe Nummern 34 bis 38). Der Versuchsplan richtet sich nach dem Zweck der Studie, d. h. der Ableitung des ECx-Werts oder des NOEC-Wertes. |
REFERENZPRÜFUNG | 12. | ²⁴⁹⁹Es wird davon ausgegangen, dass das Verhalten der Kontrollorganismen hinreichend dokumentiert, dass ein Labor zur Durchführung der Prüfung in der Lage und — soweit historische Daten vorliegen — die Prüfung wiederholbar ist. ²⁵⁰⁰Zusätzlich können in regelmäßigen Abständen mithilfe eines Referenzgiftstoffs Referenz-Toxizitätstests durchgeführt werden, um die Empfindlichkeit der Testorganismen zu bestimmen. ²⁵⁰¹Mit 96 Stunden-Referenz-Toxizitätstests ausschließlich in Wasser können Empfindlichkeit und Zustand der Versuchstiere zufriedenstellend demonstriert werden (4)(7). ²⁵⁰²Informationen über die Toxizität von Pentachlorphenol (PCP) in vollständigen Tests (28-tägige Exposition gegenüber dem dotierten Sediment) sind Anlage 6 sowie dem Bericht über den Ringtest dieser Prüfmethode (13) zu entnehmen. ²⁵⁰³Für die akute Toxizität von PCP in Wasser siehe beispielsweise (16). ²⁵⁰⁴Diese Informationen können für den Vergleich der Empfindlichkeit des Testorganismus in Referenzprüfungen mit PCP als Referenzgiftstoff verwendet werden. Kaliumchlorid (KCl) oder Kupfersulfat (CuSO4) wurden als Referenzgiftstoffe für L. variegatus empfohlen (4)(7). Bislang ist es noch schwierig, Qualitätskriterien anhand von KCl-Toxizitätsdaten festzulegen, da Daten über L. variegatus in der Literatur nicht verfügbar sind. Für Informationen zur Toxizität von Kupfer für L. variegatus siehe (17) bis (21). |
VALIDITÄT DES TESTS | 13. | Damit der Test als gültig anerkannt werden kann, sollten die folgenden Anforderungen erfüllt sein:- —
- Ein Ringtest (13) hat gezeigt, dass sich die durchschnittliche Anzahl lebender Würmer (Lumbriculus variegatus) pro Replikat in den Kontrollen am Ende der Expositionsdauer gegenüber der Anzahl Würmer pro Replikat zu Beginn der Exposition mindestens um das 1,8-Fache erhöht hat.
- —
- Der pH-Wert des Überstandswassers muss während der gesamten Prüfung zwischen 6 und 9 liegen.
- —
- Die Sauerstoffkonzentration im Überstandswasser darf bei Testtemperatur nicht weniger als 30 % des Luftsauerstoff-Sättigungswertes (Air Saturation Value, ASV) betragen.
|
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODEPrüfsystem
| 14. | ²⁵¹¹Nach Möglichkeit sollten statische Systeme verwendet werden, bei denen das Überstandswasser nicht erneuert wird. ²⁵¹²Ist das Sediment/Wasser-Verhältnis (siehe Nummer 15) angemessen, reicht im Allgemeinen eine schwache Belüftung aus, um eine annehmbare Wasserqualität für die Testorganismen zu gewährleisten (z. B. Maximierung des Anteils an gelöstem Sauerstoff und Minimierung der Anreicherung von Ausscheidungsprodukten). ²⁵¹³Semistatische Systeme oder Durchflusssysteme mit intermittierender oder ständiger Erneuerung des Überstandswassers sollten nur in Ausnahmefällen verwendet werden, denn es ist davon auszugehen, dass die regelmäßige Erneuerung des Überstandswassers das chemische Gleichgewicht beeinträchtigt (z. B. durch Verluste der Prüfchemikalie aus dem Prüfsystem). |
Prüfgefäße und Apparatur | 15. | ²⁵¹⁴Die Exposition erfolgt in 250-ml-Bechergläsern mit einem Durchmesser von 6 cm. ²⁵¹⁵Andere Glasgefäße können verwendet werden, sofern sie eine angemessene Tiefe von Überstandswasser und Sediment gewährleisten. ²⁵¹⁶In jedes Gefäß wird eine Schicht von etwa 1,5-3 cm des formulierten Sediments gegeben. ²⁵¹⁷Das Verhältnis zwischen Sedimentschichttiefe und Überstandswasserstiefe beträgt 1:4. ²⁵¹⁸Die Gefäße müssen ein der Besatzrate (d. h. der Anzahl der pro Gewichtseinheit des Sediments eingesetzten Würmer) angemessenes Fassungsvermögen haben (siehe auch Nummer 39). |
| 16. | ²⁵¹⁹Prüfgefäße und sonstige Apparaturen, die mit der Prüfchemikalie in Berührung kommen, sollten vollständig aus Glas oder einem anderen chemisch inerten Material bestehen. ²⁵²⁰Die Verwendung von Materialien, die sich auflösen können, die Prüfchemikalien absorbieren oder andere Chemikalien freisetzen bzw. den Testorganismen schaden können, sollte für alle verwendeten Teile möglichst vermieden werden. ²⁵²¹Geräte, die mit den Prüfmedien in Berührung kommen, können aus Polytetrafluorethylen (PTFE), rostfreiem Stahl und/oder Glas bestehen. ²⁵²²Bei organischen Chemikalien, die auf Glas bekanntermaßen adsorbiert werden, kann silanisiertes Glas erforderlich sein. ²⁵²³In solchen Fällen muss das Gerät nach der Benutzung entsorgt werden. |
Testspezies | 17. | ²⁵²⁴Die für diese Art von Studie zu verwendende Spezies ist der Süßwasser-Oligochaet Lumbriculus variegatus (Müller). ²⁵²⁵Diese Art ist gegenüber einer Vielzahl von Sedimenttypen tolerant und wird allgemein für Sedimenttoxizitäts- und -bioakkumulationstests verwendet (z. B. (3), (5), (7), (9), (13), (15), (16), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34) und (35)). ²⁵²⁶Die Herkunft der Testtiere, die Artbestimmung (z. B. (36)) und die Kulturbedingungen sind zu protokollieren. ²⁵²⁷Die Art braucht nicht vor jeder Prüfung neu bestimmt zu werden, wenn die Organismen aus einer Laborkultur stammen. |
Anzucht der Testorganismen | 18. | Damit eine ausreichende Anzahl Würmer für die Sediment-Toxizitätstests verfügbar ist, empfiehlt es sich, die Würmer in einer Dauerkultur vorrätig zu halten. Für Hinweise zu Laborkulturmethoden für Lumbriculus variegatus sowie Bezugsquellen für Ausgangskulturen siehe Anlage 5. Für nähere Informationen zur Kultivierung dieser Art siehe (3), (7) und (27). |
| 19. | ²⁵²⁹Um sicherzustellen, dass die Tests mit Tieren derselben Art durchgeführt werden, wird die Herstellung von Monospezies-Kulturen dringend empfohlen. ²⁵³⁰Dabei ist sicherzustellen, dass die Kulturen und insbesondere die in den Tests verwendeten Würmer keine erkennbaren Anzeichen von Krankheiten und Anomalien aufweisen. |
Wasser | 20. | ²⁵³¹Als Überstandswasser für die Tests wird rekonstituiertes Wasser (siehe Kapitel C.1 dieses Anhangs) (37) empfohlen. ²⁵³²Dieses Testwasser kann auch für die Laborzucht der Würmer verwendet werden (für die Aufbereitung des Wassers siehe Anlage 2). ²⁵³³Falls erforderlich, kann auch natürliches Wasser verwendet werden. ²⁵³⁴Das gewählte Testwasser sollte so beschaffen sein, dass die Testspezies während der Akklimatisierungs- und Testphasen weiter wachsen und sich vermehren kann, ohne Abweichungen in Aussehen oder Verhalten zu entwickeln. Es wurde nachgewiesen, dass Lumbriculus variegatus in diesem Testwasser überlebt, wächst und sich vermehrt (30), und so eine maximale Standardisierung der Test- und Kulturbedingungen gewährleistet ist. Wenn rekonstituiertes Wasser verwendet wird, sollte seine Zusammensetzung protokolliert und das Testwasser vor der Verwendung charakterisiert werden (zumindest pH-Wert, Sauerstoffgehalt und Härte, letztere ausgedrückt in mg CaCO3/l). ²⁵³⁵Außerdem kann es sinnvoll sein, das Testwasser vor der Verwendung auf Mikroschadstoffe zu untersuchen (siehe z. B. Anlage 3). |
| 21. | ²⁵³⁶Der pH-Wert des Überstandswassers sollte im Bereich 6,0-9,0 liegen (siehe Nummer 13). ²⁵³⁷Wird mit einer verstärkten Ammoniakbildung gerechnet, sollte der pH-Wert auf 6,0-8,0 korrigiert werden. ²⁵³⁸Für die Prüfung z. B. schwacher organischer Säuren empfiehlt es sich, den pH-Wert durch Puffern des Testwassers anzupassen, wie z. B. unter (16) beschrieben. Die Gesamthärte des Testwassers sollte bei natürlichem Wasser zwischen 90 und 300 mg CaCO3 pro Liter betragen. ²⁵³⁹Anlage 3 enthält zusätzliche Kriterien für akzeptables Testwasser im Sinne der OECD-Prüfrichtlinie 210 (38). |
Sediment | 22. | ²⁵⁴⁰Da unkontaminierte natürliche Sedimente von einem bestimmten Herkunftsort möglicherweise nicht ganzjährig verfügbar sind und darin vorhandene Infauna (Endofauna) und vorhandene Mikroschadstoffe den Test beeinflussen können, ist vorzugsweise ein formuliertes Sediment (auch bezeichnet als rekonstituiertes, künstliches oder synthetisches Sediment) zu verwenden. ²⁵⁴¹Durch die Verwendung eines formulierten Sediments werden Schwankungen bei den Testbedingungen und die Gefahr der Eintragung von im Sediment enthaltenden Organismen (Infauna) auf ein Mindestmaß begrenzt. ²⁵⁴²Das folgende formulierte Sediment basiert auf dem künstlichen Sediment gemäß (6), (39) und (40). Es wird für diese Art von Prüfung empfohlen (siehe (6), (10), (30), (41), (42), (43)):- a)
- 4-5 % (bezogen auf die Trockenmasse) Sphagnumtorf: Wichtig ist, dass der Torf in Pulverform (Zersetzungsgrad ‚mittel‘), fein gemahlen (Partikelgröße ≤ 0,5 mm) und ausschließlich luftgetrocknet verwendet wird;
- b)
- 20 ± 1 % (bezogen auf die Trockenmasse) Kaolin-Ton (Kaolingehalt vorzugsweise über 30 %);
- c)
- 75-76 % (bezogen auf die Trockenmasse) Quarzsand (feiner Sand, Korngröße ≤ 2 mm, > 50 % der Partikel sollten eine Korngröße zwischen 50 und 200 μm haben);
- d)
- entionisiertes Wasser, 30–50 % bezogen auf die Trockenmasse des Sediments, zusätzlich zu den trockenen Sedimentbestandteilen;
- e)
- chemisch reines Calciumcarbonat (CaCO3), das zugegeben wird, um den pH-Wert der fertigen Mischung des Sediments einzustellen;
- f)
- der gesamte organische Kohlenstoff (TOC) der fertigen Mischung sollte 2 % (± 0,5 %), bezogen auf die Trockenmasse des Sediments, betragen und ist durch Zugabe von geeigneten Mengen Torf und Sand (siehe Buchstaben a und c) sicherzustellen;
- g)
- Futter, beispielsweise fein gemahlene Brennnesselblätter (Urtica sp., gemäß Arzneimittelstandards, für den menschlichen Verzehr), oder eine Mischung aus fein gemahlenen Blättern von Urtica sp. mit Alpha-Cellulose (1:1), in einem Anteil von 0,4-0,5 %, bezogen auf die Trockenmasse des Sediments, zusätzlich zu den trockenen Sedimentbestandteilen; für nähere Informationen siehe Anlage 4.
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| 23. | Die Herkunft von Torf, Kaolin-Ton, Futtermaterial und Sand sollte bekannt sein. Zusätzlich zu Buchstabe g sind in Kapitel C.27 dieses Anhangs (6) alternative Pflanzenmaterialien aufgelistet, die als Nährstoffe dienen können: getrocknete Maulbeerblätter (Morus alba), Weißklee (Trifolium repens), Spinat (Spinacia oleracea) oder Getreidegräser. |
| 24. | ²⁵⁴⁵Das gewählte Futter sollte hinzugegeben werden, bevor oder während das Sediment mit der Prüfchemikalie dotiert wird. ²⁵⁴⁶Die Futterquelle sollte zumindest eine akzeptable Vermehrung in den Kontrollen ermöglichen. ²⁵⁴⁷Eine vor Gebrauch durchgeführte Analyse des künstlichen Sediments oder seiner Bestandteile auf Mikroschadstoffe könnte nützliche Informationen liefern. ²⁵⁴⁸Ein Beispiel für die Herstellung des formulierten Sediments ist in Anlage 4 gegeben. ²⁵⁴⁹Trockene Bestandteile können auch gemischt werden, sofern es nach Zugabe des Überstandswassers nachweislich nicht zu einer Auftrennung der Sedimentbestandteile (z. B. schwimmende Torfpartikel) kommt und der Torf oder das Sediment ausreichend konditioniert ist (siehe auch Nummer 25 und Anlage 4). ²⁵⁵⁰Das künstliche Sediment sollte zumindest nach der Herkunft seiner Bestandteile, der Korngrößenverteilung (Prozentanteil an Sand, Schlick und Ton), dem gesamten organischen Kohlenstoff (TOC), dem Wassergehalt und dem pH-Wert charakterisiert werden. ²⁵⁵¹Die Messung des Redoxpotenzials ist fakultativ. |
| 25. | ²⁵⁵²Soweit (beispielsweise für spezifische Tests) erforderlich, können auch natürliche Sedimente von unkontaminierten Standorten als Test- und/oder Kultursedimente dienen (3). ²⁵⁵³Wenn natürliches Sediment verwendet wird, sollte dieses allerdings zumindest nach Herkunft (Entnahmeort), pH-Wert und Ammoniakgehalt des Porenwassers, gesamtem organischem Kohlenstoff (TOC) und Stickstoffgehalt, Partikelgrößenverteilung (Prozentanteil an Sand, Schlick und Ton) und Wassergehalt (in %) (7) charaktierisiert werden; außerdem muss das Sediment frei von Schadstoffen und sonstigen Organismen sein, die mit den Testorganismen konkurrieren oder diese fressen könnten. ²⁵⁵⁴Die Messung des Redoxpotenzials und der Kationenaustauschkapazität ist fakultativ. ²⁵⁵⁵Ferner wird empfohlen, natürliches Sediment vor dem Dotieren mit der Prüfchemikalie sieben Tage lang unter den Bedingungen des anschließenden Tests zu konditionieren. ²⁵⁵⁶Nach dieser Konditionierung ist das Überstandswasser zu entfernen und zu verwerfen. |
| 26. | ²⁵⁵⁷Das zu verwendende Sediment sollte von einer Qualität sein, die gewährleistet, dass die Kontrollorganismen während der Exposition überleben und sich vermehren können, ohne Abweichungen in Aussehen oder Verhalten zu entwickeln. ²⁵⁵⁸Die Kontrollwürmer sollten sich in das Sediment eingraben und das Sediment aufnehmen. ²⁵⁵⁹Die Vermehrung in den Kontrollen sollte mindestens das Validitätskriterium gemäß Nummer 13 erfüllen. ²⁵⁶⁰Das Vorhandensein bzw. Fehlen von Fäkalpellets auf der Oberfläche des Sediments (die auf Sedimentaufnahme hinweisen), ist zu protokollieren und kann bei der Auswertung der Testergebnisse hinsichtlich der Expositionspfade nützlich sein. ²⁵⁶¹Weitere Informationen über die Sedimentaufnahme können durch die unter (24), (25), (44) und (45) beschriebenen Methoden eingeholt werden, die der Bestimmung der Sedimentaufnahme oder der Wahl der Partikel durch die Testorganismen dienen. |
| 27. | Verfahren für die Handhabung natürlicher Sedimente vor der Verwendung im Labor sind unter (3), (7) und (12) beschrieben. Für die Aufbereitung und Lagerung des für den Versuch mit Lumbriculus empfohlenen künstlichen Sediments siehe Anlage 4. |
Applikation der Prüfchemikalie | 28. | ²⁵⁶³Die Prüfchemikalie wird in das Sediment dotiert. ²⁵⁶⁴Da die meisten Prüfchemikalien wahrscheinlich nur schwach wasserlöslich sind, sollten sie zur Herstellung der Stammlösung in der kleinstmöglichen Menge eines geeigneten organischen Lösungsmittels (z. B. Aceton, n-Hexan oder Cyclohexan) gelöst werden. ²⁵⁶⁵Die Stammlösung sollte mit demselben Lösungsmittel gelöst werden, um die Testlösungen herzustellen. ²⁵⁶⁶Hauptkriterien für die Wahl des geeigneten Lösungsvermittlers sollten die Toxizität und Flüchtigkeit des Lösungsmittels und die Löslichkeit der Prüfchemikalie in dem gewählten Lösungsmittel sein. ²⁵⁶⁷Für jede Konzentration ist dasselbe Volumen der entsprechenden Lösung zu verwenden. ²⁵⁶⁸Das Sediment sollte für jede Konzentration in einem einzigen Schritt dotiert werden, um Schwankungen bei den Prüfchemikalienkonzentrationen zwischen den einzelnen Replikaten zu minimieren. ²⁵⁶⁹Die Testlösungen anschließend mit Quarzsand vermischen, wie unter Nummer 22 beschrieben (z. B. 10 g Quarzsand pro Prüfgefäß). ²⁵⁷⁰Erfahrungsgemäß reicht ein Volumen von 0,20-0,25 ml pro g Quarzsand aus, um den Sand vollständig zu durchtränken. ²⁵⁷¹Das Lösungsmittel anschließend verdampfen, bis der Sand vollständig getrocknet ist. ²⁵⁷²Um (je nach Dampfdruck der Chemikalie) verflüchtigungsbedingte Prüfchemikalienverluste zu vermeiden, sollte der beschichtete Sand unmittelbar nach dem Trocknen verwendet werden. ²⁵⁷³Den trockenen Sand mit einer geeigneten Menge eines formulierten Sediments der gewünschten Konzentration vermischen. ²⁵⁷⁴Bei der Aufbereitung des Sediments die in der Mischung von Prüfchemikalie und Sand enthaltene Sandmenge berücksichtigen (d. h. das Sediment sollte mit möglichst wenig Sand hergestellt werden). ²⁵⁷⁵Wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens ist, dass praktisch kein Lösungsmittel in das Sediment gelangt (7). ²⁵⁷⁶Alternativ, z. B. bei Freilandsedimenten, kann die Prüfchemikalie auch hinzugegeben werden, indem ein getrockneter und fein gemahlener Anteil des Sediments dotiert wird (wie oben für Quarzsand beschrieben) oder indem die Prüfchemikalie in das feuchte Sediment eingerührt wird mit anschließender Verdampfung des verwendeten Lösungsvermittlers. ²⁵⁷⁷Es ist darauf zu achten, dass die Prüfchemikalie mit dem Sediment gut durchmischt ist, um eine homogene Verteilung im Sediment zu gewährleisten. ²⁵⁷⁸Erforderlichenfalls können Teilproben analysiert werden, um die Zielkonzentrationen im Sediment zu bestätigen und den Homogenitätsgrad zu bestimmen. ²⁵⁷⁹Es kann auch sinnvoll sein, Teilproben der Testlösungen zu untersuchen, um auch dort die Zielkonzentrationen im Sediment zu bestätigen. ²⁵⁸⁰Da zur Applikation der Prüfchemikalie auf den Quarzsand ein Lösungsmittel verwendet wird, sollte mit derselben Menge Lösungsmittel wie bei den Testsedimenten eine Lösungsmittelkontrolle angesetzt werden. ²⁵⁸¹Das verwendete Dotierungsverfahren und die Gründe für die Wahl eines anderen Verfahrens als oben beschrieben sollten angegeben werden. ²⁵⁸²Das Dotierungsverfahren kann an die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfchemikalie angepasst werden (z. B. um Verluste durch Verflüchtigung beim Dotieren oder Äquilibrieren zu vermeiden). Für weitere Hinweise zum Dotierungsverfahren siehe Environment Canada (1995) (46). |
| 29. | ²⁵⁸³Nachdem das dotierte Sediment hergestellt, in die Prüfgefäße für die Replikate gegeben und mit Testwasser aufgefüllt wurde, sollte ausreichend Zeit vorgesehen werden, damit sich die Prüfchemikalie aus dem Sediment in die wässrige Phase verteilen kann (z. B. (3)(7)(9)). ²⁵⁸⁴Dies sollte möglichst unter den Temperatur- und Belüftungsbedingungen des Tests geschehen. ²⁵⁸⁵Die erforderliche Äquilibrierungszeit ist sediment- und chemikalienabhängig und liegt gewöhnlich in der Größenordnung von Stunden bis Tagen, in seltenen Fällen beträgt sie mehrere Wochen (4 bis 5 Wochen) (z. B. (27)(47)). ²⁵⁸⁶Bei diesem Test wird keine Gleichgewichtseinstellung abgewartet sondern es wird eine Äquilibrierungszeit von 48 Stunden bis zu 7 Tagen empfohlen, um die Zeit für einen Abbau der Prüfchemikalie zu minimieren. ²⁵⁸⁷Je nach Zweck der Studie (z. B. Simulation von Umweltbedingungen) kann das dotierte Sediment für eine längere Dauer äquilibriert oder gealtert werden. |
| 30. | ²⁵⁸⁸Nach dieser Äquilibrierungszeit sollten Proben zumindest aus dem Überstandswasser und dem Sediment entnommen werden, und zwar mindestens jeweils von der höchsten und einer niedrigeren Konzentration, um die Konzentration der Prüfchemikalie zu bestimmen. ²⁵⁸⁹Diese analytischen Bestimmungen der Prüfchemikalie sollten die Berechnung der Massenbilanz und auf den gemessenen Ausgangskonzentrationen basierende Ergebnisse ermöglichen. ²⁵⁹⁰In der Regel wird das Sediment-Wasser-System durch Probenahmen gestört oder zerstört. ²⁵⁹¹Daher können gewöhnlich für die Untersuchung von Sediment und Würmern nicht dieselben Replikate verwendet werden. ²⁵⁹²Es müssen zusätzliche ‚Analytikgefäße‘ in geeigneter Größe bereitgestellt werden, die auf dieselbe Weise (inklusive Testorganismen) behandelt, die aber nicht für biologische Untersuchungen verwendet werden. ²⁵⁹³Die Gefäßgröße ist so zu wählen, dass die für das jeweilige Analyseverfahren erforderlichen Probemengen aufgenommen werden können. Für nähere Informationen siehe Nummer 53. |
DURCHFÜHRUNG DER PRÜFUNGVorversuch
| 31. | ²⁵⁹⁴Wenn keine Informationen über die Toxizität der Prüfchemikalie bei Lumbriculus variegatus verfügbar sind, kann die Durchführung eines Vorversuchs hilfreich sein, um den im Hauptversuch zu analysierenden Konzentrationsbereich zu ermitteln und die Bedingungen des endgültigen Tests zu optimieren. ²⁵⁹⁵Zu diesem Zweck wird die Prüfchemikalie in einem breiten Konzentrationsbereich getestet. ²⁵⁹⁶Die Würmer werden jeder Konzentration für eine bestimmte Zeit (z. B. 28 Tage wie im Hauptversuch) ausgesetzt, wodurch geeignete Testkonzentrationen ermittelt werden können. ²⁵⁹⁷Replikate sind nicht erforderlich. ²⁵⁹⁸Das Verhalten der Würmer (z. B. Meiden des Sediment), das durch die Prüfchemikalie und/oder das Sediment verursacht werden könnte, sollte im Vorversuch beobachtet und protokolliert werden. ²⁵⁹⁹Konzentrationen über 1 000 mg/kg Sediment (Trockengewicht) sind im Vorversuch nicht zu untersuchen. |
Hauptversuch | 32. | Im Hauptversuch mindestens fünf Konzentrationen verwenden, die beispielsweise nach dem Ergebnis des Vorversuchs (Nummer 31) ausgewählt werden, wie unter den Nummern 35, 36, 37 und 38 beschrieben. |
| 33. | ²⁶⁰¹Zusätzlich zu den Testreihen wird eine Kontrolle (für Replikate siehe Nummern 36, 37 und 38), die außer der Prüfchemikalie alle Testbestandteile enthält, angesetzt. ²⁶⁰²Ein zur Applikation der Prüfchemikalie möglicherweise verwendeter Lösungsvermittler darf keine messbaren Wirkungen auf die Testorganismen haben; derartige Wirkungen lassen sich anhand einer zusätzlichen Kontrolle, die ausschließlich Lösungsmittel enthält, feststellen. |
Versuchsplanung | 34. | Die Versuchsplanung regelt Zahl und Abstände der Testkonzentrationen, die Anzahl Prüfgefäße je Konzentration und die Zahl der auf die einzelnen Gefäße verteilten Würmer. Für die Verfahren zur Bestimmung der ECx-Werte und der NOEC-Werte und für die Durchführung eines Limit-Tests siehe Nummern 35, 36, 37 und 38. |
| 35. | ²⁶⁰⁴Die für den Test verwendeten Konzentrationen müssen in jedem Fall die Wirkungskonzentration (z. B. EC50, EC25 und EC10) und den Konzentrationsbereich, in dem die Wirkung der Prüfchemikalie von Interesse ist, einschließen. ²⁶⁰⁵Extrapolierungen weit unterhalb der niedrigsten Konzentration mit Wirkung auf die Testorganismen oder oberhalb der höchsten getesteten Konzentration sind zu vermeiden. ²⁶⁰⁶Wenn — in Ausnahmefällen — trotzdem eine Extrapolierung vorgenommen wird, ist dies im Bericht umfassend zu begründen. |
| 36. | ²⁶⁰⁷Wenn ECx–Werte bestimmt werden müssen, sollten mindestens fünf Konzentrationen und mindestens drei Replikate jeder Konzentration getestet werden. ²⁶⁰⁸Um Schwankungen zwischen den Kontrollen besser abschätzen zu können, werden sechs Replikate für die Kontrolle bzw. — soweit verwendet — für die Lösungsmittelkontrolle empfohlen. ²⁶⁰⁹Im Interesse einer angemessenen Modellierung ist es in jedem Fall ratsam, eine hinreichende Anzahl Konzentrationen zu testen. ²⁶¹⁰Die Konzentrationen sollten sich höchstens um den Faktor 2 unterscheiden (außer bei einer schwachen Steigung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve). ²⁶¹¹Die Anzahl Replikate pro Behandlung kann reduziert werden, wenn die Zahl der Prüfkonzentrationen mit Reaktionen im Bereich 5-95 % erhöht wird. ²⁶¹²Eine Erhöhung der Zahl der Replikate oder eine Verkürzung der Intervalle zwischen den Prüfkonzentrationen führt eher zu engeren Konfidenzintervallen für den Test. |
| 37. | ²⁶¹³Wenn LOEC- und NOEC-Werte bestimmt werden müssen, sollten mindestens fünf Testkonzentrationen mit mindestens vier Replikaten verwendet werden. ²⁶¹⁴Um Schwankungen zwischen den Kontrollen besser abschätzen zu können, werden sechs Replikate für die Kontrolle bzw. — soweit verwendet — für die Lösungsmittelkontrolle empfohlen. ²⁶¹⁵Die einzelnen Konzentrationen sollten sich höchstens um den Faktor 2 unterscheiden. Für Informationen zur statistischen Aussagekraft von Hypothesenprüfungen im Rahmen des Ringtests dieser Prüfmethode siehe Anlage 6. |
| 38. | ²⁶¹⁶Wenn (beispielsweise aufgrund eines Vorversuchs) bis zu 1 000 mg/kg Sediment (Trockengewicht) keine Wirkungen erwartet werden oder wenn bereits eine einzige Testkonzentration zur Bestätigung des maßgeblichen NOEC-Wertes ausreicht, kann (unter Verwendung einer Testkonzentration und von Kontrollen) ein Limit-Test durchgeführt werden. ²⁶¹⁷Im letztgenannten Fall ist die gewählte Limit-Konzentration im Prüfbericht detailliert zu begründen. ²⁶¹⁸Sinn und Zweck der Limit-Tests ist die Prüfung mit einer einzigen Konzentration, die so hoch ist, dass die Prüfer mögliche toxischen Wirkungen der Chemikalie ausschließen können; dabei wird das Limit auf einen Konzentrationswert festgesetzt, der unter realen Bedingungen nicht erreicht werden dürfte. ²⁶¹⁹Empfohlen wird eine Konzentration von 1 000 mg/kg (Trockengewicht). ²⁶²⁰In der Regel sind mindestens sechs Replikate pro Behandlung und Kontrollen erforderlich. Für Informationen zur statistischen Aussagekraft von Hypothesenprüfungen im Rahmen des Ringtests dieser Prüfmethode siehe Anlage 6. |
ExpositionsbedingungenTestorganismen
| 39. | ²⁶²¹Der Versuch wird mit mindestens 10 Würmern je Replikat durchgeführt, das zur Bestimmung biologischer Parameter verwendet wird. ²⁶²²Diese Anzahl Würmer entspricht in etwa 50-100 mg feuchter Biomasse. ²⁶²³Ausgehend von einem Trockengewichtsanteil von 17,1 % (48) ergeben sich daraus ungefähr 9-17 mg trockene Biomasse pro Gefäß. U.S. EPA (2000 (7)) empfiehlt ein Füllverhältnis von höchstens 1:50 (trockene Biomasse: TOC). ²⁶²⁴Für das unter Nummer 22 beschriebene Sediment entspricht dies etwa 43 g Sediment (Trockengewicht) pro 10 Würmer bei einem TOC von 2,0 % Trockensediment. ²⁶²⁵Wenn mehr als 10 Würmer pro Gefäß verwendet werden, muss die Menge des Sediments und des Überstandswassers entsprechend angepasst werden. |
| 40. | ²⁶²⁶Die für eine Prüfung verwendeten Würmer sollten alle aus derselben Quelle stammen und einen ähnlichen physiologischen Zustand aufweisen (siehe Anlage 5). ²⁶²⁷Es sind Würmer ähnlicher Größe auszuwählen (siehe Nummer 39). ²⁶²⁸Es wird empfohlen, vor dem Test eine Teilprobe der Charge oder des Würmervorrats zu wiegen, um das Durchschnittsgewicht zu bestimmen. |
| 41. | ²⁶²⁹Die für eine Prüfung zu verwendenden Würmer aus der Kultur nehmen (siehe Anlage 5). ²⁶³⁰Große (adulte) Tiere, die keine Anzeichen einer kürzlich erfolgten Fragmentierung aufweisen, in Glasgefäße (z. B. Petrischalen) mit sauberem Wasser setzen und synchronisieren, wie in Anlage 5 beschrieben. ²⁶³¹Nach der Regeneration über einen Zeitraum von 10-14 Tagen unversehrte vollständige Würmer ähnlicher Größe, die nach einem leichten mechanischen Reiz aktiv schwimmen oder zu kriechen beginnen, für den Versuch auswählen. ²⁶³²Wenn sich die Prüfbedingungen von den Kulturbedingungen unterscheiden (z. B. in Bezug auf Temperatur, Lichtverhältnisse und Überstandswasser) sollte eine Akklimatisierungsphase von beispielsweise 24 Stunden unter Testbedingungen bezüglich Temperatur, Lichtverhältnissen und Überstandswasser ausreichen, um die Anpassung der Würmer an die Prüfbedingungen zu ermöglichen. ²⁶³³Die akklimatisierten Oligochaeten nach dem Zufallsprinzip auf die Prüfgefäße verteilen. |
Fütterung | 42. | Da das Futter dem Sediment vor (oder während) der Applikation der Prüfchemikalie zugegeben wird, werden die Würmer während des Versuchs nicht weiter gefüttert. |
Licht und Temperatur | 43. | ²⁶³⁵Die Licht-/Dunkelphase bei Kultur und Prüfung beträgt gewöhnlich 16 Stunden (3)(7). ²⁶³⁶Die Lichtintensität sollte gering gehalten werden (z. B. 100-500 lx), um auf der Oberfläche des Sediments natürliche Bedingungen zu simulieren; während der Exposition die Lichtintensität mindestens einmal messen. ²⁶³⁷Die Temperatur sollte während der gesamten Prüfung 20 ± 2 °C betragen. ²⁶³⁸An einem gegebenen Messtag sollte der Temperaturunterschied zwischen den Prüfgefäßen nicht mehr als ± 1 °C betragen. ²⁶³⁹Die Prüfgefäße nach dem Zufallsprinzip in den Testinkubator oder auf die Testfläche stellen, um beispielsweise standortbedingte Reproduktionstrends auf ein Mindestmaß zu begrenzen. |
Belüftung | 44. | ²⁶⁴⁰Das Überstandswasser der Prüfgefäße vorsichtig belüften (z. B. mit 2-4 Blasen pro Sekunde); die dazu verwendete Pasteur-Pipette etwa 2 cm über der Oberfläche des Sediments ansetzen, um Perturbationen des Sediments zu minimieren. ²⁶⁴¹Dabei darauf achten, dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs nicht unter 30 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts (ASV) sinkt. ²⁶⁴²Die Luftzufuhr kontrollieren und erforderlichenfalls an Werktagen mindestens einmal täglich korrigieren. |
Messungen der Wasserqualität | 45. | Für das Überstandswasser sollten die folgenden Wasserqualitätsparameter gemessen werden:| Temperatur: | Einmal wöchentlich sowie am Anfang und am Ende der Expositionsdauer bei mindestens einem Prüfgefäß pro Konzentration und pro Kontrolle; wenn möglich, auch die Temperatur im umgebenden Medium (Umgebungsluft oder Wasserbad) z. B. stündlich messen. | | Gehalt an gelöstem Sauerstoff: | Einmal wöchentlich sowie am Anfang und am Ende der Expositionsdauer bei mindestens einem Prüfgefäß pro Konzentration und pro Kontrolle; ausgedrückt in mg/l und als Luftsauerstoff-Sättigungswert (in %). | | Luftzufuhr: | An Werktagen mindestens einmal täglich kontrollieren und erforderlichenfalls korrigieren. | | pH-Wert: | Einmal wöchentlich sowie am Anfang und am Ende der Expositionsdauer bei mindestens einem Prüfgefäß pro Konzentration und pro Kontrolle. | | Gesamt-wasserhärte: | Zu Beginn und am Ende der Expositionsdauer bei mindestens einem Kontrollreplikat und einem Prüfgefäß bei höchster Konzentration; ausgedrückt in mg/l CaCO3. | | Gesamt-ammoniakgehalt: | Zu Beginn der Expositionsdauer bei mindestens einem Kontrollreplikat und einem Prüfgefäß für jede Konzentration und anschließend dreimal wöchentlich; ausgedrückt in mg/l NH4+ oder NH3 oder als Ammoniak-N gesamt. |
Wenn die Messung der Wasserqualitätsparameter die Entnahme umfangreicher Wasserproben aus den Gefäßen erforderlich macht, kann die Bereitstellung separater Gefäße für Wasserqualitätsmessungen sinnvoll sein, um das Wasser/Sediment-Volumenverhältnis nicht zu verändern. |
Biologische Beobachtungen | 46. | ²⁶⁴⁹Während der Expositionsdauer sollten die Prüfgefäße beobachtet werden, um Verhaltensunterschiede bei den Würmern (z. B. Meiden des Sediments, sichtbare Fäkalpellets auf der Sedimentoberfläche) feststellen zu können. ²⁶⁵⁰Beobachtungen sind zu protokollieren. |
| 47. | ²⁶⁵¹Am Ende der Prüfung jedes Replikat untersuchen (für chemische Analysen vorgesehene zusätzliche Gefäße können hiervon ausgenommen werden). ²⁶⁵²Alle Würmer nach einer geeigneten Methode möglichst unversehrt aus dem Prüfgefäß entnehmen. ²⁶⁵³Eine Möglichkeit ist das Aussieben der Würmer aus dem Sediment. ²⁶⁵⁴Dazu kann ein Edelstahlsieb mit geeigneter Maschenweite verwendet werden. ²⁶⁵⁵Den Großteil des Überstandswasser vorsichtig abgießen und das verbleibende Sediment sowie das Restwasser zu einem Schlamm verrühren, der durch das Sieb passiert werden kann. ²⁶⁵⁶Bei einer Maschenweite von 500 μm passieren die meisten Sedimentpartikel das Sieb sehr schnell. ²⁶⁵⁷Das Sediment sollte jedoch sehr zügig gesiebt werden, damit die Würmer nicht in oder durch die Maschen kriechen können. ²⁶⁵⁸Bei einer Maschenweite von 250 μm dürfte dies ausgeschlossen sein. ²⁶⁵⁹Es ist jedoch darauf zu achten, dass möglichst wenig Sedimentpartikel auf den Maschen hängen bleiben. ²⁶⁶⁰Der gesiebte Schlamm jedes Replikats kann noch ein zweites Mal gesiebt werden, um sicherzustellen, dass tatsächlich alle Würmer gefunden wurden. ²⁶⁶¹Alternativ könnte das Sediment auch aufgewärmt werden, indem es in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 50-60 °C gestellt wird; die Würmer kriechen dann hervor und können mit einer feuerpolierten Glaspipette mit breiter Öffnung von der Sedimentoberfläche aufgenommen werden. ²⁶⁶²Eine weitere Möglichkeit wäre die Herstellung eines Sedimentschlamms, der in eine flache Schale mit geeigneter Größe gegossen wird. ²⁶⁶³Aus der flachen Schlammschicht können die Würmer mit einer Stahlnadel oder einer Juwelierpinzette (die dann eher als Gabel denn als Pinzette zu verwenden ist, damit die Würmer nicht verletzt werden) aufgenommen und in sauberes Wasser gesetzt werden. ²⁶⁶⁴Nach dem Entfernen aus dem Sedimentschlamm die Würmer mit Prüfmedium abspülen und zählen. |
| 48. | ²⁶⁶⁵Unabhängig von der verwendeten Methode müssen die Labors nachweisen, dass ihre Mitarbeiter in der Lage sind, durchschnittlich mindestens 90 % der Organismen im Sediment wiederzufinden. ²⁶⁶⁶Beispielsweise könnte eine bestimmte Anzahl Testorganismen in das Kontrollsediment oder in die Prüfsedimente eingesetzt und nach einer Stunde die Wiederfindungsrate ermittelt werden (7). |
| 49. | Die Gesamtzahl der lebenden und toten Würmer pro Replikat sollte erfasst und bewertet werden. Würmer der folgenden Kategorien gelten als tot:- a)
- nach einem leichten mechanischen Reiz erfolgt keine Reaktion;
- b)
- es zeigen sich Anzeichen von Zersetzung (in Verbindung mit Buchstabe a)
- c)
- keine Wiederfindung.
Als lebend gelten Würmer der folgenden Kategorien:- a)
- große vollständige (adulte) Würmer ohne regenerierte Körperbereiche;
- b)
- vollständige Würmer mit regenerierten, leicht helleren Körperbereichen (d. h. mit einem neuen hinteren Teil und/oder einem neuen vorderen Teil);
- c)
- unvollständige Würmer (d. h. kürzlich fragmentierte Würmer mit nicht regenerierten Körperbereichen).
²⁶⁶⁹Diese zusätzlichen Beobachtungen sind nicht verbindlich, können aber für die weitere Auswertung der biologischen Ergebnisse hilfreich sein. ²⁶⁷⁰(Eine hohe Anzahl Würmer der Kategorie c kann beispielsweise auf eine behandlungsbedingt verzögerte Reproduktion oder Regeneration hindeuten.) Festgestellte Unterschiede im Aussehen der behandelten Würmer und der Kontrollwürmer (z. B. Läsionen des Integuments, ödematöse Körperbereiche) sollten protokolliert werden. |
| 50. | ²⁶⁷¹Unmittelbar nach dem Zählen/Bewerten die in den einzelnen Replikaten gefundenen lebenden Würmer in getrocknete, vorgewogene und beschriftete Waagschalen (jeweils eine pro Replikat) setzen und mit einem Tropfen Ethanol pro Waagschale töten. ²⁶⁷²Die Waagschalen bei einer Temperatur von 100 ± 5 °C über Nacht in einem Trockenschrank trocknen und nach dem Abkühlen in einem Exsikkator wiegen; anschließend das Trockengewicht der Würmer (vorzugsweise in g bis auf mindestens 4 Dezimalstellen) bestimmen. |
| 51. | Zusätzlich zum Gesamttrockengewicht kann auch das aschefreie Trockengewicht bestimmt werden, wie in (49) beschrieben, um auch anorganische Bestandteile aus dem aufgenommenen Sedimentmaterial im Verdauungstrakt der Würmer zu berücksichtigen. |
| 52. | ²⁶⁷⁴Die Biomasse wird als gesamte Biomasse pro Replikat (juvenile und adulte Würmer) ermittelt. ²⁶⁷⁵Tote Würmer sollten zur Bestimmung der Biomasse pro Replikat nicht berücksichtigt werden. |
Überprüfung der PrüfchemikalienkonzentrationenProbenahmen
| 53. | ²⁶⁷⁶Zumindest am Ende der Äquilibrierungsphase (d. h. vor Zugabe der Testorganismen) sowie bei Prüfungsende sollten zur chemischen Analytik Proben der Prüfchemikalie (und zwar zumindest in der höchsten und in einer niedrigeren Konzentration) entnommen werden. ²⁶⁷⁷Untersucht werden sollten mindestens Proben des Sediments und des Überstandswassers. ²⁶⁷⁸Pro Matrix und pro Behandlung sollten an jedem Probenahmetag jeweils mindestens zwei Proben entnommen werden. ²⁶⁷⁹Eine der beiden Proben kann als Reserve aufbewahrt werden (die z. B. dann analysiert werden kann, wenn die erste Analyse einen Wert außerhalb des Bereichs von ± 20 % der nominalen Konzentration ergibt). ²⁶⁸⁰Bei spezifischen chemischen Merkmalen, z. B. wenn ein rascher Abbau der Prüfchemikalie erwartet wird, können die Analysen je nach Expertenurteil verfeinert werden (z. B. häufigere Probenahmen oder Analyse weiterer Konzentrationen). ²⁶⁸¹Zwischenmessungen können dann vorgenommen werden (z. B. an Tag 7 nach Beginn der Exposition). |
| 54. | ²⁶⁸²Das Überstandswasser vorsichtig abgießen oder absaugen, um das Sediment möglichst wenig zu perturbieren. ²⁶⁸³Die entnommenen Probenvolumina protokollieren. |
| 55. | ²⁶⁸⁴Nach dem Entfernen des Überstandswassers das Sediment homogenisieren und in ein geeignetes Behältnis geben. ²⁶⁸⁵Das Gewicht der feuchten Sedimentprobe protokollieren. |
| 56. | ²⁶⁸⁶Wenn zusätzlich die Prüfchemikalie im Porenwasser analysiert werden muss, homogenisierte und abgewogene Sedimentproben zentrifugieren, um das Porenwasser zu erhalten. ²⁶⁸⁷Beispiel: Etwa 200 ml feuchtes Sediment in Zentrifugiergläser mit einem Füllinhalt von 250 ml geben. ²⁶⁸⁸Danach die Proben ohne Filtration zentrifugieren, um das Porenwasser zu isolieren (z. B. 30-60 min. mit 10 000 ± 600 × g höchstens bei Testtemperatur). ²⁶⁸⁹Nach dem Zentrifugieren Überstand abgießen oder mit einer Pipette aufnehmen und das Volumen protokollieren; dabei darauf achten, dass keine Sedimentpartikel eingebracht werden. ²⁶⁹⁰Das Gewicht der verbliebenen Sedimentpellets notieren. ²⁶⁹¹Die Schätzung der Massenbilanz oder die Wiederfindung der Prüfchemikalie im Wasser-Sediment-System können erleichtert werden, wenn das Trockengewicht des Sediments an jedem Probenahmetag ermittelt wird. ²⁶⁹²Bei zu kleinen Probenvolumina kann es vorkommen, dass sich die Konzentrationen im Porenwasser nicht analysieren lassen. |
| 57. | ²⁶⁹³Wenn die Analyse nicht sofort durchgeführt wird, sind alle Proben in geeigneter Weise zu lagern, z. B. unter den empfohlenen Bedingungen, bei denen die jeweilige Prüfchemikalie am wenigsten abgebaut wird. ²⁶⁹⁴(Umweltproben beispielsweise bei –18 °C im Dunkeln lagern.) Vor Beginn der Prüfung sind Informationen über geeignete Lagerbedingungen für die jeweilige Prüfchemikalie (z. B. Dauer, Temperatur, Extraktionsverfahren usw.) einzuholen. |
Analysemethode | 58. | ²⁶⁹⁵Da Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit der für die Prüfchemikalie angewandten Analysemethode entscheidend für das gesamte Verfahren sind, muss experimentell überprüft werden, ob Präzision und Reproduzierbarkeit der chemischen Analyse sowie die Wiederfindung der Prüfchemikalie in Wasser- und Sedimentproben für die jeweilige Methode zumindest bei der niedrigsten und der höchsten Konzentration akzeptabel sind. ²⁶⁹⁶Außerdem muss gewährleistet werden, dass die Prüfchemikalie in den Prüfkammern nicht in Konzentrationen oberhalb der Bestimmungsgrenze nachweisbar ist. ²⁶⁹⁷Erforderlichenfalls sind die nominalen Konzentrationen für die Wiederfindung der Qualitätskontrolldotierungen zu korrigieren (z. B. wenn die Wiederfindungsrate außerhalb des Bereichs von 80-120 % des dotierten Volumens liegt). ²⁶⁹⁸Alle Proben sind während des Tests stets so zu handhaben, dass Verunreinigungen und Verluste (z. B. infolge der Adsorption der Prüfchemikalie an das Probenahmegerät) auf ein Mindestmaß beschränkt werden. |
| 59. | Die Wiederfindung der Prüfchemikalie, die Bestimmungsgrenze und die Nachweisgrenze in Sediment und Wasser sollten protokolliert und angegeben werden. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 60. | ²⁷⁰⁰Die wichtigsten statistisch auszuwertenden obligatorischen Endpunkte der Prüfung sind die Biomasse und die Gesamtzahl der Würmer pro Replikat. ²⁷⁰¹Optional könnten auch Reproduktion (Vermehrung der Würmer) und Wachstum (Zunahme der trockenen Biomasse) bewertet werden. ²⁷⁰²In diesem Fall sollte das Trockengewicht der Würmer zu Beginn der Exposition bestimmt werden (z. B. durch Messung des Trockengewichts einer repräsentativen Teilprobe der für die Prüfung zu verwendenden Charge synchronisierter Würmer). |
| 61. | ²⁷⁰³Die Mortalität ist bei dieser Prüfung zwar kein Endpunkt, sollte möglichst aber dennoch bewertet werden. ²⁷⁰⁴Zur Bestimmung der Mortalität sollten Wärmer, die auf einen leichten mechanischen Reiz nicht reagieren oder die Anzeichen von Zersetzung zeigen, sowie nicht aufzufindende Würmer als tot gelten. ²⁷⁰⁵Tote Würmer sollten zumindest protokolliert und bei der Auswertung der Testergebnisse berücksichtigt werden. |
| 62. | ²⁷⁰⁶Wirkungskonzentrationen sind in mg/kg Sedimenttrockenmasse auszudrücken. Wenn die Wiederfindungsrate der im Sediment oder in Sediment und Überstandswasser zu Beginn der Exposition gemessenen Prüfchemikalie zwischen 80 und 120 % der nominalen Konzentrationen liegt, können die Wirkungskonzentrationen (ECx, NOEC, LOEC) bezogen auf die nominalen Konzentrationen ausgedrückt werden. ²⁷⁰⁷Weicht die Wiederfindungsrate um mehr als ± 20 % von den nominalen Konzentrationen ab, so sind die Wirkungskonzentrationen (ECx, NOEC, LOEC) auf die zu Beginn der Exposition gemessenen Ausgangskonzentrationen zu beziehen, beispielsweise durch Berücksichtigung der Massenbilanz der Prüfchemikalie im Prüfsystem (siehe Nummer 30). ²⁷⁰⁸In diesen Fällen können zusätzliche Informationen aus der Analyse der Stammlösungen und/oder der Applikationslösungen bezogen werden, um zu bestätigen, dass die Testsedimente ordnungsgemäß hergestellt wurden. |
ECx | 63. | ²⁷⁰⁹Die ECx-Werte der unter Nummer 60 beschriebenen Parameter werden nach geeigneten statistischen Methoden berechnet (z. B. durch Probit-Analysen, Logit- oder Weibull-Transformationen, mit der Trimmed-Spearman-Karber-Methode oder durch einfache Interpolation). ²⁷¹⁰(15) und (50) enthalten Leitlinien für die statistische Auswertung. Ein ECx-Wert wird ermittelt, indem ein x % des Kontroll-Mittelwertes entsprechender Wert in die Gleichung eingefügt wird. Zur Berechnung des EC50-Wertes oder einen anderen ECx-Wertes sind die Mittelwerte (  ) der jeweiligen Behandlungsgruppen einer Regressionsanalyse zu unterziehen. |
NOEC/LOEC | 64. | ²⁷¹¹Wenn die NOEC-/LOEC-Werte durch statistische Analyse bestimmt werden sollen, sind Ergebnisse aus den einzelnen Gefäßen erforderlich, (wobei die einzelnen Gefäße als Replikate zu betrachten sind). ²⁷¹²Es sollten geeignete statistische Methoden angewendet werden. ²⁷¹³Im Allgemeinen werden schädliche Wirkungen der Prüfchemikalie im Vergleich zur Kontrolle einer einseitigen (kleineren) Hypothesenprüfung bei p ≤ 0,05 unterzogen. ²⁷¹⁴In den folgenden Absätzen werden einige Beispiele gegeben. ²⁷¹⁵Empfehlungen für geeignete statistische Methoden finden sich unter (15) und (50). |
| 65. | ²⁷¹⁶Die Normalverteilung von Daten kann z. B. anhand der Kolmogorov-Smirnov-Methode (‚Goodness-of-Fit‘-Test), anhand einer Prüfung zur Ermittlung des Quotienten aus Spannweite und Standardabweichung (range to standard deviation ratio, R/s-Test) oder anhand des Shapiro-Wilk-Tests (zweiseitig, p ≤ 0,05) untersucht werden. ²⁷¹⁷Mit dem Cochran-Test, dem Levene-Test oder dem Bartlett-Test (zweiseitig, p ≤ 0,05) kann die Varianzhomogenität geprüft werden. ²⁷¹⁸Wenn die Bedingungen parametrischer Testverfahren (Untersuchung auf Normalverteilung und Varianzhomogenität) erfüllt sind, können eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) und anschließend multiple Vergleichstests durchgeführt werden. ²⁷¹⁹Mit paarweisen Vergleichstests (z. B. mit dem Dunnett-t-Test) oder Step-down-Trendtests (z. B. dem Williams-Test) kann berechnet werden, ob zwischen den Kontrollen und den verschiedenen Prüfchemikalienkonzentrationen signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) bestehen. ²⁷²⁰Andernfalls sollten nicht parametrische Methoden (z. B. ein U-Test mit Bonferroni-/Holm-Korrektur oder ein Jonckheere-Terpstra-Trendtest) verwendet werden, um den NOEC- und LOEC-Wert zu bestimmen. |
Limit-Test | 66. | ²⁷²¹Wenn ein Limit-Test (Vergleich der Kontrolle mit einer einzigen Prüfkonzentration) durchgeführt wurde und die Voraussetzungen für parametrische Testverfahren (Normalität und Homogenität) erfüllt sind, können metrische Antworten (Gesamtzahl der Würmer und Biomasse ausgedrückt als Trockengewicht der Würmer) mit einem Student-Test (t-Test) ausgewertet werden. ²⁷²²Sind diese Bedingungen nicht erfüllt, so kann ein t-Test für ungleiche Varianzen (Welch-Test) oder ein nicht-parametrischer Test wie der Wilcoxon-Mann-Whithey-U-Test verwendet werden. Für Informationen zur statistischen Aussagekraft von Hypothesenprüfungen im Rahmen des Ringtests dieser Methode siehe Anlage 6. |
| 67. | ²⁷²³Um signifikante Unterschiede zwischen den Kontrollen (Kontrolle und Lösungsmittelkontrolle) zu ermitteln, können die Replikate der einzelnen Kontrollen wie beim Limit-Test geprüft werden. ²⁷²⁴Werden bei diesen Tests keine signifikanten Unterschiede festgestellt, können alle Replikate (Kontrolle und Lösungsmittelkontrolle) gepoolt werden. ²⁷²⁵Andernfalls alle Behandlungen mit der Lösungsmittelkontrolle vergleichen. |
Auswertung der Ergebnisse | 68. | ²⁷²⁶Die Ergebnisse sind mit Vorsicht zu interpretieren, wenn von dieser Prüfmethode abgewichen wurde und wenn gemessene Testkonzentrationen nahe an der Nachweisgrenze des angewandten Analyseverfahrens liegen. ²⁷²⁷Jegliche Abweichung von dieser Prüfmethode ist zu protokollieren. |
Prüfbericht | 69. | Der Prüfbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten:- —
- Prüfchemikalie:
| — | chemische Kenndaten (Common name, chemische Bezeichnung, Strukturformel, CAS-Nummer usw.) einschließlich Reinheitsgrad und Analyseverfahren zur Quantifizierung der Chemikalie, Herkunft der Prüfchemikalie, Identität und Konzentration etwa verwendeter Lösungsmittel; |
| — | alle verfügbaren Informationen über die physikalische Beschaffenheit und die physikalisch-chemischen Eigenschaften, bei sie bei Beginn des Versuchs ermittelt wurden (z. B. Wasserlöslichkeit, Dampfdruck, Koeffizient der Verteilung im Boden (bzw. ggf. im Sediment), log Kow, Stabilität in Wasser usw.); |
- —
- Testspezies:
| — | wissenschaftlicher Name, Herkunft, etwaige Vorbehandlungen, Akklimatisierung, Kulturbedingungen usw.; |
- —
- Prüfbedingungen:
| — | angewandtes Testverfahren (z. B. statisch, semistatisch oder Durchfluss); |
| — | Versuchsplan (z. B. Anzahl, Material und Größe der Prüfkammern, Wasservolumen pro Gefäß, Sedimentmasse und Volumen pro Gefäß (bei Durchflussverfahren und semistatischen Verfahren: Wasseraustauschrate), Belüftung vor und während des Versuchs, Anzahl Replikate, Anzahl Würmer je Replikat zu Beginn der Exposition, Anzahl Testkonzentrationen, Dauer der Konditionierung, Äquilibirierungs- und Expositionsdauer, Häufigkeit der Probennahmen); |
| — | Tiefe des Sediments und des Überstandswassers; |
| — | Methode der Vorbehandlung der Prüfchemikalie und der Dotierung/Applikation; |
| — | nominelle Prüfkonzentrationen, Einzelheiten zur Entnahme von Proben für chemische Analysen und die Analysemethoden, mit denen die Konzentrationen der Prüfchemikalie ermittelt wurden; |
| — | Sedimentmerkmale gemäß den Nummern 24 und 25; sonstige vorgenommene Messungen; Herstellung des formulierten Sediments; |
| — | Aufbereitung des Prüfwassers vor Beginn des Versuchs (falls rekonstituiertes Wasser verwendet wird) und Merkmale des Wassers (Sauerstoffgehalt, pH-Wert, Leitfähigkeit, Härte und andere vorgenommene Messungen); |
| — | Angaben zur Fütterung, einschließlich Art des Futters, Präparation, Menge und Fütterungsregime; |
| — | Lichtintensität und Hell-/Dunkelphase(n); |
| — | Methoden zur Ermittlung aller biologischen Parameter (z. B. Probenahme, Kontrolle, Wiegen der Testorganismen) sowie aller abiotischen Parameter (z. B. Parameter für Wasser- und Sedimentqualität); |
| — | Volumina und/oder Gewichte aller Proben für die chemische Analyse; |
| — | genaue Informationen über die Behandlung aller Proben für die chemische Analyse einschließlich Angaben zu Aufbereitung, Lagerung, Dotierungsverfahren, Entnahme- und Analyseverfahren (einschließlich Genauigkeit) für die jeweilige Prüfchemikalie und Wiederfindungsraten der Prüfchemikalie. |
- —
- Ergebnisse:
| — | Qualität des Wassers in den Prüfgefäßen (pH-Wert, Temperatur, Gehalt an gelöstem Kohlenstoff, Härte, Ammoniakkonzentrationen und andere vorgenommene Messungen); |
| — | gesamter organischer Kohlenstoff (TOC), Verhältnis Trockenmasse/Feuchtmasse, pH-Wert des Sediments und andere vorgenommene Messungen; |
| — | Gesamtzahl sowie — falls bestimmt — die Zahl der vollständigen und nicht mehr vollständigen Würmer in den einzelnen Prüfkammern am Ende des Versuchs; |
| — | Trockengewicht der Würmer in den einzelnen Prüfkammern am Ende des Versuchs und — falls gemessen — Trockengewicht einer Würmer-Teilprobe zu Beginn des Versuchs; |
| — | alle festgestellten anomalen Verhaltensweisen im Vergleich zu den Kontrollen (z. B. Meiden des Sediments, Vorkommen oder Fehlen von Fäkalpellets); |
| — | festgestellte Todesfälle; |
| — | Schätzwerte für toxische Endpunkte, z. B. ECx, NOEC- und/oder LOEC-Werte und die für ihre Bestimmung angewandten statistischen Methoden; |
| — | die nominalen Prüfkonzentrationen, die gemessenen Prüfkonzentrationen und die Ergebnisse sämtlicher Analysen zur Bestimmung der Konzentration der Prüfchemikalie in den Prüfgefäßen; |
| — | jegliche Abweichungen von den Validitätskriterien. |
- —
- Auswertung der Ergebnisse:
| — | Übereinstimmung der Ergebnisse mit den Validitätskriterien gemäß in Nummer 13; |
| — | Diskussion der Ergebnisse einschließlich Auswirkungen auf das Testergebnis, die auf Abweichungen von dieser Prüfmethode zurückzuführen sind. |
|
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²⁹⁰⁰Finney, D.J. (1978). ²⁹⁰¹Statistical Method in Biological Assay. ²⁹⁰²Charles Griffin & Company Ltd, London.
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²⁹²⁴Williams, D.A. (1972). ²⁹²⁵The comparison of several dose levels with a zero dose control. ²⁹²⁶Biometrics 28, 519 531.
Anlage 1
Begriffsbestimmungen
Für diese Prüfmethode gelten folgende Definitionen:
Äquilibrierungszeitraum: die für die Verteilung der Prüfchemikalie zwischen Festphase, Porenwasser und Überstandswasser vorgesehene Zeit; die Äquilibierung erfolgt nach dem Dotieren des Sediments mit der Prüfchemikalie und vor Zugabe der Testorganismen.
Chemikalie: ein Stoff oder ein Gemisch.
Dotiertes Sediment: Sediment, dem die Prüfchemikalie hinzugefügt wurde.
ECx: Konzentration der Prüfchemikalie im Sediment, bei der es innerhalb einer gegebenen Expositionsdauer zu einer X %-Wirkung (z. B. 50 %) auf einen biologischen Parameter kommt.
Expositionsphase/Expositionsdauer: die Zeit, während der die Testorganismen der Prüfchemikalie ausgesetzt sind.
Formuliertes Sediment oder rekonstituiertes/künstliches/synthetisches Sediment: ein Gemisch aus Stoffen, das die physikalischen Bestandteile eines natürlichen Sediments simulieren soll.
Konditionierungszeitraum: die für die Stabilisierung des Mikrobenbestandteils des Sediments und die Abtrennung von beispielsweise aus Sedimentbestandteilen stammendem Ammoniak vorgesehene Zeit; die Konditionierung erfolgt vor dem Dotieren des Sediments mit der Prüfchemikalie. Gewöhnlich wird das Überstandswasser nach dem Konditionieren verworfen.
LOEC (Niedrigste messbare Konzentration mit statistisch signifikanter Wirkung): niedrigste geprüfte Konzentration einer Prüfchemikalie, bei der beobachtet wird, dass sie im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante toxische Wirkung hat (p ≤ 0,05); allerdings müssen alle Testkonzentrationen über der LOEC eine Wirkung zeigen, die der LOEC-Wirkung gleichwertig ist oder darüber liegt. Sind diese beiden Bedingungen nicht erfüllt, ist genau zu begründen, warum die LOEC (und entsprechend die NOEC) gewählt wurde.
NOEC (Höchste messbare Konzentration ohne statistisch signifikante Wirkung): Prüfkonzentration unmittelbar unterhalb der LOEC, die im Vergleich zur Kontrolle während einer bestimmten Expositionsdauer keine statistisch signifikante Wirkung (p ≤ 0,05) zeigt.
Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient (Kow; manchmal auch ausgedrückt als Pow): bezeichnet das Verhältnis der Löslichkeit einer Chemikalie in n-Octanol und Wasser im Gleichgewicht und zeigt die Fettlöslichkeit einer Chemikalie an (Kapitel A.24 in diesem Anhang). Kow oder der Logarithmus von Kow (log Kow) gilt als Maß für das Potenzial einer Chemikalie zur Anreicherung in aquatischen Organismen.
Organischer Kohlenstoff/Wasser-Verteilungskoeffiozient (Koc): bezeichnet das Verhältnis zwischen der Konzentration der Chemikalie im/am organischen Kohlenstoff im Sediment und der Konzentration der Chemikalie im Wasser im Gleichgewicht.
Porenwasser oder Interstitialwasser: Wasser in den Hohlräumen zwischen Sediment- oder Bodenpartikeln.
Prüfchemikalie: ein beliebiger Stoff oder ein beliebiges Gemisch, der bzw. das nach dieser Methode geprüft wird.
Überstandswasser: das im Prüfgefäß über dem Sediment stehende Wasser.
Anlage 2
Zusammensetzung des empfohlenen rekonstituierten Wassers
(übernommen aus Kapitel C.1 dieses Anhangs (1))
| a) | Calciumchloridlösung11,76 g CaCl2 2H2O in entionisiertem Wasser lösen; anschließend mit entionisiertem Wasser bis auf 1 Liter auffüllen. |
| b) | Magnesiumsulfatlösung4,93 g MgSO4 7H2O in entionisiertem Wasser lösen; anschließend mit entionisiertem Wasser bis auf 1 Liter auffüllen. |
| c) | Natriumbicarbonatlösung2,59 g NaHCO3 in entionisiertem Wasser lösen; anschließend mit entionisiertem Wasser bis auf 1 Liter auffüllen. |
| d) | Kaliumchloridlösung0,23 g KCl in entionisiertem Wasser lösen; anschließend mit entionisiertem Wasser bis auf 1 Liter auffüllen. |
Alle Chemikalien müssen Analysequalität haben.Die Leitfähigkeit des destillierten oder entionisierten Wassers darf höchstens 10 μScm– 1 betragen.
²⁹⁴⁹Von den Lösungen a bis d jeweils 25 ml mischen und das Gesamtvolumen mit entionisiertem Wasser bis auf 1 Liter auffüllen. ²⁹⁵⁰Die Summe der Ca- und Mg-Ionen in diesen Lösungen beträgt 2,5 mmol/l.
Das Verhältnis der Ca- zu den Mg-Ionen beträgt 4:1 und das der Na- zu den K-Ionen 10:1. Die Gesamtalkalinität KS4,3 dieser Lösung beträgt 0,8 mmol/l.
Das Wasser bis zur Sauerstoffsättigung belüften und anschließend ohne weitere Belüftung bis zur Verwendung zwei Tage lagern.
BEZUGSQUELE
| (1) | Kapitel C.1 dieses Anhangs, Akute Toxizität für Fische. |
Anlage 3Physikalisch-Chemische Eigenschaften eines geeigneten Testwassers
| Bestandteil | Konzentrationen | | Partikel | < 20 mg/l | | Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff | < 2 μg/l | | Nichtionisierter Ammoniak | < 1 μg/l | | Restchlor | < 10 μg/l | | Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden plus polychlorierten Biphenylen | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an organischem Chlor | < 25 ng/l | | (übernommen aus OECD (1992) (1)) |
BEZUGSQUELLE | (1) | OECD (1992). ²⁹⁵⁵Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. ²⁹⁵⁶Fish, Early-life Stage Toxicity Test. ²⁹⁵⁷OECD, Paris. |
Anlage 4Empfohlenes künstliches Sediment — Empfehlungen für Herstellung und Lagerung
Bestandteile des Sediments
| Bestandteil | Beschreibung | in % des Sediment-trockengewichts | | Torf | Sphagnum-Torf, Zersetzungsgrad: ‚mittel‘, luftgetrocknet, ohne sichtbare Pflanzenreste, fein gemahlen (Partikelgröße ≤ 0,5 mm). | 5 ± 0,5 | | Quarzsand | Korngröße: ≤ 2 mm, aber > 50 % der Partikel sollten eine Größe im Bereich 50-200 μm haben. | 75-76 | | Kaolin-Ton | Kaolinitgehalt ≥ 30 % | 20 ± 1 | | Futter | z. B. Nesselpulver (Folia urticae), Blätter von Urtica dioica (Brennnessel), fein gemahlen (Partikelgröße ≤ 0,5 mm); nach Arzneimittelstandards, zum menschlichen Verzehr geeignet; zusätzlich zum trockenen Sediment | 0,4-0,5 % | | Organischer Kohlenstoff | eingestellt durch Zugabe von Torf und Sand | 2 ± 0.5 | | Calciumcarbonat | CaCO3, in Pulverform, chemisch rein, zusätzlich zum trockenen Sediment | 0,05-1 | | Entionisiertes Wasser | Leitfähigkeit ≤ 10 μS/cm, zusätzlich zum trockenen Sediment | 30-50 |
Hinweis: Ist mit hohen Ammoniakkonzentrationen zu rechnen (wenn beispielsweise bekannt ist, dass die Prüfchemikalie die Nitrifikation hemmt), kann es sinnvoll sein, 50 % des stickstoffreichen Nesselpulvers durch Cellulose (z. B. α-Cellulosepulver, chemisch rein, Partikelgröße ≤ 0,5 mm (1) (2)) zu ersetzen.Herstellung
Den Torf lufttrocknen und zu feinem Pulver vermahlen. ²⁹⁶²Mithilfe eines leistungsstarken Homogenisierapparats eine Suspension der erforderlichen Menge Torfpulver in entionisiertem Wasser herstellen. Den pH-Wert dieser Suspension mit CaCO3 auf 5,5 ± 0,5 einstellen. ²⁹⁶³Die Suspension bei 20 ± 2 °C für mindestens zwei Tage unter sanftem Rühren konditionieren, um den pH-Wert zu stabilisieren und einen stabilen mikrobiellen Anteil zu sichern. ²⁹⁶⁴Den pH-Wert erneut messen; er sollte bei 6,0 ± 0,5 liegen. ²⁹⁶⁵Anschließend die anderen Bestandteile (Sand und Kaolin-Ton) sowie entionisiertes Wasser zur Torf-Suspension hinzugeben und zu einem homogenen Sediment vermischen, dessen Wassergehalt 30-50 % des Trockengewichts des Sediments ausmachen sollte. Den pH-Wert der fertigen Mischung erneut messen und erforderlichenfalls mit CaCO3 auf 6,5-7,5 einstellen. ²⁹⁶⁶Ist jedoch mit Ammoniakbildung zu rechnen, kann es sinnvoll sein, den pH-Wert des Sediments unter 7,0 zu halten (z. B. zwischen 6,0 und 6,5). ²⁹⁶⁷Sedimentproben entnehmen, um das Trockengewicht und den Gehalt an organischem Kohlenstoff zu bestimmen. ²⁹⁶⁸Ist mit Ammoniakbildung zu rechnen, kann das formulierte Sediment sieben Tage lang unter Testbedingungen konditioniert werden (z. B. Sediment/Wasser-Verhältnis von 1:4, Tiefe der Sedimentschicht wie in den Prüfgefäßen), bevor es mit der Prüfchemikalie dotiert wird, d. h. das Sediment ist mit belüftetem Wasser aufzufüllen. ²⁹⁶⁹Nach dieser Konditionierung das Überstandswasser entfernen und verwerfen. ²⁹⁷⁰Anschließend den dotierten Quarzsand mit dem Sediment in den verschiedenen Konzentrationen mischen; das Sediment auf die Replikatgefäße verteilen und mit Testwasser auffüllen. ²⁹⁷¹Die Gefäße unter den Testbedingungen inkubieren. ²⁹⁷²Hier beginnt die Äquilibrierzeit. ²⁹⁷³Das Überstandswasser sollte belüftet werden.
²⁹⁷⁴Das gewählte Futter hingegeben, bevor oder während das Sediment mit der Prüfchemikalie dotiert wird. ²⁹⁷⁵Es kann anfänglich mit der Torfsuspension gemischt werden (s. o.). ²⁹⁷⁶Eine allzu starke Verschlechterung der Futterqualität vor dem Einsetzen der Testorganismen (z. B. bei langer Äquilibrierzeit) kann vermieden werden, indem der Zeitraum zwischen der Futterzugabe und dem Beginn der Exposition so kurz wie möglich gehalten wird. ²⁹⁷⁷Um sicherzustellen, dass das Futter mit der Prüfchemikalie dotiert wird, sollte das Futter spätestens am Tag der Dotierung mit dem Sediment vermischt werden.
Lagerung
Die trockenen Bestandteile des künstlichen Sediments können an einem trockenen und kühlen Ort oder bei Raumtemperatur gelagert werden. ²⁹⁷⁹Aufbereitetes und mit der Prüfchemikalie dotiertes Sediment ist umgehend im Versuch zu verwenden. ²⁹⁸⁰Proben des dotierten Sediments können bis zur Analyse unter den für die jeweilige Prüfchemikalie empfohlenen Testbedingungen gelagert werden.
LITERATUR
| (1) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J., und Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. ²⁹⁸²In Zusammenarbeit mit R. ²⁹⁸³Nagel und B. ²⁹⁸⁴Karaoglan. ²⁹⁸⁵Bericht an das Umweltbundesamt Berlin, FKZ 202 67 429, R&D Nr. 202 67 429. |
| (2) | Liebig, M., Meller, M. ²⁹⁸⁷und Egeler, P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten — Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. ²⁹⁸⁸Seminarunterlagen 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. 24./25. März 2004. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblenz, Deutschland, S. 107-119. |
Anlage 5Kulturmethoden für Lumbriculus variegatus
Der Glanzwurm Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta, lebt in Süßwassersedimenten und wird häufig in Ökotoxizitätsprüfungen verwendet. ²⁹⁹⁰Er kann unter Laborbedingungen kultiviert werden. ²⁹⁹¹Im Folgenden werden die Kulturmethoden beschrieben.
Kulturmethoden
Die Kulturbedingungen für Lumbriculus variegatus sind in Phipps et al. ²⁹⁹³(1993) (1), Brunson et al. ²⁹⁹⁴(1998) (2), ASTM (2000) (3) und U.S. EPA (2000) (4) eingehend beschrieben und werden nachstehend kurz zusammengefasst. Ein großer Vorteil von L. variegatus ist seine rasche Vermehrung, die dazu führt, dass die Biomasse in laborgezogenen Populationen schnell zunimmt (z. B. (1)(3)(4)(5)).
²⁹⁹⁶Die Würmer können in großen Aquarien (57-80 l) bei 23 °C mit Hell-/Dunkelphasen von 16 L: 8 D (100 – 1 000 lx) in täglich erneuertem natürlichen Wasser (45-50 l pro Aquarium) gezüchtet werden. Das Substrat wird hergestellt, indem ungebleichte braune Papiertücher in Streifen geschnitten und einige Sekunden mit Kulturwasser befeuchtet werden, so dass ein Substrat aus kleinen Papierteilchen entsteht, das unverzüglich in auf dem Boden des Lumbriculus-Zuchtaquariums verteilt werden kann; es kann aber auch in entionisiertem Wasser bis zur späteren Verwendung gefriergelagert werden. ²⁹⁹⁷Im Aquarium hält sich das frische Substrat für etwa zwei Monate.
²⁹⁹⁸Jede Wurmkultur wird mit 500-1 000 Würmern angesetzt, die unter Wasseraustausch- oder -durchflussbedingungen dreimal wöchentlich mit einer 10 ml-Suspension aus 6 g Forellen-Starterfutter gefüttert werden. ²⁹⁹⁹Um Bakterien- und Pilzwachstum entgegenzuwirken, werden statische und semistatische Kulturen seltener gefüttert.
Unter diesen Bedingungen verdoppelt sich die Zahl der Tiere in der Kultur gewöhnlich in 10-14 Tagen.
³⁰⁰¹Alternativ kann Lumbriculus variegatus auch in einem System bestehend aus einer 1-2 cm tiefen Schicht Quarzsand (wie im künstlichen Sediment verwendet) und rekonstituiertem Wasser kultiviert werden. ³⁰⁰²Als Kulturgefäße kommen 12-20 cm hohe Glas- oder Edelstahlbehältnisse in Frage. ³⁰⁰³Der Wasserkörper ist mit einer Pasteur-Pipette, die etwa 2 cm über der Sedimentoberfläche positioniert wird, sanft zu belüften (z. B. 2 Blasen pro Sekunde). ³⁰⁰⁴Um eine Akkumulation z. B. von Ammoniak zu vermeiden, ist das Überstandswasser über ein Durchflusssystem zu erneuern oder mindestens zweimal wöchentlich manuell auszutauschen. ³⁰⁰⁵Die Oligochaeten können bei Raumtemperatur mit Hell-/Dunkelphasen von 16 Stunden (Lichtintensität 100-1 000 lx) bzw. 8 Stunden gehalten werden. In der semistatischen Kultur (Wasseraustausch einmal pro Woche) werden die Würmer zweimal wöchentlich mit TetraMin gefüttert (z. B. 0,6-0,8 mg pro cm2 Sedimentoberfläche); das Futter kann als Suspension aus 50 mg TetraMin pro ml entionisiertem Wasser verabreicht werden.
Lumbriculus variegatus können beispielsweise durch Sieben des Substrats durch ein feinmaschiges Sieb in ein separates Becherglas oder durch Aufnahme (mit einer feuerpolierten Glaspipette mit weiter Öffnung von ca. ³⁰⁰⁷5 mm Durchmesser) aus den Kulturen entnommen werden und in ein Becherglas eingesetzt werden. ³⁰⁰⁸Wenn gleichzeitig auch das Substrat in das Becherglas gegeben wird, dieses würmer- und substrathaltige Glas über Nacht bei kontinuierlichem Wasserdurchfluss ruhen lassen, um das Substrat auszuspülen; die Würmer bleiben auf dem Gefäßboden zurück. ³⁰⁰⁹Anschließend können die Würmer in neu aufbereitete Kulturgefäße gesetzt oder im Test weiterverwendet werden, wie unter (3) und (4) oder in den folgenden Absätzen beschrieben.
Ein Punkt, der bei der Verwendung von L. variegatus in Sedimenttests kritisch zu bewerten ist, betrifft die Reproduktionsform der Art (Architomie oder Morphallaxis, z. B. (6)). Diese geschlechtslose Vermehrung führt zur Entstehung von zwei Fragmenten, die so lange keine Nahrung aufnehmen, bis sich das Kopf- bzw. das Schwanzende regeneriert hat (z. B. (7)(8)), d. h. es kommt nicht zur kontinuierlichen Exposition durch Aufnahme kontaminierten Sediments.
³⁰¹²Folglich sollte eine Synchronisierung vorgenommen werden, um eine unkontrollierte Reproduktion und Regeneration und sich daraus ergebende stark variierende Testergebnisse auf ein Mindestmaß zu begrenzen. ³⁰¹³Derartige Variationen können auftreten, wenn einzelne Exemplare fragmentiert haben und über einen bestimmten Zeitraum keine Nahrung aufnehmen und der Prüfchemikalie deshalb weniger stark ausgesetzt sind als andere Exemplare, bei denen es während des Tests nicht zur Fragmentierung kam (9)(10)(11). ³⁰¹⁴10-14 Tage vor Beginn der Exposition sollten die Würmer künstlich zerteilt werden (Synchronisierung). ³⁰¹⁵Für die Synchronisierung werden große (adulte) Würmer ausgewählt, die vorzugsweise keine Anzeichen einer kürzlich erfolgten Morphallaxis aufweisen sollten. ³⁰¹⁶Diese Würmer können auf einen Glasträger in einen Tropfen Kulturwasser gesetzt und in der Körpermitte mit einem Skalpell zerteilt werden. ³⁰¹⁷Dabei ist darauf zu achten, dass die hinteren Enden ähnlich groß sind. ³⁰¹⁸Es bleibt abzuwarten, bis die hinteren Enden in einem Kulturgefäß, das dasselbe Substrat wie die Testkultur und rekonstituiertes Wasser enthält, neue Köpfe bilden. ³⁰¹⁹Erst dann kann mit der Exposition begonnen werden. ³⁰²⁰Die Kopfteile gelten dann als regeneriert, wenn die synchronisierten Würmer sich im Substrat eingraben. ³⁰²¹(Ob sich Kopfteile regeneriert haben, kann auch durch Sichtprüfung einer repräsentativen Teilprobe unter einem binokularen Mikroskop festgestellt werden.) Danach kann davon ausgegangen werden, dass sich die Testorganismen in einem physiologisch ähnlichen Zustand befinden. ³⁰²²Wenn sich die synchronisierten Würmern dann während des Versuchs durch Morphallaxis reproduzieren, bedeutet dies, dass praktisch alle Tiere dem dotierten Sediment gleichermaßen ausgesetzt waren. ³⁰²³Die synchronisierten Würmer sollten einmal gefüttert werden, sobald sie beginnen, sich in das Substrat einzugraben, oder 7 Tage nach dem Zerteilen. ³⁰²⁴Das Fütterungsregime sollte jedoch in etwa das gleiche sein wie bei regulären Kulturen; es kann jedoch sinnvoll sein, dasselbe Futter zu verwenden wie im eigentlichen Test. ³⁰²⁵Die Würmer sollten bei Testtemperatur gehalten werden (d. h. bei 20 ± 2 °C). ³⁰²⁶Nach der Regeneration werden unversehrte, intakte Würmer, die nach einem leichten mechanischen Reiz aktiv schwimmen oder zu kriechen beginnen, für die Prüfung verwendet. ³⁰²⁷Verletzungen und Autotomie sind zu vermeiden, indem zum Hantieren der Würmer beispielsweise Pipetten mit feuerpolierten Kanten oder Edelstahl-Zahnstocher verwendet werden.
Bezugsquellen für Starterkulturen von Lumbriculus variegatus (Anschriften in den USA übernommen aus (4))
| Europa | | ECT Oekotoxikologie GmbH | | Böttgerstr. 2-14 | | D-65439 Flörsheim/Main | | Deutschland |
| | Bayer Crop Science AG | | Development — Ecotoxicology | | Alfred-Nobel-Str. 50 | | D-40789 Monheim | | Deutschland |
| | | | University of Joensuu | | Laboratory of Aquatic Toxicology | | Dept. of Biology | | Yliopistokatu 7, P.O. Box 111 | | FIN-80101 Joensuu | | Finnland |
| | Dresden University of Technology | | Institut für Hydrobiologie | | Fakultät für Forst-, Geo- und Hydrowissenschaften | | Mommsenstr. 13 | | D-01062 Dresden | | Deutschland |
| | | | C.N.R.- I.R.S.A. | | Italian National Research Council | | Water Research Institute | | Via Mornera 25 | | I-20047 Brugherio MI |
| | | | | USA. | | U.S. Environmental Protection Agency | | Mid-Continent Ecological Division | | 6201 Congdon Boulevard | | Duluth, MN 55804 |
| | Michigan State University | | Department of Fisheries and Wildlife | | No. 13 Natural Resources Building | | East Lansing, MI 48824-1222 |
| | | | U.S. Environmental Protection Agency | | Environmental Monitoring System Laboratory | | 26 W. Martin Luther Dr. | | Cincinnati, OH 45244 |
| | Wright State University | | Institute for Environmental Quality | | Dayton, OH 45435 |
| | | | Columbia Environmental Research Center | | U.S. Geological Survey | | 4200 New Haven Road | | Columbia, MO 65201 |
| | Great Lakes Environmental Research | | Laboratory, NOAA | | 2205 Commonwealth Boulevard | | Ann Arbor, MI 48105-1593 |
|
LITERATUR | (1) | Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A., und Mattson, V.R. (1993). ³⁰³¹Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. ³⁰³²Environ.Toxicol. Chem. ³⁰³³12, 269-279. |
| (2) | Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J., und Kemble, N.E. (1998). ³⁰³⁵Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. ³⁰³⁶Arch.Environ. ³⁰³⁷Contam.Toxicol. ³⁰³⁸35, 191-201. |
| (3) | ASTM International (2000). ³⁰⁴⁰Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. ³⁰⁴¹In ASTM International 2004 Annual Book of Standards. ³⁰⁴²Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology;Pesticides. ³⁰⁴³ASTM International, West Conshohocken, PA. |
| (4) | U.S. EPA (2000). ³⁰⁴⁵Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. ³⁰⁴⁶Second Edition. ³⁰⁴⁷EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, März 2000. |
| (5) | Kukkonen, J., und Landrum, P.F. (1994). ³⁰⁴⁹Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. ³⁰⁵⁰13, 1457-1468. |
| (6) | Drewes, C.D., und Fourtner, C.R. (1990). ³⁰⁵²Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. ³⁰⁵³138: 94-103. |
| (7) | Leppänen, M.T. und Kukkonen, J.V.K. (1998a). ³⁰⁵⁵Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. ³⁰⁵⁶17: 2196-2202. |
| (8) | Leppänen, M.T. und Kukkonen, J.V.K. (1998b). ³⁰⁵⁸Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). ³⁰⁵⁹Hydrobiologia 377: 183-194. |
| (9) | Brust, K., O. Licht, V. ³⁰⁶¹Hultsch, D. ³⁰⁶²Jungmann und R. ³⁰⁶³Nagel (2001). ³⁰⁶⁴Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. ³⁰⁶⁵Chemistry, Bd. ³⁰⁶⁶20, 2000-2007. |
| (10) | Oetken, M., K.-U. ³⁰⁶⁸Ludwichowski und R. ³⁰⁶⁹Nagel (2000). ³⁰⁷⁰Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. ³⁰⁷¹Im Auftrag des Umweltbundesamts Berlin, FKZ 360 12 001, März 2000. |
| (11) | Leppänen M.T., und Kukkonen, J.V.K. (1998). ³⁰⁷³Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccumulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. ³⁰⁷⁴32, 1503-1508. |
Anlage 6Zusammenfassung der Ergebnisse des Ringtests
‚Sedimenttoxizitätsprüfung mit Lumbriculus variegatus‘
Tabelle 1
Ergebnisse der einzelnen Ringtestdurchläufe: durchschnittliche Anzahl Würmer in den Kontrollen und in den Lösungsmittelkontrollen bei Testende; SD = Standardabweichung; CV = Variationskoeffizient
| Durch-schnittliche Anzahl Würmer in den Kontrollen | SD | CV (%) | N | Durch-schnittliche Anzahl Würmer in den Lösungsmittelkontrollen | SD | CV (%) | N | | 32,3 | 7,37 | 22,80 | 3 | 39,0 | 3,61 | 9,25 | 3 | | 40,8 | 6,55 | 16,05 | 6 | 36,0 | 5,29 | 14,70 | 3 | | 41,5 | 3,54 | 8,52 | 2 | 38,5 | 7,05 | 18,31 | 4 | | 16,3 | 5,99 | 36,67 | 6 | 30,8 | 6,70 | 21,80 | 4 | | 24,3 | 10,69 | 43,94 | 3 | 26,3 | 3,06 | 11,60 | 3 | | 28,5 | 8,29 | 29,08 | 4 | 30,7 | 1,15 | 3,77 | 3 | | 28,3 | 3,72 | 13,14 | 6 | 28,8 | 2,56 | 8,89 | 6 | | 25,3 | 5,51 | 21,74 | 3 | 27,7 | 1,53 | 5,52 | 3 | | 23,8 | 2,99 | 12,57 | 4 | 21,3 | 1,71 | 8,04 | 4 | | 36,8 | 8,80 | 23,88 | 6 | 35,0 | 4,20 | 11,99 | 6 | | 33,0 | 3,58 | 10,84 | 6 | 33,5 | 1,73 | 5,17 | 4 | | 20,7 | 2,73 | 13,22 | 6 | 15,0 | 6,68 | 44,56 | 4 | | 42,0 | 7,07 | 16,84 | 6 | 43,7 | 0,58 | 1,32 | 3 | | 18,2 | 3,60 | 19,82 | 6 | 21,7 | 4,04 | 18,65 | 3 | | 32,0 | 3,95 | 12,34 | 6 | 31,3 | 4,79 | 15,32 | 4 | | Durchschnitts-werte der beteiligten Labors | 29,59 | | 20,10 | | 30,61 | | 13,26 | | | SD | 8,32 | | 10,03 | | 7,57 | | 10,48 | | | N | 15 | | | | 15 | | | | | Min | 16,3 | | | | 15,0 | | | | | Max | 42,0 | | | | 43,7 | | | | | CV (%) | 28,1 | | | | 24,7 | | | |
Tabelle 2
Ergebnisse der einzelnen Ringtestdurchläufe: durchschnittliches Gesamttrockengewicht der Würmer pro Replikat in den Kontrollen und in den Lösungsmittelkontrollen bei Testende; SD = Standardabweichung; CV = Variationskoeffizient
| Gesamttrockengewicht der Würmer pro Replikat (Kontrollen) | SD | CV (%) | N | Gesamttrockengewicht der Würmer pro Replikat (Lösungsmittelkontrollen) | SD | CV (%) | N | | 24,72 | 6,31 | 25,51 | 3 | 27,35 | 4,08 | 14,93 | 3 | | 30,17 | 2,04 | 6,75 | 6 | 33,83 | 10,40 | 30,73 | 3 | | 23,65 | 3,61 | 15,25 | 2 | 28,78 | 4,68 | 16,28 | 4 | | 12,92 | 6,83 | 52,91 | 6 | 24,90 | 6,84 | 27,47 | 4 | | 21,31 | 4,17 | 19,57 | 3 | 25,87 | 5,30 | 20,49 | 3 | | 22,99 | 4,86 | 21,16 | 4 | 24,64 | 5,09 | 20,67 | 3 | | 18,91 | 1,91 | 10,09 | 6 | 19,89 | 1,77 | 8,89 | 6 | | 24,13 | 1,63 | 6,75 | 3 | 25,83 | 2,17 | 8,41 | 3 | | 22,15 | 3,18 | 14,34 | 4 | 22,80 | 2,60 | 11,40 | 4 | | 35,20 | 8,12 | 23,07 | 6 | 31,42 | 8,45 | 26,90 | 6 | | 41,28 | 5,79 | 14,02 | 6 | 41,42 | 4,37 | 10,55 | 4 | | 15,17 | 5,78 | 38,09 | 6 | 10,50 | 3,42 | 32,53 | 4 | | 35,69 | 8,55 | 23,94 | 6 | 38,22 | 1,23 | 3,21 | 3 | | 19,57 | 5,21 | 26,65 | 6 | 28,58 | 6,23 | 21,81 | 3 | | 29,40 | 2,16 | 7,34 | 6 | 31,15 | 2,70 | 8,67 | 4 | | Durchschnitts-werte der beteiligten Labors | 25,15 | | 20,36 | | 27,68 | | 17,53 | | | SD | 7,87 | | 12,56 | | 7,41 | | 9,10 | | | N | 15 | | | | 15 | | | | | Min | 12,9 | | | | 10,5 | | | | | Max | 41,3 | | | | 41,4 | | | | | CV (%) | 31,3 | | | | 26,8 | | | |
Tabelle 3
PCP-Toxizität: Zusammenfassung der Endpunkte im Ringtest; Durchschnittswerte der beteiligten Labors für EC50, NOEC und LOEC; SD = Standardabweichung; CV = Variationskoeffizient
| Biologischer Parameter | | Durchschnittswert der beteiligten Labors (mg/kg) | min | max | Faktor der beteiligten Labors | SD | CV (%) | Geometr. Mittelwert (mg/kg) | | Gesamtzahl der Würmer | EC50 | 23,0 | 4,0 | 37,9 | 9,4 | 10,7 | 46,3 | 19,9 | | NOEC | 9,9 | 2,1 | 22,7 | 10,7 | 7,2 | 72,3 | 7,6 | | LOEC | 27,9 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 19,4 | 69,4 | 20,9 | | MDD (%) | 22,5 | 7,1 | 39,1 | | | | | | Gesamt-Trocken-gewicht Würmer | EC50 | 20,4 | 7,3 | 39,9 | 5,5 | 9,1 | 44,5 | 18,2 | | NOEC | 9,3 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,6 | 70,4 | 7,4 | | LOEC | 25,7 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 16,8 | 65,5 | 19,4 | | MDD (%) | 24,8 | 10,9 | 44,7 | | | | | | Mortalität/Überlebensrate | LC50 | 25,3 | 6,5 | 37,2 | 5,7 | 9,4 | 37,4 | 23,1 | | NOEC | 16,5 | 2,1 | 40,0 | 18,8 | 10,3 | 62,4 | 12,8 | | LOEC | 39,1 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 18,1 | 46,2 | 32,6 | | Reproduktion (Zunahme der Anzahl Würmer pro Replikat) | EC50 | 20,0 | 6,7 | 28,9 | 4,3 | 7,6 | 37,9 | 18,3 | | NOEC | 7,9 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 5,2 | 66,0 | 6,4 | | LOEC | 22,5 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,4 | 68,6 | 16,0 | | MDD (%) | 29,7 | 13,9 | 47,9 | | | | | | Wachstum (Zunahme der Biomasse pro Replikat) | EC50 | 15,3 | 5,7 | 29,9 | 5,2 | 7,1 | 46,5 | 13,7 | | NOEC | 8,7 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,0 | 68,1 | 6,9 | | LOEC | 24,0 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,7 | 65,5 | 17,3 | | MDD (%) | 32,2 | 13,6 | 65,2 | | | | | | MDD: Minimum Detectable Difference (kleinster nachweisbarer Unterschied) bei den Kontrollwerten während der Hypothesenprüfung; wird als Maßstab für die statistische Aussagekraft verwendet. |
LITERATUREgeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. und Gilberg, D. (2005). ³⁰⁷⁷Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test (Validierung eines endobenthischen Sedimenttests durch einen internationalen Ringtest). ³⁰⁷⁸In Zusammenarbeit mit R. ³⁰⁷⁹Nagel und B. ³⁰⁸⁰Karaoglan. ³⁰⁸¹Bericht an das Umweltbundesamt Berlin, FKZ 202 67 429.
C.36 REPRODUKTIONSTEST MIT RAUBMILBEN (HYPOASPIS (GEOLAELAPS) ACULEIFER) IN BODENPROBEN
EINLEITUNG
| 1. | ³⁰⁸²Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 226 (2008). ³⁰⁸³Sie wird zur Bewertung der Wirkung von im Boden befindlichen Chemikalien auf die Reproduktionsleistung der Bodenmilbenart Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer CANESTRINI (Acari: Laelapidae) verwendet und ermöglicht die Bestimmung der Hemmung der spezifischen Populationswachstumsrate (1,2). ³⁰⁸⁴Als Reproduktionsleistung wird hier die Anzahl der juvenilen Tiere am Ende des Versuchs bezeichnet. H. aculeifer stellt eine zusätzliche trophische Ebene dar für die Art, für die Prüfmethoden bereits verfügbar sind. ³⁰⁸⁶Ein Reproduktionstest ohne Unterscheidung und Quantifizierung der verschiedenen Stufen des Reproduktionszyklus wird für den Zweck dieser Prüfmethode als angemessen betrachtet. ³⁰⁸⁷Für Chemikalien mit einem anderen Expositionsszenarium als die Exposition über den Boden könnten andere Ansätze geeignet sein (3). |
| 2. | Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer wird als relevanter Vertreter der Bodenfauna im Allgemeinen und der Raubmilben im Besonderen betrachtet. ³⁰⁸⁹Die Art kommt weltweit vor (5) und ist leicht zu beschaffen und im Labor zu züchten. Anlage 7 enthält eine Zusammenfassung zur Biologie von H. aculeifer. ³⁰⁹⁰Für Hintergrundinformationen zur Ökologie der Milbenart und zu ihrer Verwendung in Ökotoxizitätsprüfungen siehe (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11) und (12). |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 3. | ³⁰⁹¹Adulte weibliche Tiere werden verschiedenen Konzentrationen der in den Boden gemischten Prüfchemikalie ausgesetzt. ³⁰⁹²Der Versuch wird mit 10 adulten Weibchen pro Replikatgefäß begonnen. ³⁰⁹³Männliche Tiere werden im Test nicht verwendet, weil sich gezeigt hat, dass sich weibliche Tiere unmittelbar oder kurz nachdem sie dem Deutonymphenstadium entwachsen sind, paaren, wenn männliche Tiere verfügbar sind. ³⁰⁹⁴Außerdem würde die Einbeziehung männlicher Tiere den Test so verzögern, dass eine (schwierige) Unterscheidung der Altersstufen erforderlich wäre. ³⁰⁹⁵Daher ist die Paarung der Tiere nicht Teil dieses Tests. ³⁰⁹⁶Die weiblichen Tiere werden 28-35 Tage nach Beginn der Eiablage in der Synchronisierung in den Test eingesetzt (siehe Anlage 4); zu diesem Zeitpunkt kann nämlich davon ausgegangen werden, dass die weiblichen Tiere sich bereits gepaart und die Präovipositionsperiode bereits durchlaufen haben. ³⁰⁹⁷Bei einer Temperatur von 20 °C endet der Test an Tag 14 nach dem Einsetzen der weiblichen Tiere (Tag 0); zu diesem Zeitpunkt können die ersten juvenilen Tiere der Kontrollgruppe bereits das Deutonymphen-Stadium durchlaufen haben (siehe Anlage 4). ³⁰⁹⁸Als wichtigste Messgrößen werden die Zahl der juvenilen Tiere pro Prüfgefäß und zusätzlich die Zahl der überlebenden weiblichen Tiere bestimmt. Die Reproduktionsleistung der Milben, die der Prüfchemikalie ausgesetzt waren, wird mit der Reproduktionsleistung der Kontrollen verglichen, um je nach Prüfprotokoll (siehe Nummer 29) den ECx-Wert (z. B. EC10 oder EC50) oder die höchste messbare Konzentration ohne statistisch signifikante Wirkung (NOEC — Begriffsbestimmungen siehe Anlage 1) zu ermitteln. ³⁰⁹⁹Anlage 8 enthält einen Überblick über das Prüfprotokoll. |
INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 4. | ³¹⁰⁰Die Wasserlöslichkeit, der log Kow-Wert, der Boden/Wasser-Verteilungskoeffizient und der Dampfdruck der Prüfchemikalie sollten möglichst bekannt sein. ³¹⁰¹Wünschenswert sind zudem Informationen über den Verbleib der Chemikalie im Boden (z. B. biotischer und abiotischer Abbau). |
| 5. | ³¹⁰²Diese Prüfmethode kann für wasserlösliche oder nicht wasserlösliche Chemikalien verwendet werden. ³¹⁰³Allerdings ist die Prüfchemikalie je nach Chemikalientyp unterschiedlich einzubringen. ³¹⁰⁴Für flüchtige Chemikalien (d. h. für Chemikalien, bei denen die Henry-Konstante oder der Luft-Wasser-Verteilungskoeffizient größer als eins ist) oder für Chemikalien, bei denen der Dampfdruck bei 25 °C mehr als 0,0133 Pa beträgt, ist die Prüfmethode nicht geeignet. |
VALIDITÄT DES TESTS | 6. | Damit ein Testergebnis als gültig gewertet werden kann, müssen die unbehandelten Kontrollen die folgenden Kriterien erfüllen:- —
- Die mittlere Mortalität adulter weiblicher Tiere sollte am Ende des Tests höchstens 20 % betragen.
- —
- Die mittlere Anzahl an juvenilen Tieren pro Replikat (in die jeweils 10 adulte weibliche Tiere eingesetzt wurden), sollte am Ende des Tests mindestens 50 betragen.
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- Der berechnete Variationskoeffizient für die Anzahl juveniler Tiere pro Replikat sollte am Ende des Reproduktionstests höchstens 30 % betragen.
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REFERENZCHEMIKALIE | 7. | ³¹⁰⁸Der ECx-Wert und/oder die NOEC einer Referenzchemikalie sind zu ermitteln, um angemessene Bedingungen für den Labortest sicherzustellen und um gewährleisten zu können, dass sich die Reaktion der Testorganismen im Laufe der Zeit nicht geändert hat. ³¹⁰⁹Dimethoat (CAS 60-51-5) ist eine geeignete Referenzchemikalie, die sich nachweislich auf die Populationsgröße auswirkt (4). ³¹¹⁰Alternativ kann als Referenzchemikalie auch Borsäure (CAS 10043-35-3) verwendet werden, für die allerdings weniger Erfahrungen vorliegen. Zwei Versuchspläne kommen in Betracht:- —
- Die Referenzchemikalie kann parallel zur Toxizitätsprüfung der einzelnen Prüfchemikalien in einer einzigen Konzentration getestet werden, die zuvor in einer Dosis-Wirkungs-Studie nachweislich zu einer Reduzierung der Anzahl juveniler Tiere um > 50 % geführt hat. In diesem Fall muss die Zahl der Replikate mit der Zahl der Kontrollen übereinstimmen (siehe Nummer 29).
- —
- ³¹¹²Alternativ kann die Referenzchemikalie ein- bis zweimal jährlich in einem Dosis-Wirkungs-Test geprüft werden. ³¹¹³Je nach Versuchsplan können sich die Zahl der Konzentrationen und der Replikate sowie der Abstandsfaktor (siehe Nummer 29) unterscheiden; es sollte jedoch eine Wirkung im Bereich von 10-90 % erzielt werden (Abstandsfaktor 1,8). Der EC50-Wert für Dimethoat basierend auf der Anzahl juveniler Tiere muss zwischen 3,0 und 7,0 mg Wirkstoff/kg Boden (bezogen auf das Trockengewicht) liegen. Nach den bislang erzielten Ergebnissen mit Borsäure sollte der EC50-Wert für die Anzahl juveniler Tiere zwischen 100 und 500 mg/kg Boden (bezogen auf das Trockengewicht) liegen.
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BESCHREIBUNG DES TESTSPrüfgefäße und Apparatur
| 8. | ³¹¹⁴Für den Versuch sollten Prüfgefäße aus Glas oder einem sonstigen chemisch inerten Material mit einem Durchmesser von 3-5 cm (bis zu einer Höhe von ≥ 1,5 cm mit Bodensubstrat befüllt) und mit dicht schließendem Deckel verwendet werden. ³¹¹⁵Vorzugsweise sollten die Gefäße einen Schraubverschluss besitzen, da diese Gefäße zweimal wöchentlich belüftet werden können. ³¹¹⁶Alternativ können Abdeckungen verwendet werden, die einen direkten Gasaustausch zwischen dem Substrat und der Atmosphäre zulassen (z. B. Gaze). ³¹¹⁷Da während des gesamten Tests ein hinreichend hoher Feuchtegehalt gewährleistet sein muss, muss das Gewicht der einzelnen Prüfgefäße im Laufe des Tests kontrolliert und gegebenenfalls Wasser nachgefüllt werden. ³¹¹⁸Besonders bei Gefäßen ohne Schraubverschluss kann dies wichtig sein. ³¹¹⁹Wenn ein nicht transparentes Prüfgefäß verwendet wird, muss die Abdeckung aus einem lichtdurchlässigen Material bestehen (z. B. einer perforierten transparenten Abdeckung) und gleichzeitig dafür sorgen, dass die Milben nicht aus dem Gefäß entweichen können. ³¹²⁰Größe und Typ der Prüfgefäße hängen von der Extraktionsmethode ab (siehe Anlage 5). ³¹²¹Wenn die Extraktion unter Wärmezufuhr unmittelbar aus dem Prüfgefäß erfolgt, kann ein Bodensieb mit geeigneter Maschenweite verwendet werden (das bis zur Extraktion verschlossen ist); der Boden muss tief genug sein, um das nötige Temperatur- und Feuchtegefälle zu gewährleisten. |
| 9. | Es wird die übliche Laborausrüstung insbesondere mit folgenden Bestandteilen benötigt:- —
- vorzugsweise Glasgefäße mit Schraubdeckeln;
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- Trockenschrank;
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- Stereomikroskop;
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- Pinsel zum Aufnehmen der Milben
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- pH-Messgerät und Luxmeter;
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- Waagen mit geeigneter Genauigkeit;
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- geeignete Vorrichtungen zur Temperaturregelung;
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- geeignete Ausrüstung zur Feuchtigkeitsregelung (nicht erforderlich, wenn die Expositionsgefäße mit Deckeln verschlossen werden);
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- Inkubator mit Temperaturregelung oder kleiner Raum;
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- Extraktionsvorrichtung (siehe Anlage 5) (13);
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- Beleuchtung von oben mit Regelung;
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- Gefäße zur Aufnahme der extrahierten Milben.
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Herstellung des künstlichen Bodens | 10. | Für diesen Test wird ein künstlicher Boden mit folgenden Bestandteilen verwendet (alle Angaben bezogen auf die Trockenmasse):- —
- 5 % Sphagnum-Torf, luftgetrocknet und fein gemahlen (eine Partikelgröße von 2 ± 1 mm ist annehmbar);
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- 20 % Kaolin-Ton (mit einem Kaolinit-Anteil vorzugsweise von mehr als 30 %);
- —
- ca. 74 % luftgetrockneter Industriesand (je nach erforderlichem CaCO3-Anteil), hauptsächlich feiner Sand mit mehr als 50 % Partikeln mit einer Größe von 50-200 μm; die genaue Menge des Sands hängt vom CaCO3-Gehalt ab (s. u.); insgesamt muss ein Anteil von 75 % erreicht werden.
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- < 1,0 % Calciumcarbonat (CaCO3, pulverisiert, Analysequalität), um einen pH-Wert von 6,0 ± 0,5 zu erzielen; wie viel Calciumcarbonat hinzuzugeben ist, kann vor allem von der Qualität/Beschaffenheit des Torfs abhängen (siehe Hinweis 1).
Hinweis 1: Wie viel CaCO3 zu verwenden ist, hängt von den Bestandteilen des Bodensubstrats ab und ist unmittelbar vor Testbeginn durch Messung des pH-Werts der Unterproben des Bodens zu ermitteln (14).Hinweis 2: Bei diesem Test hat der künstliche Boden einen anderen Torfgehalt als bei anderen Prüfmethoden mit terrestrisch lebenden Organismen, wo der Torfanteil in der Regel bei 10 % liegt (z. B. (15)). Nach EPPO (16) enthält ein typischer landwirtschaftlich genutzter Boden höchstens 5 % organische Bestandteile; die Reduzierung des Torfgehalts entspricht somit der eingeschränkten Fähigkeit eines Naturbodens zur Sorption der Prüfchemikalie an organischen Kohlenstoff.
Hinweis 3: Falls erforderlich (z. B. für spezifische Testanforderungen), können auch natürliche Böden von nicht verunreinigten Bezugsorten als Test- und/oder Kultursubstrate dienen. ³¹²⁹Wird natürlicher Boden verwendet, sollten mindestens die Herkunft (Entnahmeort), der pH-Wert, die Textur (Partikelgrößenverteilung) und der Gehalt an organischen Bestandteilen charakterisiert werden. ³¹³⁰Soweit verfügbar, sind auch Typ und Name des Bodens nach der Bodenklassifikation anzugeben, und der Boden darf nicht kontaminiert sein. ³¹³¹Handelt es sich bei der Prüfchemikalie um ein Metall oder eine metallorganische Verbindung, sollte auch die Kationenaustauschkapazität (KAK) des natürlichen Bodens ermittelt werden. ³¹³²Da in der Regel kaum Hintergrundinformationen über natürliche Böden vorliegen, sollte den Validitätskriterien besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden.
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| 11. | Die trockenen Bestandteile des Bodens werden gründlich gemischt (z. B. in einem großen Labormischer). Zur Bestimmung des pH-Werts wird eine Mischung aus Boden und 1 M Calciumchlorid- (KCl) oder 0,01 M Calciumchlorid-Lösung (CaCl2) im Verhältnis 1:5 verwendet (siehe (14) und Anlage 3). Wenn der Boden saurer als erforderlich ist (siehe Nummer 10), kann der pH-Wert durch Zugabe einer geeigneten Menge CaCO3 korrigiert werden. Ist der Boden zu alkalisch, kann der pH-Wert durch Zugabe einer größeren Menge der Mischung mit den ersten drei der unter Nummer 10 beschriebenen Bestandteile (aber ohne CaCO3) korrigiert werden. |
| 12. | ³¹³⁴Die maximale Wasserhaltefähigkeit des künstlichen Bodens wird nach den in Anlage 2 beschriebenen Verfahren ermittelt. ³¹³⁵2 bis 7 Tage vor Beginn der Prüfung wird der trockene künstliche Boden angefeuchtet, indem so viel destilliertes oder entionisiertes Wasser hinzugegeben wird, bis etwa die Hälfte des endgültigen Wasservolumens erreicht ist (40-60 % der maximalen Wasserhaltefähigkeit). ³¹³⁶Der Feuchtegehalt wird auf 40-60 % der maximalen Wasserhaltefähigkeit eingestellt, indem die Lösung mit der Prüfchemikalie und/oder destilliertes oder entionisiertes Wasser hinzugegeben wird (siehe Nummern 16-18). ³¹³⁷Eine zusätzliche grobe Prüfung des Feuchtegehalts des Bodens wird vorgenommen, indem der Boden vorsichtig in der Hand gedrückt wird; bei richtigem Feuchtegehalt sollten Wassertröpfchen zwischen den Fingern austreten. |
| 13. | ³¹³⁸Der Feuchtegehalt des Bodens wird zu Beginn und am Ende der Prüfung durch Trocknung bei 105 °C auf ein konstantes Gewicht gemäß ISO 11465 (17) gemessen; die Messung des pH-Werts erfolgt gemäß Anlage 3 oder ISO 10390 (14). ³¹³⁹Diese Messungen sind an zusätzlichen milbenfreien Proben sowohl aus den Kontrollböden als auch aus den einzelnen Böden mit Testkonzentrationen vorzunehmen. ³¹⁴⁰Wenn saure oder basische Chemikalien geprüft werden, sollte der pH-Wert des Bodens nicht justiert werden. ³¹⁴¹Der Feuchtegehalt ist während der gesamten Prüfung durch regelmäßiges Wiegen der Gefäße zu überwachen (siehe Nummern 20 und 24). |
Auswahl und Vorbereitung der Testtiere | 14. | ³¹⁴²In diesem Versuch wird die Art Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer (Canestrini, 1883) verwendet. ³¹⁴³Für den Teststart werden adulte weibliche Milben aus einer synchronisierten Gruppe benötigt. ³¹⁴⁴Die Milben sind etwa 7-14 Tage nach Erreichen des adulten Stadiums, d. h. 28-35 Tage nach Beginn der Eiablage in der Synchronisation einzusetzen (siehe Nummer 3 und Anlage 4). ³¹⁴⁵Die Herkunft der Milben bzw. die Anbieter und die Kultivierungsbedingungen im Labor sind zu protokollieren. ³¹⁴⁶Wird eine Milbenkultur im Labor gehalten, sollte die Identität der jeweiligen Art mindestens einmal jährlich bestätigt werden. ³¹⁴⁷Ein Identifikationsblatt liegt als Anlage 6 bei. |
Herstellung der Testkonzentrationen | 15. | ³¹⁴⁸Die Prüfchemikalie wird in den Boden gemischt. ³¹⁴⁹Organische Lösungsmittel, die als Hilfsmittel zur Behandlung des Bodens mit der Prüfchemikalie verwendet werden, sollten aufgrund ihrer geringen toxischen Wirkung auf die Milben gewählt werden, und im Versuchsplan ist eine angemessene Lösungsmittelkontrolle vorzusehen (siehe Nummer 29). |
Wasserlösliche Prüfchemikalien | 16. | ³¹⁵⁰Eine Lösung der Prüfchemikalie wird in einer für alle Replikate einer Testkonzentration ausreichenden Menge in entionisiertem Wasser hergestellt. ³¹⁵¹Dabei sollte möglichst so viel Wasser verwendet werden, dass der erforderliche Feuchtegehalt (d. h. 40-60 % der maximalen Wasserhaltefähigkeit (siehe Nummer 12)) erreicht wird. ³¹⁵²Jede Lösung der Prüfchemikalie wird gründlich mit einer Charge des befeuchteten Bodens gemischt und anschließend in das Prüfgefäß gegeben. |
Nicht wasserlösliche Prüfchemikalien | 17. | ³¹⁵³Prüfchemikalien, die nicht in Wasser, sondern nur in organischen Lösungsmitteln löslich sind, können in der kleinstmöglichen Menge eines geeigneten Lösungsmittels (z. B. Aceton) gelöst werden. ³¹⁵⁴Es sollten jedoch nur flüchtige Lösungsmittel verwendet werden. ³¹⁵⁵Werden derartige Lösungsmittel verwendet, müssen alle Testkonzentrationen und die Kontrolle dieselbe Mindestmenge dieses Lösungsmittels enthalten. ³¹⁵⁶Das Lösungsmittel wird aufgesprüht oder mit einer kleinen Menge (z. B. 10 g) Quarzsand gemischt. ³¹⁵⁷Der gesamte Sandgehalt des Substrats ist auf diese Menge zu korrigieren. ³¹⁵⁸Anschließend wird das Lösungsmittel mindestens eine Stunde lang unter einer Abzugshaube verdampft. ³¹⁵⁹Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfchemikalie wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und mit einer angemessenen Menge entionisierten Wassers gründlich vermischt, um den erforderlichen Feuchtegehalt zu erhalten. ³¹⁶⁰Die endgültige Mischung wird in die Prüfgefäße gegeben. ³¹⁶¹Zu beachten ist, dass manche Lösungsmittel für Milben toxisch sein können. ³¹⁶²Wenn über die Toxizität des Lösungsmittels bei Milben nichts bekannt ist, wird empfohlen, eine zusätzliche Wasserkontrolle ohne Trägerstoff zu verwenden. ³¹⁶³Wird angemessen nachgewiesen, dass das Lösungsmittel (in den zu verwendenden Konzentrationen) keine Wirkung zeigt, braucht die Wasserkontrolle nicht berücksichtigt zu werden. |
In Wasser und organischen Lösungsmitteln schlecht lösliche Prüfchemikalien | 18. | ³¹⁶⁴Bei in Wasser und in organischen Lösungsmitteln schlecht löslichen Chemikalien werden 2,5 g fein gemahlener Quarzsand pro Prüfgefäß (z. B. 10 g feiner Quarzsand für vier Replikate) mit der benötigten Menge Prüfchemikalie gemischt, um die gewünschte Testkonzentration zu erhalten. ³¹⁶⁵Der gesamte Sandanteil des Substrats sollte auf diese Menge korrigiert werden. ³¹⁶⁶Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfchemikalie wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und mit einer angemessenen Menge entionisierten Wassers gründlich vermischt, um den erforderlichen Feuchtegehalt zu erhalten. ³¹⁶⁷Die endgültige Mischung wird auf die Prüfgefäße verteilt, das Verfahren wird für alle Testkonzentrationen wiederholt und es wird eine geeignete Kontrolle hergestellt. |
VERFAHRENTestgruppen und Kontrollen
| 19. | ³¹⁶⁸Für jedes Kontroll- und Prüfgefäß werden jeweils zehn adulte weibliche Tiere in 20 g künstlichem Boden (bezogen auf die Trockenmasse) empfohlen. ³¹⁶⁹Die Testorganismen sind innerhalb von zwei Stunden nach der Herstellung des fertigen Testsubstrats (d. h. nach Applikation der Prüfchemikalie) einzusetzen. ³¹⁷⁰In besonderen Fällen (z. B. wenn die Alterung ein entscheidender Faktor ist) kann die Zeitspanne zwischen der Herstellung des fertigen Testsubstrats und dem Einsetzen der Milben verlängert werden (für Einzelheiten zur Alterung siehe (18)); dies ist jedoch wissenschaftlich zu begründen. |
| 20. | Nach dem Einsetzen in den Boden werden die Milben gefüttert und das Anfangsgewicht eines jeden Testgefäßes bestimmt, welches als Bezugsgröße zur Überwachung des Feuchtegehalts des Bodens während der gesamten Prüfung dient; siehe Nummer 24. Anschließend werden die Prüfgefäße verschlossen, wie unter Nummer 8 beschrieben, und in die Prüfkammer gestellt. |
| 21. | ³¹⁷²Für jede der unter den Nummern 15-18 beschriebenen Methoden für die Applikation der Prüfchemikalie sind entsprechende Kontrollen herzustellen. ³¹⁷³Die beschriebenen Verfahren sind dieselben wie für die Herstellung der Kontrollen, außer dass keine Prüfchemikalie zugegeben wird. ³¹⁷⁴Folglich werden den Kontrollen gegebenenfalls organische Lösungsmittel, Quarzsand oder sonstige Trägerstoffe in denselben Konzentrationen/Mengen wie in den Prüfgefäßen zugegeben. ³¹⁷⁵Wird ein Lösungsmittel oder ein sonstiger Trägerstoff zur Prüfchemikalie hinzugegeben, von dem die Toxizität nicht bekannt ist, so ist eine zusätzliche Kontrolle ohne Trägerstoff bzw. ohne Prüfchemikalie herzustellen und zu testen (siehe Nummer 17). |
Prüfbedingungen | 22. | ³¹⁷⁶Die Prüftemperatur beträgt 20 ± 2 °C und sollte mindestens täglich erfasst und gegebenenfalls korrigiert werden. ³¹⁷⁷Der Test wird in kontrollierten Hell-/Dunkel-Zyklen (vorzugsweise 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit) mit einer Beleuchtungsstärke von 400-800 lux im Umfeld der Prüfgefäße durchgeführt. ³¹⁷⁸Aus Gründen der Vergleichbarkeit gelten dieselben Bedingungen wie in anderen Tests zur Bestimmung der Ökotoxizität in Böden (z. B. (15)). |
| 23. | ³¹⁷⁹Gasaustausch sollte gewährleistet werden, indem die (mit Schraubverschlüssen versehenen) Prüfgefäße mindestens zweimal wöchentlich belüftet werden. ³¹⁸⁰Sind die Gefäße mit Gaze verschlossen, muss besonders auf den Feuchtegehalt des Bodens geachtet werden (siehe Nummern 8 und 24). |
| 24. | ³¹⁸¹Der Wassergehalt des Bodensubstrats in den Prüfgefäßen wird während der gesamten Prüfung durch Wiegen kontrolliert und gegebenenfalls durch regelmäßiges Nachwässern der Gefäße (z. B. einmal wöchentlich) aufrechterhalten. ³¹⁸²Verluste werden gegebenenfalls mit entionisiertem Wasser ausgeglichen. ³¹⁸³Der Feuchtegehalt während der Prüfung darf höchstens um 10 % vom Ausgangswert abweichen. |
Fütterung | 25. | ³¹⁸⁴Käsemilben (Tyrophagus putrescentiae (Schrank, 1781)) haben sich nachweislich als geeignete Futterquelle erwiesen. Kleine Collembolen (z. B. juvenile Folsomia candida Willem, 1902, oder Onychiurus fimatus (19), (20), Enchytraeen (z. B. Enchytraeus crypticus Westheide & Graefe, 1992) oder Nematoden (z. B. Turbatrix silusiae de Man, 1913)) könnten ebenfalls geeignet sein (21). ³¹⁸⁵Es wird empfohlen, das vorgesehene Futter vor Verwendung im Test zu prüfen. ³¹⁸⁶Um die Validitätskriterien zu erfüllen, müssen Art und Menge des Futters gewährleisten, dass sich eine angemessene Anzahl juveniler Tiere entwickelt (Nummer 6). ³¹⁸⁷Bei der Auswahl der Futtertiere sollte auch die Wirkungsweise der Prüfchemikalie berücksichtigt werden (beispielsweise kann ein Akarizid auch für die Futtermilben giftig sein; siehe Nummer 26). |
| 26. | ³¹⁸⁸Futter ist ad libitum bereitzustellen (d. h. jedes Mal eine kleine Menge, etwa eine Spatelspitze). ³¹⁸⁹Dazu kann auch ein Sauger mit geringer Saugwirkung, wie er für den Collembolen-Test vorgeschlagen wird, oder ein feiner Pinsel verwendet werden. ³¹⁹⁰Gewöhnlich reicht es, das Futter zu Beginn der Prüfung und danach zwei- bis dreimal wöchentlich anzubieten. ³¹⁹¹Wenn die Prüfchemikalie für die Futtertiere eindeutig toxisch ist, sollte häufigeres Füttern und/oder ein anderes Futter in Betracht gezogen werden. |
Wahl der Testkonzentrationen | 27. | ³¹⁹²Vorkenntnis der Toxizität der Prüfchemikalie (z. B. aus Vorversuchen) erleichtert die Wahl geeigneter Testkonzentrationen. ³¹⁹³Falls erforderlich, wird ein Vorversuch mit fünf Konzentrationen der Prüfchemikalie im Bereich 0,1-1 000 mg/kg trockener Boden mit jeweils mindestens einem Replikat für die Prüf- und die Kontrollgefäße durchgeführt. ³¹⁹⁴Der Vorversuch dauert 14 Tage; anschließend werden die Mortalität der adulten Milben und die Zahl der juvenilen Tiere ermittelt. ³¹⁹⁵Der Konzentrationsbereich im endgültigen Test sollte vorzugsweise so gewählt werden, dass er Konzentrationen umfasst, die die Zahl der juvenilen Tiere beeinflussen, nicht jedoch das Überleben der Muttertiere. ³¹⁹⁶Bei Chemikalien, die bei fast gleichen Konzentrationen letal und subletal wirken, ist dies unter Umständen nicht möglich. Die im Test verwendeten Konzentrationen sollten in jedem Fall die Wirkungskonzentration (z. B. EC50, EC25 und EC10) und den Konzentrationsbereich, in dem die Wirkung der Prüfchemikalie von Interesse ist, einschließen. ³¹⁹⁷Eine Extrapolation deutlich unterhalb der niedrigsten Konzentration, bei der eine Wirkung auf die Testorganismen auftritt, oder oberhalb der höchsten geprüften Konzentration sollte nur in Ausnahmefällen stattfinden und ist im Bericht umfassend zu begründen. |
VersuchsplanDosis-Wirkung-Tests
| 28. | Gestützt auf die Empfehlungen aus einem anderen Ringtest (Enchytraeen-Reproduktionstest, (22)) werden drei Versuchspläne vorgeschlagen. Die generelle Eignung aller drei Pläne wurde durch das Ergebnis der H. aculeifer-Validierung bestätigt. |
| 29. | Bei der Festlegung der Konzentrationsspanne sollten die folgenden Aspekte berücksichtigt werden:- —
- Zur Ermittlung des ECx-Wertes (z. B. EC10 oder EC50) sind zwölf Konzentrationen zu prüfen. ³²⁰¹Empfohlen werden mindestens zwei Replikate pro Testkonzentration und sechs Replikate pro Kontrolle. ³²⁰²Der Abstandsfaktor kann variieren, d. h. im erwarteten Wirkungsbereich maximal 1,8 und bei den höheren und niedrigeren Konzentrationen über 1,8).
- —
- ³²⁰³Zur NOEC-Bestimmung sollten mindestens fünf Konzentrationen in einer geometrischen Reihe geprüft werden. ³²⁰⁴Empfohlen werden vier Replikate pro Testkonzentration plus acht Kontrollen. ³²⁰⁵Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 2,0 unterscheiden.
- —
- Ein kombinierter Ansatz ermöglicht die Bestimmung sowohl des NOEC- als auch des ECx-Wertes. ³²⁰⁶Empfohlen werden acht Prüfkonzentrationen in einer geometrischen Reihe sowie vier Replikate pro Prüfkonzentration plus acht Kontrollen. ³²⁰⁷Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden.
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Limit-Test | 30. | ³²⁰⁸Zeigen sich im Vorversuch bei der höchsten Konzentration (1 000 mg/kg trockener Boden) keine Wirkungen, kann der endgültige Reproduktionstest als Limit-Test mit der Testkonzentration 1 000 mg/kg durchgeführt werden. Mit einem Limit-Test lässt sich nachweisen, dass der NOEC- oder der EC10-Wert für die Reproduktionsleistung über der Limit-Konzentration liegt, während die Zahl der für den Test verwendeten Milben gleichzeitig auf ein Minimum begrenzt ist. ³²⁰⁹Sowohl für den behandelten Boden als auch für die Kontrolle sind jeweils acht Replikate vorzusehen. |
Testdauer und Messungen | 31. | Alle beobachteten Unterschiede in Verhalten und Morphologie zwischen den Milben in der Kontrolle und den Milben in den Prüfgefäßen sind aufzuzeichnen. |
| 32. | ³²¹¹An Tag 14 werden die überlebenden Milben unter Licht-/Wärmeeinfluss oder nach einer anderen geeigneten Methode (siehe Anlage 5) extrahiert. ³²¹²Juvenile (d. h. Larven, Protonymphen und Deutonymphen) und adulte Tiere werden separat gezählt. ³²¹³Adulte Milben, die zu diesem Zeitpunkt nicht gefunden werden, gelten als tot, wobei davon ausgegangen wird, dass die Milben vor der Bewertung abgestorben sind und sich zersetzt haben. ³²¹⁴Die Wirksamkeit der Extraktion ist ein- oder zweimal jährlich in Kontrollen mit einer bekannten Anzahl adulter und juveniler Tiere zu validieren. ³²¹⁵Sie sollte im Schnitt bei allen Entwicklungsstadien bei über 90 % liegen (siehe Anlage 5). ³²¹⁶Die Zählungen der Adulten und Juvenilen dürfen nicht mit Blick auf die Erfüllung des Wirksamkeitskriteriums angepasst werden. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 33. | Für Informationen über die statistischen Methoden für die Auswertung der Testergebnisse siehe Nummern 36 bis 41 sowie OECD-Dokument 54 ‚Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application‘ (31). |
| 34. | ³²¹⁷Hauptendpunkt des Tests ist die Reproduktionsleistung, in diesem Fall die Zahl der pro Prüfgefäßreplikat (mit jeweils 10 eingesetzten adulten Weibchen) produzierten juvenilen Tiere. Für die statistische Analyse müssen für jede Testkonzentration und für jede Kontrolle das arithmetische Mittel (S) und die Varianz (s2) der Reproduktionsleistung berechnet werden. ³²¹⁸X und s2 werden für ANOVA-Verfahren wie den Student-, den Dunnett- oder den Williams-Test sowie für die Berechnung der 95 %-Konfidenzgrenzen verwendet.Hinweis: Dieser Hauptendpunkt entspricht der Fruchtbarkeit, gemessen als Zahl der während der Prüfung produzierten lebenden juvenilen Tiere geteilt durch die Zahl der bei Prüfungsbeginn eingesetzten weiblichen Elterntiere.
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| 35. | ³²²⁰Die Zahl der in den unbehandelten Kontrollen ist ein Hauptvaliditätskriterium und muss aufgezeichnet werden. ³²²¹Wie schon beim Vorversuch sind im Schlussbericht auch alle anderen Anzeichen von Schadwirkungen festzuhalten. |
ECx | 36. | ECx-Werte, einschließlich ihrer entsprechenden oberen und unteren 95 %-Konfidenzgrenzen, für den Parameter gemäß Nummer 34 sind nach geeigneten statistischen Methoden (z. B. Probit-Analysen, Logit- oder Weibull-Modell, Trimmed Spearman-Karber-Methode oder einfache Interpolation (11)) zu berechnen. Ein ECx-Wert wird ermittelt, indem ein x % des Kontrollmittelwertes entsprechender Wert in die entstandene Gleichung eingesetzt wird. Um den EC50-Wert oder einen beliebigen anderen ECx-Wert zu ermitteln, sollten die für die einzelnen Prüfgefäße berechneten Mittelwerte (x) einer Regressionsanalyse unterzogen werden. |
NOEC/LOEC | 37. | Zur Bestimmung der NOEC-/LOEC-Werte durch statistische Analyse sind statistische Auswertungen für jedes Gefäß erforderlich (wobei einzelne Gefäße als Replikate gelten.) Es sollten geeignete statistische Methoden angewendet werden (gemäß OECD-Dokument 54 ‚Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application‘). ³²²³Grundsätzlich gilt, dass Schadwirkungen der Prüfchemikalie im Vergleich zur Kontrolle mit einer einseitigen (kleineren) Hypothesenprüfung bei p ≤ 0,05 zu untersuchen sind. ³²²⁴Siehe Beispiele in den folgenden Absätzen. |
| 38. | ³²²⁵Die Normalverteilung der Daten kann z. B. anhand der Kolmogorov-Smirnov-Methode (‚Goodness-of-Fit-Test‘), anhand einer Prüfung zur Ermittlung des Quotienten aus Spannweite und Standardabweichung (range to standard deviation ratio, R/s-Test) oder anhand des Shapiro-Wilk-Tests (zweiseitig, p ≤ 0,05) untersucht werden. ³²²⁶Mit dem Cochran-Test, dem Levene-Test oder dem Bartlett-Test (zweiseitig, p ≤ 0,05) kann die Varianzhomogenität geprüft werden. ³²²⁷Wenn die Bedingungen parametrischer Testverfahren (Untersuchung auf Normalverteilung und Varianzhomogenität) erfüllt sind, können eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) und anschließend Multi-Comparison-Tests durchgeführt werden. Mit paarweisen Vergleichstests (z. B. dem Dunnett-t-Test) oder Step-down-Trendtests (z. B. mit dem Williams-Test bei monotoner Dosis-Wirkung-Beziehung) kann berechnet werden, ob zwischen den Kontrollen und den verschiedenen Prüfkonzentrationen signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) bestehen (Auswahl des empfohlenen Tests gemäß OECD-Dokument 54 ‚Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application‘). ³²²⁸Andernfalls sollten nicht parametrische Methoden (z. B. ein U-Test mit Bonferroni-/Holm-Korrektur oder ein Jonckheere-Terpstra-Trendtest) verwendet werden, um den NOEC- und den LOEC-Wert zu bestimmen. |
Limit-Test | 39. | ³²²⁹Wurde ein Limit-Test (Vergleich der Kontrolle mit einer einzigen Testkonzentration) durchgeführt und sind die Bedingungen für parametrische Prüfverfahren (Normalität, Homogenität) erfüllt, können metrische Reaktionen mit dem Student-t-Test ausgewertet werden. ³²³⁰Sind diese Bedingungen nicht erfüllt, so kann ein t-Test für ungleiche Varianzen (Welch-Test) oder ein nicht-parametrischer Test wie der U-Test nach Mann und Whitney verwendet werden. |
| 40. | ³²³¹Um signifikante Unterschiede zwischen den Kontrollen (Kontrollen und Lösungsmittelkontrollen) zu ermitteln, können die Replikate der einzelnen Kontrollen wie für den Limit-Test beschrieben geprüft werden. ³²³²Werden bei diesen Tests keine signifikanten Unterschiede festgestellt, können alle Replikate der Kontrolle und Lösungsmittelkontrolle gepoolt werden. ³²³³Anderenfalls sind alle Testkonzentrationen mit der Lösungsmittelkontrolle zu vergleichen. |
Prüfbericht | 40. | Der Prüfbericht sollte zumindest folgende Angaben enthalten:- —
- Prüfchemikalie
| — | Identität der Prüfchemikalie (Charge, Los, CAS-Nummer und Reinheit); |
| — | physikalisch-chemische Eigenschaften der Prüfchemikalie (z. B. log Kow, Wasserlöslichkeit, Dampfdruck und Henry-Konstante (H) sowie vorzugsweise Angaben zum Verbleib der Prüfchemikalie im Boden). |
- —
- Testorganismen
| — | Identifizierung und Bezugsquelle der Testorganismen, Beschreibung der Aufzuchtbedingungen; |
| — | Altersspanne der Testorganismen; |
- —
- Prüfbedingungen
| — | Beschreibung des Prüfprotokolls und des Prüfverfahrens; |
| — | Angaben zur Herstellung des Testbodens; detaillierte Spezifikation, wenn natürlicher Boden verwendet wird (Herkunft, Geschichte, Partikelgrößenverteilung, pH-Wert, organische Bestandteile und — falls verfügbar — Einstufung); |
| — | maximale Wasserhaltekapazität des Bodens; |
| — | Beschreibung des Verfahrens zur Einbringung der Prüfchemikalie in den Boden; |
| — | nähere Angaben zu chemischen Hilfsstoffen, die zur Applikation der Prüfchemikalie verwendet wurden; |
| — | Größe der Prüfgefäße und Trockenmasse des Testbodens pro Gefäß; |
| — | Prüfbedingungen: Lichtintensität, Dauer der Hell-/Dunkel-Zyklen, Temperatur; |
| — | Beschreibung des Fütterungsregimes; Typ und Menge des im Versuch verwendeten Futters; Zeitpunkte der Fütterung; |
| — | pH-Wert und Wassergehalt des Bodens zu Beginn und während der Prüfung (Kontrolle und jede einzelne Testkonzentration); |
| — | detaillierte Beschreibung des Extraktionsverfahrens und der Wirksamkeit des Verfahrens. |
- —
- Prüfergebnisse
| — | Zahl der in den einzelnen Prüfbehältern ermittelten juvenilen Tiere am Ende der Prüfung; |
| — | Zahl der am Ende der Prüfung in den einzelnen Prüfbehältern ermittelten adulten Weibchen und abgestorbenen adulten Tiere ( %); |
| — | Beschreibung deutlicher Symptome oder ausgeprägter Verhaltensänderungen; |
| — | Ergebnisse mit der Referenzchemikalie; |
| — | zusammenfassende Statistik (ECx-Werte und/oder NOEC) einschließlich der 95 %-Konfidenzintervalle und einer Erläuterung der Berechnungsmethode; |
| — | grafische Darstellung der Dosis-Wirkung-Beziehung; |
| — | Abweichungen von den für diese Prüfmethode beschriebenen Verfahren und außergewöhnliche Vorkommnisse während der Prüfung. |
|
LITERATUR | (1) | Casanueva, M.E. (1993). ³²³⁸Phylogenetic studies of the free-living and arthropod associated Laelapidae (Acari: Mesostigmata). ³²³⁹Gayana Zool. ³²⁴⁰57, 21-46. |
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| (11) | Schlosser, H.-J. ³²⁷⁵und Riepert, F. (1992). ³²⁷⁶Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina). ³²⁷⁷Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. ³²⁷⁸Beitr. N.F. ³²⁷⁹34, 413-433. |
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| (14) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1994). Bodenbeschaffenheit; Bestimmung des pH-Wertes, Nr. 10390. ISO, Genf. |
| (15) | Kapitel C.8 dieses Anhangs: Toxizität für Regenwürmer. |
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| (18) | Fairbrother, A., Glazebrock, P.W., Van Straalen, N.M. und Tarazona, J.V. 2002. ³²⁹⁹Test Methods to Determine Hazards of Sparingly Soluble Metal Compounds in Soils. ³³⁰⁰SETAC Press, Pensacola, FL, USA. |
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| (20) | Schlosser, H.J. und Riepert, F. 1992. ³³⁰⁵Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilden (Gamasina). Zool. ³³⁰⁶Beitr. N.F. ³³⁰⁷34(3):395-433. |
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| (22) | Kapitel C.32 dieses Anhangs — Enchyträen-Reproduktionstest. |
| (23) | ISO (Internationale Organisation für Normung) (1994). ³³¹³Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer — Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung von Eisenia fetida/Eisenia andrei, Nr. 11268-2. ³³¹⁴ISO, Genf. |
| (24) | Southwood, T.R.E. (1991). ³³¹⁶Ecological methods. ³³¹⁷With particular reference to the study of insect populations. (2. Auflage). Chapman & Hall, London, 524 S. |
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| (26) | Lesna, I. ³³²⁰und Sabelis, M.W. (1999). ³³²¹Diet-dependent female choice for males with ‚good genes‘ in a soil predatory mite. ³³²²Nature 401, 581-583. |
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| (28) | Ruf, A. (1993). ³³²⁵Die morphologische Variabilität und Fortpflanzungsbiologie der Raubmilbe Hypoaspis aculeifer (Canestrini 1883) (Mesostigmata, Dermanyssidae). ³³²⁶Dissertation, Universität Bremen. |
| (29) | Ignatowicz, S. (1974). ³³²⁸Observations on the biology and development of Hypoaspis aculeifer Canestrini, 1885 (Acarina, Gamasides). ³³²⁹Zoologica Poloniae 24, 11-59. |
| (30) | Kevan, D.K. McE. ³³³¹und Sharma, G.D. (1964). ³³³²Observations on the biology of Hypoaspis aculeifer (Canestrini, 1884), in Nordamerika scheinbar neu aufgetreten (Acarina: Mesostigmata: Laelaptidae). ³³³³Acarologia 6, 647-658. |
| (31) | OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD-Veröffentlichungen zu Gesundheit und Arbeitsschutz, Reihe ‚Testing and Assessment‘, Nr. 54, ENV/JM/MONO(2006)18 |
Anlage 1Begriffsbestimmungen
Die folgenden Definitionen beziehen sich auf die vorliegende Prüfmethode. (Bei dieser Prüfung werden alle Wirkungskonzentrationen als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.)
Chemikalie: Stoff oder ein Gemisch.
ECx (Konzentration für eine Wirkung von x %): die Konzentration, die im Vergleich zur Kontrolle innerhalb eines bestimmten Expositionszeitraums eine x %ige Wirkung auf die Testorganismen zeigt. Ein EC50-Wert ist beispielsweise eine Konzentration, bei der davon ausgegangen wird, dass sie sich innerhalb eines bestimmten Expositionszeitraums bei 50 % einer exponierten Population auf einen Prüfungsendpunkt auswirkt.
LOEC (Niedrigste messbare Konzentration mit statistisch signifikanter Wirkung): niedrigste Konzentration einer Prüfchemikalie, die im Vergleich zur Kontrolle innerhalb eines bestimmten Expositionszeitraums eine statistisch signifikante Wirkung (p ≤ 0,05) zeigt.
NOEC (Höchste messbare Konzentration ohne statistisch signifikante Wirkung): die Konzentration der Prüfchemikalie, bei der keine Wirkung gemessen wird. Für diesen Test zeigt die dem NOEC-Wert entsprechende Konzentration im Vergleich zur Kontrolle innerhalb eines bestimmten Expositionszeitraums keine statistisch signifikante Wirkung (p ≤ 0,05).
Prüfchemikalie: beliebiger Stoff oder beliebiges Gemisch, der bzw. das nach dieser Methode geprüft wird.
Anlage 2
Bestimmung der maximalen Wasserhaltekapazität des künstlichen Bodens
Die folgende Methode hat sich zur Bestimmung der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens bewährt. Sie ist in Anhang C von ISO DIS 11268-2 (Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer (Eisenia fetida). Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung (23) beschrieben.
³³⁴⁴Mit einer geeigneten Vorrichtung zur Probenahme (Stechzylinder etc.) eine bestimmte Menge (z. B. 5 g) Prüfboden entnehmen. ³³⁴⁵Den Zylinder auf der Unterseite mit Filterpapier abdecken, anschließend mit Wasser füllen und auf einem Gestell in ein Wasserbad setzen. ³³⁴⁶Den Zylinder allmählich eintauchen, bis der Boden durch das Wasser bedeckt ist, und etwa drei Stunden im Wasser belassen. ³³⁴⁷Da nicht alles durch die Bodenkapillare aufgenommene Wasser im Substrat gehalten werden kann, den Zylinder mit der Bodenprobe zur Entwässerung zwei Stunden in einem geschlossenen Gefäß (um eine Austrocknung zu verhindern) auf sehr feuchten, fein gemahlenen Quarzsand stellen. ³³⁴⁸Anschließend die Probe wiegen und bei 105 °C bis zur Massekonstanz trocknen. Die Wasserhaltekapazität (Water Holding Capacity, WHC) kann dann wie folgt berechnet werden:
Dabei sind:
S= das wassergesättigte Substrat + Masse des Zylinders + Masse des Filterpapiers
T= Tara (Masse des Zylinders + Masse des Filterpapiers)
D= Trockenmasse des Substrats
Anlage 3
Bestimmung des pH-Wertes von Böden
Die folgende Methode zur Bestimmung des pH-Wertes von Böden beruht auf ISO DIS 10390: Bodenbeschaffenheit; Bestimmung des pH-Wertes (16).
³³⁴⁹Eine vorgegebene Menge Boden für mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur trocknen. Eine Suspension aus (mindestens 5 g) Boden in einer 1 M Lösung analysenreinen Kaliumchlorids (KCl) oder einer 0,01 M Lösung analysenreinen Calciumchlorids (CaCl2) im Verhältnis 1:5 herstellen. ³³⁵⁰Anschließend die Suspension für fünf Minuten kräftig schütteln und dann mindestens 2, aber nicht länger als 24 Stunden ruhen lassen. ³³⁵¹Der pH-Wert der flüssigen Phase wird mit einem pH-Messgerät gemessen, das vor jeder Messung mit einer geeigneten Reihe an Pufferlösungen (z. B. pH 4,0 und 7,0) kalibriert wurde.
Anlage 4
Anzucht von Hypoaspis (Geolaelaps ) aculeifer und Lebensmittelmilben und Synchronisation der Kulturen
Anzucht von Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer:
Die Kulturen können in Kunststoffgefäßen oder in Glasgefäßen in einer Mischung aus Gips- und Holzkohlepulver im Verhältnis 9:1 gehalten werden. ³³⁵³Der Gips kann erforderlichenfalls durch Zugabe einiger Tropfen destillierten oder entionisierten Wassers feucht gehalten werden. ³³⁵⁴Die optimale Temperatur der Kultur liegt bei 20 ± 2 °C; die Photoperiode (Hell-/Dunkel-Phasen) ist für diese Art nicht von Bedeutung. Als Futter können Milben der Arten Typrophagus putrescentiae oder Caloglyphus sp.³³⁵⁵ verwendet werden. ³³⁵⁶(Lebensmilben sind mit Vorsicht zu handhaben, da sie bei Menschen Allergien auslösen können.) Nematoden, Enchytraeen und Collembolen sind als Futter ebenfalls geeignet. ³³⁵⁷Ihre Bezugsquelle sollte protokolliert werden. ³³⁵⁸Die Entwicklung der Population kann mit einem einzigen weiblichen Tier gestartet werden, denn männliche Tiere entwickeln sich in unbefruchteten Eiern. ³³⁵⁹Die Generationen überschneiden sich weitgehend. ³³⁶⁰Ein weibliches Tier kann mindestens 100 Tage lang leben und in diesem Zeitraum etwa 100 Eier ablegen. Die höchste Ablegeleistung wird erreicht zwischen Tag 10 und Tag 40 (nach Erreichen des adulten Stadiums) und beträgt 2,2 Eier pro Weibchen– 1 und Tag– 1. ³³⁶¹Die Ausreifung eines Eis zum adulten Weibchen dauert bei einer Temperatur von 20 °C etwa 20 Tage. ³³⁶²Es empfiehlt sich, mehrere Kulturen anzulegen und vorrätig zu halten.
Anzucht von Typrophagus putrescentiae:
Die Milben werden in Glasgefäßen mit feinem Bierhefepulver gehalten, die wiederum in einen mit KNO3-Lösung gefüllten Plastikeimer gestellt werden, damit die Milben nicht entweichen können. ³³⁶⁴Futtermilben werden auf das Pulver gesetzt und anschließend mit einem Spatel vorsichtig unter das Pulver gemischt. ³³⁶⁵Das Pulver ist zweimal wöchentlich zu wechseln.
Synchronisation der Kultur:
Die Testorganismen sollten gleich alt sein (ca. ³³⁶⁷7 Tage nach Erreichen des adulten Stadiums). ³³⁶⁸Bei einer Kulturtemperatur von 20 °C wird dies erreicht durch
Übertragung der weiblichen Tiere in ein sauberes Kulturgefäß mit anschließender Zugabe von Futter in ausreichender Menge;
- —
- Entnahme der weiblichen Tiere nach zwei bis drei Tagen Zeit für die Eiablage;
- —
- Entnahme adulter Testweibchen zwischen Tag 28 und Tag 35 und Übertragung adulter Weibchen in saubere Kulturgefäße.
³³⁶⁹Adulte weibliche Tiere sind von männlichen Tieren und von anderen Entwicklungsstadien leicht zu unterscheiden — sie sind größer, aufgebläht und haben einen braunen Rückenschild (männliche Tiere sind schlanker und platter). ³³⁷⁰Noch nicht ausgereifte Tiere sind weiß bis cremefarbig. ³³⁷¹Die Entwicklungsstadien der Milben verlaufen bei einer Temperatur 20 °C etwa wie folgt (Abbildung): Eier 5d, Larven 2d, Protonymphen 5d, Deutonymphen 7d, Präovipositionsperiode der Weibchen2d. ³³⁷²Danach haben die Milben das adulte Stadium erreicht.Abbildung
Entwicklung von Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer bei 20 °C (Entnahme = weibliche Testexemplare)
 Die adulten Testorganismen werden aus der synchronisierten Kultur entnommen und 28-35 Tage nach Beginn der Eiablage durch die Muttertiere (d. h. 7-14 Tage nach Erreichen des adulten Stadiums) in die Prüfgefäße gesetzt. ³³⁷⁴Dies gewährleistet, dass die Testtiere die Präovipositionsperiode bereits durchlaufen und sich mit ebenfalls im Kulturgefäß vorhandenen männlichen Tieren gepaart haben. ³³⁷⁵Beobachtungen an Laborkulturen lassen darauf schließen, dass sich weibliche Tiere unmittelbar oder kurz nach Erreichen des adulten Stadiums paaren, sofern männliche Tiere vorhanden sind (Ruf, Vaninnen, pers. Beob.). ³³⁷⁶Der 7-Tage-Zeitraum wurde gewählt, um die Laborarbeit zu erleichtern und unterschiedliche Entwicklungen einzelner Exemplare abfedern zu können. ³³⁷⁷Die Eiablage sollte mit mindestens ebenso vielen weiblichen Tieren begonnen werden, wie letztlich für die Prüfung benötigt werden. ³³⁷⁸(Werden beispielsweise 400 weibliche Tiere benötigt, sollten auch mindestens 400 weibliche Tiere zwei bis drei Tage Zeit für die Eiablage gehabt haben.) Ausgangspunkt für die synchronisierte Population sollten mindestens 1 200 Eier sein (Geschlechterverhältnis ca. ³³⁷⁹0,5, Mortalität ca. 0,2). ³³⁸⁰Um Kannibalismus zu vermeiden, sollten pro Gefäß nicht mehr als 20-30 Eier legende weibliche Tiere gehalten werden.Anlage 5
Extraktionsverfahren
Bei Mikroarthropoden ist Extraktion unter Wärmeeinfluss eine geeignete Methode, um die Milben aus dem Boden/dem Substrat zu locken (siehe folgende Abbildung). ³³⁸²Da diese Methode auf der Aktivität der Organismen beruht, können ausschließlich bewegungsfähige Exemplare erfasst werden. ³³⁸³Bei der Extraktion unter Wärmeeinfluss werden die Lebensbedingungen für die Organismen in den Gefäßen allmählich so verschlechtert, dass sie das Substrat verlassen und in eine Fixierflüssigkeit fallen (z. B. Ethanol). ³³⁸⁴Entscheidend sind die Dauer der Extraktion und der Verlauf von guten über mäßige bis hin zu schlechten Lebensbedingungen. ³³⁸⁵Für Ökotoxizitätsprüfungen muss die Extraktion so schnell wie möglich erfolgen, weil eine Populationsvermehrung während der Extraktion die Ergebnisse verfälschen würde. ³³⁸⁶Andererseits müssen Temperatur und Feuchte der Probe stets in einem Bereich liegen, bei dem die Milben sich noch bewegen können. ³³⁸⁷Die Erwärmung einer Bodenprobe bewirkt eine Austrocknung des Substrats. ³³⁸⁸Erfolgt letztere zu rasch, können auch einzelne Milben austrocknen, bevor sie die Chance haben, das Substrat zu verlassen.
Daher wird folgendes Verfahren empfohlen (24) (25):
| Apparatur: Tullgren-Trichter oder vergleichbare Methoden wie Extraktion nach McFadyen (Erwärmung von oben, Probe steht über einem Trichter). |
| Erwärmung: 25 °C 12 h, 35 °C 12 h, 45 °C 24 h (insgesamt 48 h); die Temperatur ist im Substrat zu messen. |
| Fixierflüssigkeit: Ethanol (70 %). |
| ³³⁹²Beschreibung: Von dem für die Prüfung verwendeten Glasgefäß Deckel abnehmen und die Öffnung mit Maschendraht oder Stoff umwickeln. ³³⁹³Den Stoff, der eine Maschenweite von 1,0-1,5 mm haben sollte, mit einem Gummiband fixieren. ³³⁹⁴Danach die Flasche vorsichtig umdrehen und in die Extraktionsapparatur setzen. ³³⁹⁵Die Maschenweite des Gewebes verhindert, dass das Substrat in die Fixierflüssigkeit sickert, ist aber so groß, dass die Milben die Probe verlassen können. ³³⁹⁶Nach dem Einsetzen aller Gefäße mit der Erwärmung beginnen. ³³⁹⁷Die Extraktion nach 48 Stunden beenden. ³³⁹⁸Fixierte Gefäße entnehmen und die Milben unter einem Stereomikroskop zählen. |
Die Extraktionsleistung der gewählten Methode muss ein- bis zweimal jährlich unter Verwendung von Gefäßen mit einer bekannten Anzahl juveniler und adulter Milben in einem unbehandelten Testsubstrat nachgewiesen werden und sollte für alle Entwicklungsstadien zusammengerechnet bei durchschnittlich ≥ 90 % liegen.Extraktionsapparatur mit Tullgren-Trichter
 Vorbereitung des Prüfgefäßes nach Prüfungsende (vor der Extraktion) Anlage 6Identifizierung von Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
| Unterklasse/Ordnung/Unterordnung: | | Familie: | | Gattung/Untergattung/Art: | | Acari/Parasitiformes/Gamasida | | Laelapidae | | Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer |
| Autor und Datum: | F. Faraji, Ph.D. (MITOX), 23. Januar 2007 |
| Literatur: | Karg, W. (1993). ³⁴⁰⁰Die freilebenden Gamasina (Gamasides), Raubmilben. ³⁴⁰¹Tierwelt Deutschlands 59. Teil, 2. ³⁴⁰²Überarbeitete Auflage: 1-523.³⁴⁰³Hughes, A.M. (1976). ³⁴⁰⁴The mites of stored food and houses. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Technical Bulletin 9: 400 S.
Krantz, G.W. (1978). ³⁴⁰⁵A manual of Acarology. ³⁴⁰⁶Oregon State University Book Stores, Inc., 509 S.
|
| Bestimmungsmerkmale: | Tectum mit abgerundetem gezähntem Rand; Hypostom mit mehr als 6 Zähnchen; kaudal-dorsale Seten (Z4), nicht sehr lang; dorsale Seten, Bürsten; Genitalschild normal, nicht sehr vergrößert und nicht bis zum Analschild reichend; hintere Hälfte des Dorsalschilds unpaarige Seten, 2. und 4. Beinpaar mit dicken Makro-Seten; dorsale Seta Z5 etwa doppelt so lang wie J5; fester Chelicerenfinger mit 12-14 Zähnen und beweglicher Chelicerenfinger mit 2 Zähnen; Länge Idiosoma 520-685 μm.Hypoaspis miles wird auch zur biologischen Schädlingsbekämpfung eingesetzt und könnte mit H. aculeifer verwechselt werden. Hauptunterschied zwischen den beiden Arten:
H. miles gehört zur Unterart Cosmolaelaps und hat messerartige dorsale Seten; H. aculeifer hingegen gehört zur Unterart Geolaelaps und hat setiforme (borstenförmige) dorsale Seten.
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 Anlage 7Basisinformationen zur Biologie von Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer
Hypoaspis aculeifer gehört zur Familie Lealapidae, Gattung Acari (Milben), Klasse Arachnida, Stamm Arthropoda. ³⁴¹¹Die Milben leben in allen Arten von Böden und ernähren sich von anderen Milben, Nematoden, Enchytraeen und Collembolen (26). ³⁴¹²Bei Futtermangel kommt es zu Kannibalismus (27). ³⁴¹³Der Körper der Raubmilbe ist untergliedert in Idiosoma und Gnathosoma. ³⁴¹⁴Eine klare Trennung des Idiosoma in Prosoma (Kopf) und Opisthosoma (Bauch) besteht nicht. ³⁴¹⁵Das Gnathosoma (der Kopfschild) trägt die Mundwerkzeuge (z. B. Palpen und Cheliceren). ³⁴¹⁶Die dreigliedrigen Cheliceren sind mit unterschiedlich geformten Zähnen besetzt. ³⁴¹⁷Außer zur Nahrungsaufnahme nutzen die männlichen Tiere ihre Cheliceren vorwiegend, um die Spermatophoren auf die Weibchen zu übertragen. ³⁴¹⁸Ein Dorsalschild bedeckt nahezu das gesamte Idiosoma. ³⁴¹⁹Ein erheblicher Teil des weiblichen Idiosomas entfällt auf die Fortpflanzungsorgane, die insbesondere kurz vor der Eiablage deutlich ausgeprägt sind. ³⁴²⁰Auf der Bauchseite befinden sich ebenfalls zwei Schilde: der Sternalschild und der Genitalschild. ³⁴²¹Alle Beine weisen Borsten und Stacheln auf. ³⁴²²Die Borsten sorgen für die nötige Haftung beim Fortbewegen im oder auf dem Boden. ³⁴²³Das erste Beinpaar hat vorwiegend Antennenfunktion. ³⁴²⁴Das zweite Beinpaar dient nicht nur zur Fortbewegung, sondern auch zum Greifen der Beute. ³⁴²⁵Die Dornen des vierten Beinpaars können sowohl als Schutz als auch zum ‚Antrieb‘ dienen (28). ³⁴²⁶Männliche Tiere sind 0,55-0,65 mm lang und wiegen 10-15 μg. ³⁴²⁷Weibliche Tiere haben eine Länge von 0,8-0,9 mm und ein Gewicht von 50-60 μg (8) (28) (siehe Abb. 1).
Abb. 1
Weibliche und männliche Milben, Protonymphen und Larven von H. aculeifer
 Bei 23 °C werden die Milben nach 16 Tagen (weibliche Tiere) bzw. nach 18 Tagen (männliche Tiere) geschlechtsreif (6). ³⁴²⁹Die weiblichen Tiere nehmen das Sperma über das Solenostom auf, von wo es in das Ovar gelangt. ³⁴³⁰Dort werden die Spermien aufbewahrt und reifen heran. ³⁴³¹Die Befruchtung erfolgt erst nach der Ausreifung der Spermien im Ovar. ³⁴³²Befruchtete und unbefruchtete Eier werden von den Weibchen in Klumpen oder einzeln vorzugsweise in Spalten oder Löchern abgelegt. ³⁴³³Kopulierte Weibchen können Juvenile beider Geschlechter erzeugen; aus Eiern nicht kopulierter Weibchen gehen ausschließlich männliche Tiere hervor. ³⁴³⁴Bei der Entwicklung zur adulten Phase werden der vier Stadien (Ei – Larve, Larve – Protonymphe, Protonymphe – Deutonymphe, Deutonymphe – adultes Tier) durchlaufen.³⁴³⁵Die Eier sind milchig weiß, hyalin, elliptisch und etwa 0,37 mm lang mit fester Hülle. ³⁴³⁶Nach (8) sind die Larven 0,42-0,45 mm groß. ³⁴³⁷Sie haben nur drei Beinpaare. ³⁴³⁸Im Kopfbereich werden Palpen und Cheliceren ausgebildet. ³⁴³⁹Die Cheliceren besitzen einige wenige kleine Zähnchen; diese werden für den Schlupfvorgang genutzt. ³⁴⁴⁰Nach der ersten Häutung, 1-2 Tage nach dem Schlüpfen, entwickeln sich die Protonymphen. ³⁴⁴¹Sie sind ebenfalls weiß, 0,45-0,62 mm lang (8) und haben vier Beinpaare. ³⁴⁴²Die Zähne auf den Cheliceren sind vollständig ausgebildet. ³⁴⁴³Ab diesem Stadium beginnen die Milben zu fressen. ³⁴⁴⁴Dazu wird die Cuticula der Beute mit den Cheliceren durchstochen und ein Sekret für die extraintestinale Verdauung in die Beute gespritzt. ³⁴⁴⁵Der Nahrungsbrei kann dann von der Milbe aufgesaugt werden. ³⁴⁴⁶Die Cheliceren dienen auch dazu, größere Teilchen aus Futterklumpen zu reißen (28). ³⁴⁴⁷Nach einer weiteren Häutung entstehen die Deutonymphen. ³⁴⁴⁸Sie sind 0,60-0,80 mm lang (8) und gelblich bis hellbraun. ³⁴⁴⁹Ab dieser Phase können weibliche und männliche Tiere unterschieden werden. ³⁴⁵⁰Nach einer weiteren Ecdysis, während der die Tiere inaktiv sind und sich der braune Schild entwickelt (etwa nach 14 Tagen), ist das adulte Stadium erreicht (28) (29) (30). ³⁴⁵¹Die Lebenserwartung der Milben liegt bei einer Temperatur von 25 °C zwischen 48 und 100 Tagen (27).
Anlage 8
Zusammenfassung und Zeitrahmen für die wichtigsten Verfahrensschritte zur Durchführung des Hypoaspis-Tests
Zeit (Tage)Testbeginn = Tag 0
| Verfahrensschritt / Aufgabe | Tag – 35bis – 28
| Übertragung der Weibchen aus der Stammkultur in saubere Gefäße, um die Synchronisation zu starten.2 Tage später: Entnahme der weiblichen Tiere
zwei- oder dreimal wöchentlich: Bereitstellung einer ausreichenden Futtermenge
| | Tag – 5 (+/– 2) | Herstellung des künstlichen Bodens | | Tag – 4 (+/– 2) | Bestimmung der Wasserhaltekapazität (WHC) des künstlichen BodensTrocknen über Nacht
Nächster Tag: Wiegen der Proben und WHC-Berechnung
| | Tag – 4 (+/– 2) | Befeuchten des künstlichen Bodens bis 20-30 % WHC | | Tag 0 | Beginn des Tests: Zugabe der Prüfchemikalie zum künstlichen BodenEinsetzen von 10 Weibchen je Replikat
Wiegen der einzelnen Replikate
Herstellung abiotischer Kontrollen (für Feuchte und pH-Wert), pro Konzentration zwei Replikate
Trocknen der Feuchtigkeitskontrollen über Nacht
Nächster Tag: Wiegen der Feuchtigkeitskontrollen
Nächster Tag: Messen des pH-Werts der getrockneten abiotischen Kontrollen
| | Tage 3, 6, 9, 12 (etwa) | Versorgen der einzelnen Replikate mit ausreichender Menge BeuteorganismenWiegen der einzelnen Replikate und ggf. Zugabe von Wasser
| | Tag 14 | Beenden des Tests; Vorbereiten der Extraktion (alle Replikate)und der ExtraktionseffizienzkontrollenTrocknen der Kontrollen über Nacht
Nächster Tag: Wiegen der Wassergehaltskontrollen
Nächster Tag: Messen des pH-Werts der getrockneten Kontrollen
| | Tage16 | Beenden der Extraktion | | Tag 16+ | Aufzeichnung der Anzahl adulter und juveniler Milben im extrahierten MaterialEintragen der Ergebnisse in Tabellen
Bericht über das Prüfverfahren auf Protokollbögen
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C.37. 21-TAGE FISCH-SCREENING-ASSAY: EIN KURZZEITTEST ZUR BESTIMMUNG DER ÖSTROGENEN UND ANDROGENEN AKTIVITÄT UND DER AROMATASEHEMMUNGEINLEITUNG
| 1. | ³⁴⁵⁴Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 230 (2009). ³⁴⁵⁵Die Entwicklung und Validierung eines Fischtests, mit dem bestimmte endokrin aktive Chemikalien nachgewiesen können, geht auf die Befürchtung zurück, dass in der Umwelt vorhandene Chemikalien aufgrund ihrer Interaktion mit dem endokrinen System die Gesundheit von Mensch und Natur gefährden. 1998 hat die OECD vorrangig mit der Änderung bestehender und der Entwicklung neuer Leitlinien für Screening-Tests und die Untersuchung potenziell endokriner Disruptoren begonnen. ³⁴⁵⁶Ein Teil dieser Arbeit bestand in der Entwicklung einer technischen Leitlinie für das Screening von Chemikalien mit Wirkung auf das endokrine System von Fischen. ³⁴⁵⁷Der 21-Tage-Fisch-Screening-Assay wurde im Rahmen laborübergreifender Untersuchungen an ausgewählten Chemikalien umfassend validiert, um die Relevanz und die Zuverlässigkeit des Assay für den Nachweis östrogen wirksamer und aromatasehemmender Chemikalien (1)(2)(3)(4)(5) bei den drei untersuchten Fischarten (Dickkopfelritze, Japanischer Reiskärpfling und Zebrabärbling) zu demonstrieren. ³⁴⁵⁸Bei Dickkopfelritzen und bei Japanischen Reiskärpflingen kann androgene Aktivität nachgewiesen werden, nicht aber bei Zebrabärblingen. ³⁴⁵⁹Anti-androgen wirkende Chemikalien können mit dieser Prüfmethode nicht nachgewiesen werden. Die Validierungsarbeit wurde von einer Gruppe von Experten, die von den nationalen Koordinatoren des Prüfrichtlinien-Programms ernannt wurden, einer Peer-Review unterzogen (6). ³⁴⁶⁰Der Test ist nicht dafür vorgesehen, spezifische endokrinschädigende Wirkmechanismen zu identifizieren, denn die getesteten Fische besitzen eine intakte Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HHG-Achse), die auf unterschiedlichen Ebenen auf Chemikalien, die auf die HHG-Achse einwirken, reagieren kann. Der Kurzzeit-Reproduktionstest an Fischen (Fish Short Term Reproduction Assay, FSTRA) (OECD TG 229) umfasst Fruchtbarkeits- und gegebenenfalls histopathologische Gonaden-Untersuchungen bei Dickkopfelritzen sowie sämtliche unter diese Prüfmethode fallenden Endpunkte. ³⁴⁶¹Die OECD-Prüfrichtlinie TG 229 sieht ein Screening von Chemikalien vor, die die Reproduktion durch unterschiedliche Mechanismen (u. a. durch endokrine Prozesse) beeinflussen. ³⁴⁶²Dem sollte Rechnung getragen werden, bevor über die geeignetste Prüfmethode entschieden wird. |
| 2. | ³⁴⁶³Die vorliegende Prüfmethode entspricht einem In-vivo-Screening-Assay, bei dem geschlechtsreife männliche und weibliche Fische gemeinsam gehalten und für einen begrenzten Teil ihres Lebenszyklus (21 Tage) einer Chemikalie ausgesetzt werden. ³⁴⁶⁴Nach dieser 21-tägigen Exposition werden je nach verwendeter Art bei männlichen und weiblichen Fischen ein oder zwei Biomarker-Endpunkte als Indikatoren einer östrogenen, aromatosehemmenden oder androgenen Wirkung der Prüfchemikalie gemessen. ³⁴⁶⁵Diese Endpunkte sind Vitellogenin und sekundäre Geschlechtsmerkmale. ³⁴⁶⁶Vitellogenin wird bei Dickkopfelritzen, bei Japanischen Reiskärpflingen und bei Zebrabärblingen gemessen, die sekundären Geschlechtsmerkmale hingegen nur bei Dickkopfelritzen und Japanischen Reiskärpflingen. |
| 3. | Dieser Bioassay dient dem In-vivo-Screening bestimmter endokriner Wirkungsweisen und ist im Zusammenhang mit dem ‚OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals‘ (28) zu sehen. |
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN | 4. | ³⁴⁶⁸Vitellogenin (VTG) wird gewöhnlich von der Leber weiblicher oviparer Vertebraten in Reaktion auf im Blutkreislauf zirkulierendes endogenes Östrogen produziert. ³⁴⁶⁹VTG ist ein Vorläufer von Eidotterproteinen und wandert, einmal in der Leber produziert, über die Blutbahn zum Eierstock, wo es aufgenommen und von sich entwickelnden Eiern modifiziert wird. ³⁴⁷⁰Vitellogenin ist im Plasma noch nicht geschlechtsreifer weiblicher und männlicher Fische kaum nachweisbar, da sich bei diesen noch nicht genügend zirkulierendes Östrogen gebildet hat. ³⁴⁷¹Die Leber kann Vitellogenin jedoch in Reaktion auf eine exogene Östrogenstimulation synthetisieren und absondern. |
| 5. | ³⁴⁷²Die Messung der VTG-Konzentration ermöglicht den Nachweis von Chemikalien mit unterschiedlichen östrogenen Wirkungsweisen. ³⁴⁷³Östrogen wirksame Chemikalien können durch Messung der VTG-Induktion bei männlichen Fischen nachgewiesen werden, was in wissenschaftlichen Veröffentlichungen mit Peer Review umfassend dokumentiert wurde (z. B. (7)). ³⁴⁷⁴VTG-Induktion wurde auch nach Exposition gegenüber aromatisierbaren Androgenen nachgewiesen (8)(9). ³⁴⁷⁵Eine Reduktion des im Körper weiblicher Tiere zirkulierenden Östrogens, beispielsweise durch Hemmung der Aromatase, die endogenes Androgen in das natürliche Östrogen 17β-Östradiol umwandelt, bewirkt eine Verringerung der VTG-Konzentration, die zum Nachweis von Chemikalien mit aromatasehemmenden Eigenschaften verwendet wird (10)(11). ³⁴⁷⁶Die biologische Relevanz der VTG-Reaktion nach einer Östrogen-/Aromatasehemmung ist erwiesen und wurde umfassend dokumentiert. ³⁴⁷⁷Die VTG-Produktion bei weiblichen Tieren kann aber auch durch allgemeine Toxizität und nicht endokrine toxische Wirkungen (z. B. Hepatotoxizität) beeinflusst werden. |
| 6. | ³⁴⁷⁸Für Routinemessungen haben sich verschiedene standardisierte Verfahren bewährt, so der artspezifische ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), bei dem das in kleinen Blut- oder Leberproben einzelner Fische produzierte Vitellogenin immundiagnostisch quantifiziert wird (12)(13)(14)(15)(16)(17)(18). ³⁴⁷⁹Die VTG-Messungen werden an Blutproben und/oder Kopf-/Schwanz-Homogenaten von Dickkopfelritzen und Zebrabärblingen sowie an Leberproben Japanischer Reiskärpflinge vorgenommen. ³⁴⁸⁰Bei Japanischen Reiskärpflingen besteht eine ausgeprägte Korrelation zwischen dem im Blut und in der Leber gemessenen VTG (19). ³⁴⁸¹Anlage 6 enthält Empfehlungen für Verfahren zur Entnahme von Proben für Vitellogenin-Analysen. ³⁴⁸²Kits für Vitellogenin-Messungen sind allgemein erhältlich; sie sollten auf einem validierten artspezifischen ELISA beruhen. |
| 7. | ³⁴⁸³Sekundäre Geschlechtsmerkmale männlicher Fische bestimmter Arten sind äußerlich sichtbar und quantifizierbar und reagieren auf zirkulierende Mengen endogen wirkender Androgene. ³⁴⁸⁴Dies gilt für Dickkopfelritzen und für Japanische Reiskärpflinge, nicht aber für Zebrabärblinge, die keine quantifizierbaren sekundären Geschlechtsmerkmale besitzen. ³⁴⁸⁵Weibliche Tiere behalten die Fähigkeit bei, sekundäre männliche Geschlechtsmerkmale zu entwickeln, wenn sie in Wasser androgen wirksamen Chemikalien ausgesetzt werden. ³⁴⁸⁶In der Fachliteratur wird auf mehrere Studien hingewiesen, die diese Art von Reaktion bei Dickkopfelritzen (20) und Japanischen Reiskärpflingen (21) belegen. ³⁴⁸⁷Ein Rückgang sekundärer Geschlechtsmerkmale bei männlichen Fischen sollte aufgrund der geringen statistischen Aussagekraft mit Vorsicht interpretiert werden; jede Wertung sollte sich auf Expertenurteile und die Beweiskraft der Daten stützen. ³⁴⁸⁸Zebrabärblinge sind für diesen Test nur begrenzt geeignet, da quantifizierbare sekundäre Geschlechtsmerkmale fehlen, die auf androgen wirksame Chemikalien reagieren könnten. |
| 8. | ³⁴⁸⁹Bei Dickkopfelritzen ist die Zahl der Laichknoten (‚Nuptialtuberkel‘) am Maul weiblicher Fische Hauptindikator einer exogenen Androgenexposition. ³⁴⁹⁰Wichtigster Marker einer exogenen Exposition gegenüber androgen wirkenden Chemikalien bei weiblichen Japanischen Reiskärpflingen ist die Zahl der Papillenprozesse. ³⁴⁹¹Die Anlagen 5A und 5B enthalten Empfehlungen für Verfahren zur Bewertung von Geschlechtsmerkmalen bei Dickkopfelritzen bzw. Japanischen Reiskärpflingen. |
| 9. | Für Begriffsbestimmungen zu dieser Prüfmethode siehe Anlage 1. |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 10. | ³⁴⁹²Beim Assay werden geschlechtsreife männliche und weibliche Fische in Prüfgefäßen gemeinsam einer Prüfchemikalie ausgesetzt. ³⁴⁹³Da die Tiere ausgewachsen und geschlechtsreif sind, kann leicht zwischen den Geschlechtern unterschieden und folglich eine geschlechtsspezifische Analyse der einzelnen Endpunkte vorgenommen werden, und die Sensitivität gegenüber exogenen Chemikalien ist gewährleistet. ³⁴⁹⁴Bei Testende wird das Geschlecht der Fische durch makroskopische Untersuchung der Gonaden nach bauchseitiger Öffnung des Abdomens mit einer Schere bestimmt. ³⁴⁹⁵Anlage 2 fasst die wichtigsten Bedingungen des Bioassays zusammen. ³⁴⁹⁶Der Test wird gewöhnlich mit einer Auswahl an Fischen aus einer Laichpopulation begonnen; seneszente Tiere sollten nicht verwendet werden. ³⁴⁹⁷Der Abschnitt über die Auswahl der Fische enthält Hinweise zum Alter und zur Geschlechtsreife der Fische. ³⁴⁹⁸Der Test wird mit drei Konzentrationen der Prüfchemikalie und einer Wasserkontrolle sowie erforderlichenfalls einer Lösungsmittelkontrolle durchgeführt. ³⁴⁹⁹Bei Japanischen Reiskärpflingen und bei Zebrabärblingen werden je Konzentration zwei Gefäße oder Replikate verwendet (jedes Gefäß mit fünf männlichen und fünf weiblichen Fischen); bei Dickkopfelritzen sind je Konzentration vier Gefäße oder Replikate zu verwenden (jedes Gefäß mit zwei männlichen und vier weiblichen Fischen), um dem Territorialverhalten männlicher Dickkopfelritzen Rechnung zu tragen und gleichzeitig hinreichende Aussagekraft zu gewährleisten. ³⁵⁰⁰Die Exposition erfolgt über einen Zeitraum von 21 Tagen; die Fische werden an Tag 21 nach Beginn der Exposition beprobt. |
| 11. | ³⁵⁰¹Am Tag der Beprobung (Tag 21) sind alle Tiere möglichst schmerzfrei zu töten. ³⁵⁰²Bei Dickkopfelritzen und Japanischen Reiskärpflingen werden sekundäre Geschlechtsmerkmale gemessen (siehe Anlagen 5A und 5B). ³⁵⁰³Zur Bestimmung der VTG-Konzentration werden von Zebrabärblingen und Dickkopfelritzen Blutproben entnommen; alternativ kann die VTG-Konzentration bei Zebrabärblingen auch anhand von Kopf- und Schwanzproben ermittelt werden (Anlage 6); bei Japanischen Reiskärpflinge werden zur VTG-Analyse Leberproben entnommen (Anlage 6). |
GÜLTIGKEITSKRITERIEN | 12. | Die Testergebnisse sind gültig, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind:- —
- Die Mortalität in den Wasser- (oder Lösungsmittel-)kontrollen darf am Ende der Exposition höchstens 10 % betragen;
- —
- die Konzentration an gelöstem Sauerstoff sollte während der gesamten Exposition mindestens 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts betragen;
- —
- die Wassertemperatur der Prüfgefäße sollte während der Exposition zu keinem Zeitpunkt um mehr als ± 1,5 °C schwanken und bei einer Toleranz von 2 °C in dem Temperaturbereich liegen, der für die Testspezies vorgesehen ist (Anlage 2);
- —
- es muss belegt werden, dass die Konzentrationen der Prüfchemikalie in der Lösung mit einer Toleranz von ± 20 % bezogen auf die gemessenen Mittelwerte aufrechterhalten wurden.
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BESCHREIBUNG DER METHODEApparatur
| 13. | Übliche Laborausrüstung und insbesondere die folgenden Geräte:- a)
- Sauerstoff- und pH-Messgeräte;
- b)
- Geräte zur Messung von Wasserhärte und Alkalität;
- c)
- geeignete Apparaturen zur Temperaturregelung und einer möglichst kontinuierlichen Überwachung;
- d)
- Becken aus chemisch inertem Material und mit für das empfohlene Besatzverhältnis und die empfohlene Besatzdichte geeignetem Fassungsvermögen (siehe Anlage 2);
- e)
- Laichsubstrat für Dickkopfelritzen und Zebrabärblinge (für Einzelheiten siehe Anlage 4);
- f)
- eine Waage mit angemessener Genauigkeit (± 0,5 mg).
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Wasser | 14. | ³⁵⁰⁶Als Testwasser kann jedes beliebige Wasser verwendet werden, in dem die Testspezies über einen längeren Zeitraum überleben und wachsen können. ³⁵⁰⁷Während der gesamten Testdauer sollte eine konstante Wasserqualität gewährleistet sein. ³⁵⁰⁸Der pH-Wert des Wassers sollte im Bereich 6,5-8,5 liegen und im Test um nicht mehr als ± 0,5 pH-Einheiten schwanken. ³⁵⁰⁹Um sicherzustellen, dass das Verdünnungswasser das Testergebnis nicht übermäßig stark beeinflusst (beispielsweise durch Komplexierung der Prüfchemikalie), sind regelmäßig Proben zu analysieren. Das Wasser ist auf Schwermetalle (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd und Ni), dominante Anionen und Kationen (z. B. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– und SO42–), Pestizide (z. B. den Gesamtgehalt an phosphororganischen und chlororganischen Pestiziden), den gesamten organischen Kohlenstoff und suspendierte Feststoffe zu untersuchen (beispielsweise alle drei Monate, wenn bekannt ist, dass das Wasser qualitativ gesehen relativ konstant ist). ³⁵¹⁰Ist die Wasserqualität nachweislich mindestens ein Jahr lang konstant geblieben, so können die Analysen seltener durchgeführt und die Abstände zwischen den Analysen verlängert werden (beispielsweise auf sechs Monate). ³⁵¹¹Einige chemische Merkmale akzeptablen Verdünnungswassers sind in Anlage 3 gegeben. |
Testlösungen | 15. | ³⁵¹²Die Testlösungen werden durch Verdünnung einer Stammlösung in den gewünschten Konzentrationen zubereitet. ³⁵¹³Die Stammlösung sollte möglichst durch einfaches mechanisches Vermischen oder Schütteln (z. B. durch Rühren oder mit Ultraschall) der Prüfchemikalie in Verdünnungswasser hergestellt werden. ³⁵¹⁴Zur Herstellung einer Stammlösung in geeigneter Konzentration können Sättigungssäulen (Löslichkeitssäulen) verwendet werden. ³⁵¹⁵Die Verwendung von Lösungsmittelträgern wird nicht empfohlen. ³⁵¹⁶Ist jedoch ein Lösungsmittel erforderlich, so sollte zeitgleich in derselben Lösungsmittelkonzentration wie bei der chemischen Behandlung eine Lösungsmittelkontrolle verwendet werden. Bei schwierigen Prüfchemikalien kann die Verwendung eines Lösungsmittels aus technischer Sicht die beste Lösung darstellen (siehe OECD Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures) (22). ³⁵¹⁷Welches Lösungsmittel zu verwenden ist, hängt von den chemischen Eigenschaften der Chemikalie ab. ³⁵¹⁸Der OECD-Leitfaden empfiehlt höchstens 100 μl/l; dieser Wert sollte eingehalten werden. ³⁵¹⁹In einer kürzlich durchgeführten Untersuchung (23) wurde jedoch auf weitere Bedenken hinsichtlich der Verwendung von Lösungsmitteln in Tests zur Prüfung endokriner Wirkungen verwiesen. ³⁵²⁰Daher sollte die Lösungsmittelkonzentration (wenn überhaupt ein Lösungsmittel verwendet werden muss) so weit wie technisch möglich minimiert werden (je nach physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfchemikalie). |
| 16. | ³⁵²¹Für den Test ist ein Durchflusssystem zu verwenden. ³⁵²²Ein solches System gibt kontinuierlich eine Stammlösung der Prüfchemikalie ab und verdünnt diese (z. B. mit einer Dosierpumpe, einem Proportionalverdünner oder einer Sättigungsvorrichtung), damit unterschiedliche Konzentrationen in die Prüfkammern gelangen. ³⁵²³Die Durchflussraten von Stammlösungen und Verdünnungswasser sind während des Tests regelmäßig — vorzugsweise täglich — zu kontrollieren und dürfen während des Tests um höchstens 10 % schwanken. ³⁵²⁴Insbesondere sind Kunststoffleitungen aus minderwertigem Material oder sonstige Materialien zu vermeiden, die biologisch aktive Chemikalien enthalten könnten. ³⁵²⁵Bei der Auswahl des Materials für das Durchflusssystem ist eine mögliche Adsorption der Prüfchemikalie an das Material zu berücksichtigen. |
Halten der Fische | 17. | ³⁵²⁶Die zu testenden Fische sollten aus einer Laborpopulation stammen, vorzugsweise aus einem einzelnen Bestand, der mindestens zwei Wochen vor dem Test bei ähnlicher Wasserqualität und ähnlichen Lichtverhältnissen wie im Test akklimatisiert wurde. ³⁵²⁷Besatz(verhältnis) und Besatzdichte (Begriffsbestimmungen siehe Anlage 1) müssen der jeweils verwendeten Art entsprechen (siehe Anlage 2). |
| 18. | Nach einer 48-stündigen Akklimatisierung werden die Mortalitäten erfasst; dabei gelten die folgenden Kriterien::- —
- Bei Mortalitäten von mehr als 10 % der Population innerhalb von sieben Tagen: Die gesamte Charge verwerfen.
- —
- Bei Mortalitäten zwischen 5 und 10 % der Population: Akklimatisierung der Fische für weitere sieben Tage; wenn die Mortalität auch in den zusätzlichen sieben Tagen noch über 5 % liegt: die gesamte Charge verwerfen.
- —
- Bei Mortalitäten von weniger als 5 % der Population innerhalb sieben Tagen wird die Charge akzeptiert.
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| 19. | Während der Akklimatisierung, der Präexposition und der eigentlichen Exposition sollten Fische nicht gegen Krankheiten behandelt werden. |
Präexposition und Auswahl der Fische | 20. | ³⁵³²Eine einwöchige Präexposition wird empfohlen; dabei werden die Fische in prüfgefäßähnliche Becken gesetzt. Während der gesamten Haltungsdauer und während der Exposition werden die Fische ad libitum gefüttert. ³⁵³³Die Expositionsphase beginnt mit sexuell dimorphen adulten, aktiv laichenden Fischen aus einer Laborpopulation geschlechtsreifer Tiere (z. B. mit deutlichen sekundären Geschlechtsmerkmalen bei Dickkopfelritzen und bei Japanischen Reiskärpflingen). ³⁵³⁴Als Faustregel (nur im Kontext der Beobachtung des tatsächlichen Reproduktionsstatus einer bestimmten Charge anzuwenden) gilt, dass Dickkopfelritzen ca. ³⁵³⁵20 (± 2) Wochen alt sein sollten, vorausgesetzt, sie wurden während ihrer gesamten Lebensdauer bei einer Temperatur von 25 ± 2 °C gehalten. ³⁵³⁶Unter denselben Bedingungen sollten Japanische Reiskärpflinge etwa 16 (± 2) Wochen alt sein. ³⁵³⁷Zebrabärblinge sollten etwa 16 (± 2) Wochen alt sein, sofern sie während ihres gesamten Lebens bei 26 ± 2 °C gehalten wurden. |
VERSUCHSPLAN | 21. | ³⁵³⁸Für den Test sind drei Konzentrationen der Prüfchemikalie, eine Kontrolle (Wasser) und erforderlichenfalls eine Lösungsmittelkontrolle zu verwenden. ³⁵³⁹Die Daten können analysiert werden, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen Behandlungs- und Kontrollreaktion festzustellen. ³⁵⁴⁰Diese Analysen dienen eher der Feststellung, ob die Chemikalie in weiteren Langzeittests auf unerwünschte Wirkungen (nämlich Überleben, Entwicklung, Wachstum und Reproduktion) untersucht werden muss, als der Verwendung für Risikobewertungen (24). |
| 22. | Bei Zebrabärblingen und bei Japanischen Reiskärpflingen werden an Tag 21 des Assay männliche und weibliche Tiere aus jeder Konzentrationsgruppe (jedes Replikat enthält 5 männliche und 5 weibliche Fische) und aus der/den Kontrollgruppe(n) für die Untersuchung auf Vitellogenin und sekundäre Geschlechtsmerkmale beprobt; bei den Dickkopfelritzen werden an Tag 21 der Exposition männliche und weibliche Tiere (jedes der vier Replikate enthält 2 männliche und 4 weibliche Fische), auch aus der/den Kontrollgruppe(n), für die Untersuchung auf Vitellogenin und sekundäre Geschlechtsmerkmale beprobt. |
Auswahl der Testkonzentrationen | 23. | ³⁵⁴²Für die Zwecke dieses Assay sollte die höchste Testkonzentration auf die in einem Vorversuch bestimmte oder aus anderen Toxizitätsdaten hervorgehende höchste noch verträgliche Konzentration (Maximum Tolerated Concentration, MTC) oder auf 10 mg/l oder auf den Höchstwert der Wasserlöslichkeit festgesetzt werden, je nach dem, welcher Wert der niedrigere ist. ³⁵⁴³Der MTC-Wert gilt als die höchste Testkonzentration der Chemikalie, bei der die Mortalität weniger als 10 % beträgt. ³⁵⁴⁴Dieser Ansatz geht davon aus, dass empirische Daten zur akuten Toxizität oder sonstige Toxizitätsdaten vorliegen, anhand deren der MTC-Wert bestimmt werden kann. ³⁵⁴⁵Die Schätzung des MTC-Wertes kann ungenau sein und setzt in der Regel Fachkenntnis voraus. |
| 24. | ³⁵⁴⁶Benötigt werden drei Testkonzentrationen mit einem konstanten Abstandsfaktor von maximal 10 und eine Verdünnungswasserkontrolle (sowie bei Bedarf eine Lösungsmittelkontrolle). ³⁵⁴⁷Empfohlen werden Abstandsfaktoren zwischen 3,2 und 10. |
VERFAHRENAuswahl und Wiegen der Testfische
| 25. | ³⁵⁴⁸Wichtig ist, dass die Gewichtsunterschiede der Fische zu Beginn des Tests möglichst gering sind. ³⁵⁴⁹Für geeignete Größenbereiche für die empfohlenen Testspezies siehe Anlage 2. Bei der gesamten Charge der in diesem Test verwendeten Fische sollte bei männlichen und weiblichen Tieren das individuelle Gewicht möglichst im Bereich von ± 20 % des arithmetischen Mittelgewichts der Fische gleichen Geschlechts liegen. ³⁵⁵⁰Um das Mittelgewicht zu bestimmen, wird empfohlen, vor dem Test eine Teilprobe des Fischbestands zu wiegen. |
ExpositionsbedingungenDauer
| 26. | Der Test dauert 21 Tage nach vorheriger (möglichst einwöchiger) Präexposition. |
Fütterung | 27. | ³⁵⁵²Die Fische werden ad libitum so oft mit geeignetem Futter (Anlage 2) versorgt, wie für eine normale Entwicklung der Tiere nötig ist. ³⁵⁵³Dabei ist darauf zu achten, dass es nicht zu einer Vermehrung von Mikroorganismen und nicht zu einer Eintrübung des Wassers kommt. ³⁵⁵⁴Im Allgemeinen kann die Tagesration auf zwei oder drei gleiche Portionen verteilt werden, die in mindestens dreistündigem Abstand zu verabreichen sind. ³⁵⁵⁵Insbesondere an Wochenenden kann eine einzige, größere Ration gegeben werden. ³⁵⁵⁶12 Stunden vor der Probenahme/Sektion sollten die Fische nicht mehr gefüttert werden. |
| 28. | ³⁵⁵⁷Das Fischfutter ist auf Verunreinigungen wie chlororganische Pestizide, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) und polychlorierte Biphenyle (PCB) zu untersuchen. ³⁵⁵⁸Futter mit erhöhtem Gehalt an Phytoöstrogenen, die die Testreaktion auf bekannte Östrogenagonisten (z. B. 17-beta-Östradiol) beeinträchtigen würden, darf nicht verwendet werden. |
| 29. | Nicht aufgenommenes Futter und Fäkalien sind mindestens zweimal wöchentlich aus den Prüfgefäßen zu entfernen (etwa durch vorsichtiges Absaugen vom Beckenboden). |
Licht und Temperatur | 30. | Die Photoperiode (Hell-/Dunkel-Phasen) und die Wassertemperatur müssen Testspezies entsprechen (siehe Anlage 2). |
Häufigkeit der Analysen und Messungen | 31. | ³⁵⁶¹Vor Beginn der Exposition ist zu überprüfen, ob die Chemikalienbeschickung einwandfrei funktioniert. ³⁵⁶²Es dürfen ausschließlich anerkannte Analysemethoden angewandt werden, und die Stabilität der Chemikalie im Prüfsystem muss hinreichend bekannt sein. ³⁵⁶³Während des Tests sind die Konzentrationen der Prüfchemikalie in regelmäßigen Zeitabständen wie folgt zu bestimmen: Die Zuflussmengen der Verdünnungslösung und der Stammlösung der Prüfchemikalie sind regelmäßig — vorzugsweise täglich, jedoch mindestens zweimal wöchentlich — zu kontrollieren und sollten während des gesamten Tests um maximal 10 % schwanken. ³⁵⁶⁴Die tatsächlichen Konzentrationen der Prüfchemikalie sollten zu Beginn des Tests in allen Gefäßen und danach wöchentlich gemessen werden. |
| 32. | ³⁵⁶⁵Die Ergebnisse sollten auf gemessenen Konzentrationen basieren. ³⁵⁶⁶Wurde die Konzentration der Chemikalienlösung während des gesamten Tests jedoch zufriedenstellend innerhalb der nominellen Konzentration ((± 20 %) gehalten, so können sich die Ergebnisse auf die nominalen oder die gemessenen Werte beziehen. |
| 33. | ³⁵⁶⁷Unter Umständen müssen die Proben gefiltert (z. B. mit Filtern einer Porengröße von 0,45 μm) oder zentrifugiert werden. ³⁵⁶⁸Erforderlichenfalls ist Zentrifugierung vorzuziehen. ³⁵⁶⁹Prüfchemikalien, die sich nachweislich nicht an Filter adsorbieren, können auch filtriert werden. |
| 34. | ³⁵⁷⁰Während des Tests sollten bei allen Prüfgefäßen mindestens einmal wöchentlich der gelöste Sauerstoff, die Temperatur und der pH-Wert gemessen werden. ³⁵⁷¹Die Gesamthärte und die Gesamtalkalität sollten in den Kontrollen und in einem Gefäß mit höchster Testkonzentration ebenfalls mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. ³⁵⁷²Es wird empfohlen, dass die Temperatur in mindestens einem Prüfgefäß kontinuierlich überwacht wird. |
Beobachtungen | 35. | ³⁵⁷³Im Laufe oder am Ende des Assay sind verschiedene allgemeine Reaktionen (z. B. Überleben) sowie spezifische biologische Reaktionen (z. B. Vitellogenin-Gehalt) zu bestimmen. ³⁵⁷⁴Die Messung und Auswertung dieser Endpunkte und die Verwendbarkeit der Ergebnisse werden im Folgenden erläutert. |
Überleben | 36. | ³⁵⁷⁵Die Fische sind während des Tests täglich zu kontrollieren; Todesfälle sind zu protokollieren und tote Fische sobald wie möglich zu entfernen. ³⁵⁷⁶Tote Fische dürfen weder in Kontroll- noch in Prüfgefäße eingesetzt werden. ³⁵⁷⁷Das Geschlecht der im Test gestorbenen Fische wird durch makroskopische Gonadenuntersuchung bestimmt. |
Verhalten und Aussehen | 37. | ³⁵⁷⁸Jegliches anomale Verhalten (gemessen an den Kontrollen) ist zu protokollieren. ³⁵⁷⁹Dies gilt für Anzeichen allgemeiner Toxizität ebenso wie für Hyperventilation, unkoordinierte Schwimmbewegungen, Gleichgewichtsverluste und atypische Apathie oder ungewöhnliches Fressverhalten. ³⁵⁸⁰Zudem sind äußerliche Auffälligkeiten (z. B. Blutungen oder Verfärbungen) aufzuzeichnen. ³⁵⁸¹Derartige Anzeichen einer toxischen Wirkung sind bei der Datenauswertung insoweit sorgfältig zu berücksichtigen, als sie auf Konzentrationen hinweisen können, bei denen die Biomarker endokriner Wirkungen keine zuverlässigen Rückschlüsse gestatten. ³⁵⁸²Diese Verhaltensauffälligkeiten können auch wertvolle qualitative Informationen liefern, an denen sich künftige Fischtests orientieren können. ³⁵⁸³Bei Dickkopfelritzen wurde unter Einwirkung von Androgenen beispielsweise aggressives Territorialverhalten bei normalen Männchen oder maskulinisierten Weibchen beobachtet. ³⁵⁸⁴Bei Zebrabärblingen hemmen Östrogene oder Anti-Androgene das typische Paarungs- und Laichverhalten bei einsetzender Morgendämmerung. |
| 38. | ³⁵⁸⁵Da sich verschiedene äußere Merkmale (in erster Linie die Farbe) beim Hantieren der Fische rasch verändern können, sind qualitative Beobachtungen vor der Entnahme von Fischen aus dem Prüfsystem wichtig: Bisherige Erfahrungen mit Dickkopfelritzen führen zu dem Schluss, dass einige endokrin wirkende Chemikalien anfangs zu Veränderungen der folgenden äußeren Merkmale führen: Körperfarbe (hell oder dunkel), Farbmusterung (Auftreten vertikaler Streifen) und Körperform (im Kopf- oder Schwanzbereich). ³⁵⁸⁶Daher muss im Laufe und am Ende des Tests das äußere Erscheinungsbild der Fische kontrolliert werden. |
Schmerzfreies Töten | 39. | ³⁵⁸⁷An Tag 21, d. h. bei Ablauf der Expositionsdauer, sind die Fische mit angemessenen Mengen Tricain (Tricainmethansulfonat, Metacain, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l gepuffert mit 300 mg/l NaHCO3 (Natriumbicarbonat, CAS 144-55-8) zu töten, um Schleimhautreizungen zu begrenzen. ³⁵⁸⁸Anschließend wird zur Vitellogenin-Bestimmung Blut oder Gewebe entnommen, wie im Abschnitt über Vitellogenin beschrieben. |
Untersuchung sekundärer Geschlechtsmerkmale | 40. | ³⁵⁸⁹Manche endokrin wirkende Chemikalien können Veränderungen spezifischer sekundärer Geschlechtsmerkmale (Anzahl Laichknoten (‚Nuptialtuberkel‘) bei männlichen Dickkopfelritzen oder bei männlichen Japanischen Reiskärpflingen) zur Folge haben. ³⁵⁹⁰Insbesondere Papillenprozesse Chemikalien mit bestimmten Wirkungsweisen können bei Tieren des jeweils anderen Geschlechts zu Anomalien der sekundären Geschlechtsmerkmale führen. ³⁵⁹¹So können Androgenrezeptor-Agonisten wie Trenbolon, Methyltestosteron und Dihydrotestosteron bewirken, dass weibliche Dickkopfelritzen ausgeprägten Laichausschlag (‚Nuptialtuberkel‘) entwickeln oder dass bei weiblichen Japanischen Reiskärpflingen Papillenprozesse auftreten (11)(20)(21). ³⁵⁹²Außerdem wurde berichtet, dass Östrogenrezeptor-Agonisten dazu führen können, dass sich die Zahl der Laichknoten und die Größe des dorsalen Nackenaufwuchses bei adulten Männchen verringern (25)(26). ³⁵⁹³Diese wesentlichen morphologischen Beobachtungen können auch eine qualitativ und quantitativ wertvolle Informationsgrundlage für potenzielle künftige Fischtests liefern. ³⁵⁹⁴Anzahl und Größe der Laichknoten bei Dickkopfelritzen und Papillenprozesse bei Japanischen Reiskärpflingen können entweder direkt oder — bequemer — an konservierten Exemplaren gezählt werden. ³⁵⁹⁵Die Anlagen 5A und 5B enthalten Empfehlungen für Verfahren zur Beurteilung sekundärer Geschlechtsmerkmale bei Dickkopfelritzen bzw. Japanischen Reiskärpflingen. |
Vitellogenin (VTG) | 41. | ³⁵⁹⁶Das für die VTG-Bestimmung erforderliche Blut wird mit einem heparinisierten Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen aus der Schwanzarterie/-vene oder alternativ durch Herzpunktion mit einer Spritze entnommen. ³⁵⁹⁷Je nach Größe der Fische werden bei Dickkopfelritzeen 5-60 μl und bei Zebrabärblingen 5-15 μl Blut (jeweils pro Fisch) benötigt. ³⁵⁹⁸Das Plasma wird durch Zentrifugieren vom Blut getrennt und mit Proteasehemmern bis zur Vitellogenin-Analyse bei – 80 °C aufbewahrt. ³⁵⁹⁹Alternativ kann bei Zebrabärblingen die Leber verwendet werden; bei Zebrabärblingen kommen Kopf-/Schwanz-Homogenate als Gewebematerial für die Vitellogenin-Analyse in Betracht (Anlage 6). ³⁶⁰⁰Die VTG-Messung sollte nach einer validierten homologen ELISA-Methode mit homologem VTG-Standard und homologen Antikörpern erfolgen. ³⁶⁰¹Empfohlen werden Methoden, mit denen kleinste VTG-Gehalte (wenige ng/ml Plasma oder ng/mg Gewebe, die der Hintergrundkonzentration bei nicht exponierten männlichen Fischen entsprechen) ermittelt werden können. |
| 42. | ³⁶⁰²Die Qualitätskontrolle der Vitellogenin-Analyse erfolgt anhand von Standards, Blindproben und zumindest Doppelanalysen. ³⁶⁰³Für jede ELISA-Methode ist ein Test auf Matrixeffekte (Effekte der Probenverdünnung) vorzunehmen, um den Mindestverdünnungsfaktor zu ermitteln. ³⁶⁰⁴Alle für VTG-Analysen verwendeten ELISA-Platten müssen zumindest auch folgende Proben für die Qualitätskontrolle enthalten: 6 Kalibrierstandards für den gesamten Bereich der erwarteten Vitellogenin-Konzentrationen und eine nicht spezifische Binding-Assay-Blindprobe (doppelt zu analysieren). ³⁶⁰⁵Die Absorption dieser Blindproben sollte weniger als 5 % der maximalen Adsorption des Kalibrierstandards betragen. ³⁶⁰⁶Von jeder Verdünnung sind mindestens zwei Aliquoten (Muldenduplikate) zu analysieren. ³⁶⁰⁷Duplikatmulden mit über 20 % Differenz sollten ein zweites Mal analysiert werden. |
| 43. | ³⁶⁰⁸Der Korrelationskoeffizient (R2) für Kalibrierkurven sollte größer als 0,99 sein. ³⁶⁰⁹Eine hohe Korrelation reicht jedoch nicht aus, um in allen Bereichen Konzentrationen adäquat vorabzuschätzen. ³⁶¹⁰Neben der Notwendigkeit einer hinreichend hohen Korrelation für die Kalibrierkurve sollte alle aus der Kalibrierkurve errechneten Konzentrationen der einzelnen Standards im Bereich von 70-120 % der jeweiligen nominellen Konzentration liegen. ³⁶¹¹Wenn die nominellen Konzentrationen tendenziell von der Regressionsgeraden abweichen (beispielsweise bei niedrigeren Konzentrationen), muss die Kalibrierkurve möglicherweise in niedrige und hohe Bereiche aufgeteilt oder ein nicht lineares Modell für die Adsorptionsdaten verwendet werden. Bei geteilten Kurven muss der Korrelationskoeffizient R2 bei beiden Segmenten > 0,99 sein. |
| 44. | Als Nachweisgrenze wird die Konzentration des niedrigsten Analysestandards bezeichnet; die Quantifizierungsgrenze ist die Konzentration des niedrigsten Analysestandards multipliziert mit dem niedrigsten Verdünnungsfaktor. |
| 45. | ³⁶¹³An den Tagen, an denen Vitellogenin-Analysen stattfinden, ist eine mit einem Inter-Assay-Referenzstandard hergestellte Anreicherungsprobe zu analysieren (Anlage 7). ³⁶¹⁴Das Verhältnis der erwarteten zur gemessenen Konzentration ist zusammen mit den Ergebnissen der am diesem Tag durchgeführten Testreihen aufzuzeichnen. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung von Biomarkerreaktionen durch Varianzanalyse (ANOVA)
| 46. | ³⁶¹⁵Um die potenziell endokrine Aktivität einer Chemikalie zu ermitteln, werden die Wirkungen in den Prüf- und in den Kontrollgefäßen mittels Varianzanalyse (ANOVA) verglichen. ³⁶¹⁶Wird eine Lösungsmittelkontrolle verwendet, sollten Verdünnungswasser und Lösungsmittelkontrollen zur Bestimmung des jeweiligen Endpunkts nach geeigneten Methoden statistisch analysiert werden. ³⁶¹⁷Für Leitlinien zur Verwendung der Daten über Verdünnungswasser und Lösungsmittelkontrollen für die anschließende statistische Analyse siehe OECD 2006c (27). ³⁶¹⁸Alle Daten zu biologischen Reaktionen sind nach Geschlechtern zu analysieren und aufzuzeichnen. ³⁶¹⁹Sind die Voraussetzungen für parametrische Methoden nicht erfüllt, d. h. keine Normalverteilung (z. B. Shapiro-Wilk-Test) oder heterogene Varianz (Bartlett-Test oder Levene-Test), sollte vor der ANOVA eine Datentransformation zur Varianzhomogenisierung in Betracht gezogen oder eine gewichtete ANOVA durchgeführt werden. ³⁶²⁰Bei nicht monotonen Dosis-Wirkungs-Beziehungen kann der (parametrische) Dunnett-Test (Paarvergleiche) oder ein (nicht parametrischer) Mann-Whitney-Test mit Anpassung nach Bonferroni durchgeführt werden. ³⁶²¹Andere statistische Tests kommen ebenfalls in Betracht (z. B. ein Jonckheere-Terpstra- oder ein Williams-Test), wenn die Dosis-Wirkungs-Beziehung annähernd monoton ist. ³⁶²²Das statistische Flussdiagramm in Anlage 8 soll die Auswahl des jeweils am besten geeigneten statistischen Tests erleichtern. Für weitere Informationen siehe OECD-Dokument ‚Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data‘ (27). |
Testergebnisse | 47. | Die Versuchsdaten sollten Folgendes umfassen: | Prüfinstitut:- —
- Verantwortliche Mitarbeiter und ihre jeweiligen Zuständigkeiten im Rahmen des Assay
- —
- Jedes Labor muss seine Eignung anhand repräsentativer Chemikalien nachweisen.
|
| Prüfchemikalie:- —
- Charakterisierung der Prüfchemikalie;
- —
- physikalischer Zustand und physikalisch-chemische Eigenschaften;
- —
- Methode und Häufigkeit der Herstellung von Prüfkonzentrationen;
- —
- Angaben zur Stabilität und zur biologischen Abbaubarkeit.
|
| Lösungsmittel:- —
- Charakterisierung des Lösungsmittels (Beschaffenheit und verwendete Konzentration);
- —
- Gründe für die Wahl des jeweiligen Lösungsmittels (wenn nicht nur Wasser als Lösungsmittel verwendet wird).
|
| Zu testende Tiere:- —
- Art und Stamm;
- —
- Bezugsquelle und Angaben zur jeweiligen Bezugsanlage;
- —
- Alter der Fische zu Beginn des Tests und Reproduktions- /Laichstatus;
- —
- Angaben zur Akklimatisierungsverfahren;
- —
- Körpergewicht der Fische zu Beginn der Exposition (aus einer Teilprobe des Fischbestands).
|
| Prüfbedingungen:- —
- angewandte Prüfmethode (Testtyp, Besatz(verhältnis), Besatzdichte usw.);
- —
- Methode für die Herstellung der Stammlösungen und Durchflussrate;
- —
- nominelle Testkonzentrationen, wöchentlich gemessene Konzentrationen der Testlösungen und angewandte Analysemethode, mittlere Messwerte und Standardabweichungen in den Prüfgefäßen sowie Nachweis, dass sich die Messungen auf die Konzentrationen der Prüfchemikalie in der tatsächlichen Lösung beziehen;
- —
- Merkmale des Verdünnungswassers (pH-Wert, Härte, Alkalität, Temperatur, Konzentration an gelöstem Sauerstoff, Restchlorgehalt, Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff, suspendierte Feststoffen und andere ermittelte Messwerte);
- —
- Wasserqualität in den Prüfgefäßen; pH-Wert, Härte, Temperatur und Konzentration an gelöstem Sauerstoff;
- —
- detaillierte Angaben zur Fütterung (Art des Futters, Bezugsquelle/Herkunft, verfütterte Menge und Häufigkeit der Fütterung sowie, soweit vorhanden, Analysen zur Feststellung etwaiger Schadstoffe (z. B. PCB, PAH und chlororganische Pestizide).
|
| Ergebnisse- —
- Nachweis, dass die Kontrollen die Validitätskriterien des Tests erfüllen;
- —
- Daten zu Mortalitäten für Testkonzentrationen und Kontrolle;
- —
- angewandte statistische Analysemethoden, Datenauswertung und Gründe für die Wahl der angewandten Methoden;
- —
- Daten zu biologischen Beobachtungen (deutliche morphologische Änderungen u. a. der sekundären Geschlechtsmerkmale und Vitellogenin-Konzentration);
- —
- Ergebnisse der Datenanalysen, vorzugsweise in tabellarischer und in grafischer Form;
- —
- ungewöhnliche Reaktionen der Fische sowie jegliche sichtbare Wirkungen der Prüfchemikalie.
|
|
LEITLINIEN FÜR DIE AUSWERTUNG UND VALIDITÄT DER TESTERGEBNISSE | 48. | ³⁶²⁹Dieser Abschnitt enthält Empfehlungen für die Auswertung der Testergebnisse für die gemessenen Endpunkte. ³⁶³⁰Die Ergebnisse sind mit Vorsicht zu interpretieren, wenn die Prüfchemikalie eindeutig toxisch wirkt oder den Allgemeinzustand der Testtiere verschlechtert. |
| 49. | ³⁶³¹Bei der Festlegung der Bandbreite der Prüfchemikalienkonzentrationen ist darauf zu achten, dass die für eine aussagekräftige Datenauswertung höchste noch verträgliche Konzentration nicht überschritten wird. ³⁶³²Wichtig ist dabei, dass bei mindestens einer Konzentration keine Anzeichen einer toxischen Wirkung festgestellt werden. ³⁶³³Krankheitssymptome und Anzeichen toxischer Wirkungen sind gründlich zu untersuchen und aufzuzeichnen. ³⁶³⁴Beispielsweise kann die VTG-Produktion bei weiblichen Tieren auch durch allgemeine Toxizität und nichtendokrine toxische Wirkungsweisen (z. B. durch Hepatotoxizität) beeinträchtigt werden. ³⁶³⁵Die Wirkungsauswertung lässt sich jedoch durch andere Konzentrationen untermauern, die nicht durch systemische Toxizität beeinträchtigt werden. |
| 50. | ³⁶³⁶Um Testergebnisse als gültig anerkennen zu können, müssen bestimmte Aspekte berücksichtigt werden. ³⁶³⁷Als Faustregel gilt, dass sich die VTG-Konzentrationen in Kontrollgruppen männlicher und weiblicher Fische bei Dickkopfelritzen und bei Zebrabärblingen in etwa um mindestens drei Größenordnungen und bei Japanischen Reiskärpflingen in etwa um mindestens eine Größenordnung unterscheiden müssen. ³⁶³⁸Für Beispiele für den Konzentrationsbereich bei Kontroll- und Behandlungsgruppen siehe Validierungsberichte (1)(2)(3)(4). ³⁶³⁹Hohe VTG-Konzentrationen bei männlichen Kontrollfischen könnten die Aussagekraft des Assay und dessen Fähigkeit zum Nachweis schwacher Östrogen-Agonisten beeinträchtigen. ³⁶⁴⁰Und niedrige VTG-Konzentrationen bei weiblichen Kontrollfischen könnten die Aussagekraft des Assays und dessen Fähigkeit zum Nachweis von Aromatasehemmern und Östrogen-Antagonisten beeinträchtigen. ³⁶⁴¹Diese Leitlinien beruht auf diesen Validierungsstudien. |
| 51. | ³⁶⁴²Führt ein Labor den Assay zum ersten Mal durch oder wurden wesentliche Änderungen vorgenommen (beispielsweise Änderungen des Fischstammes oder der Bezugsquelle), sollte eine technische Eignungsprüfung durchgeführt werden. ³⁶⁴³Nach Möglichkeit sollten Chemikalien verwendet werden, die ein breites Spektrum an Wirkungsweisen oder Wirkungen auf mehrere Test-Endpunkte abdecken. ³⁶⁴⁴Die Labors werden aufgefordert, für männliche und weibliche Tiere eigene historische Kontrolldaten zu sammeln und eine positive Kontrollchemikalie (z. B. 17β-Öestradiol in einer Konzentration von 100 ng/l oder einen bekannten schwachen Agonisten) auf östrogene Wirkung mit erhöhter VTG-Konzentration in männlichen Fischen, eine positive Kontrollchemikalie (z. B. Fadrozol oder Prochloraz in einer Konzentration von 300 μg/l) auf Aromatosehemmung mit reduzierter VTG-Konzentration in weiblichen Fischen und eine positive Kontrollchemikalie (z. B. 17β-Trenbolon in einer Konzentration von 5 μg/l) auf androgene Wirkung und resultierender Induktion sekundärer Geschlechtsmerkmale bei weiblichen Dickkopfelritzen und weiblichen Japanischen Reiskärpflingen zu prüfen. ³⁶⁴⁵Diese Daten können insgesamt mit verfügbaren Daten aus den Validierungsstudien (1)(2)(3) verglichen werden, um die Eignung des jeweiligen Labors sicherzustellen. |
| 52. | ³⁶⁴⁶Grundsätzlich gelten Vitellogenin-Messungen als positiv, wenn eine statistisch signifikante (p < 0,05) Erhöhung der VTG-Konzentration in männlichen Fischen oder eine statistisch signifikante (p < 0,05) Reduzierung bei weiblichen Fischen zumindest bei der höchsten geprüften Dosis im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt wird und keine Anzeichen einer allgemeinen Toxizität vorliegen. ³⁶⁴⁷Ein positives Ergebnis wird auch durch Nachweis einer biologisch plausiblen Beziehung zwischen der Dosis- und der Wirkungskurve bestätigt. ³⁶⁴⁸Wie bereits erläutert, muss eine Reduzierung der VTG-Konzentration nicht unbedingt endokrinen Ursprungs sein. Ein positives Ergebnis sollte jedoch grundsätzlich als In-vivo-Nachweis einer endokrinen Wirkung ausgelegt werden und zur Klärung weitere Untersuchungen nach sich ziehen. |
LITERATUR | (1) | OECD (2006a). ³⁶⁵⁰Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). ³⁶⁵¹OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, ENV/JM/MONO(2006)27. |
| (2) | OECD (2006b). ³⁶⁵³Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). ³⁶⁵⁴OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, ENV/JM/MONO(2006)29. |
| (3) | OECD (2007). ³⁶⁵⁶Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. ³⁶⁵⁷Phase 2: Testing Negative Substances. ³⁶⁵⁸OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, ENV/JM/MONO(2007)25. |
| (4) | Owens JW (2007). ³⁶⁶⁰Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. ³⁶⁶¹CEFIC LRI Project, Endocrine. ³⁶⁶²http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (accessed 18/09/08). |
| (5) | US EPA 2007. ³⁶⁶⁴Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. ³⁶⁶⁵Nicht veröffentlichter Bericht vom 15. Dezember 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 S. |
| (6) | OECD, 2008. ³⁶⁶⁶Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. ³⁶⁶⁷OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, ENV/JM/MONO(2008)21. |
| (7) | Sumpter und Jobling (1995). ³⁶⁶⁹Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. ³⁶⁷⁰Environmental Health Perspectives;103 Suppl 7:173-8 Review. |
| (8) | Pawlowski, S, Sauer, A., Shears, J.A., Tyler, C.R., Braunbeck, T (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3):277-91. |
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| (10) | Ankley, G.T., Kahl, M.D., Jensen, K.M., Hornung, M.W., Korte, J.J., Makynen, E.A., Leino, R.L (2002). ³⁶⁷⁷Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). ³⁶⁷⁸Toxicological Sciences;67(1):121-30. |
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| (12) | Parks, L.G., Cheek, A.O., Denslow, N.D., Heppell, S.A., McLachlan, J.A., LeBlanc, G.A., Sullivan, C.V. (1999). ³⁶⁸³Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. ³⁶⁸⁴Comparative Biochemistry and Physiology. ³⁶⁸⁵Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25. |
| (13) | Panter, G.H., Tyler, C.R., Maddix, S., Campbell, P.M., Hutchinson, T.H., Länge, R., Lye, C., Sumpter, J.P., 1999. ³⁶⁸⁷Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. ³⁶⁸⁸CEFIC-EMSG-Forschungsbericht AQ001. ³⁶⁸⁹CEFIC, Brüssel, Belgien. |
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| (16) | Rose, J., Holbech, H., Lindholst, C., Noerum, U., Povlsen, A., Korsgaard, B., Bjerregaard, P. 2002. ³⁶⁹⁶Vitellogenin induction by 17ß-estradiol and 17ß-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. ³⁶⁹⁷Physiol. C. 131: 531-539. |
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| (19) | Tatarazako, N., Koshio, M., Hori, H., Morita, M., und Iguchi, T., 2004. ³⁷⁰⁴Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. ³⁷⁰⁵Journal of Health Science 50:301-308. |
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| (24) | Hutchinson, T.H., Ankley, G.T., Segner, H, Tyler, C.R., 2006b. ³⁷¹⁸Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as ‚signposts,‘ not ‚traffic lights,‘ in risk assessment. ³⁷¹⁹Environmental Health Perspectives;114 Suppl 1:106-14. |
| (25) | Miles-Richardson, S.R., Kramer, V.J., Fitzgerald, S.D., Render, J.A., Yamini, B., Barbee, S.J., Giesy, J.P. 1999. ³⁷²¹Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. ³⁷²²47, 129-145. |
| (26) | Martinovic, D., L.S. Blake, E.J. Durhan, K.J. Greene, M.D. Kahl, K.M., Jensen, E.A. Makynen, D.L. Villeneuve und G.T. Ankley. 2008. ³⁷²⁴Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. ³⁷²⁵27, 478-488. |
| (27) | OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD-Veröffentlichungen zu Gesundheit und Arbeitsschutz, Reihe ‚Testing and Assessment‘, Nr. 54, ENV/JM/MONO(2006)18 |
| (28) | OECD (2012) OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters (geänd.). ³⁷²⁸Annex I to Draft Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. ³⁷²⁹Series on Testing and Assessment No 150. ENV/JM/MONO(2012)22 |
Anlage 1Abkürzungen und Begriffsbestimmungen
Chemikalie: Stoff oder Gemisch.
VK: Variationskoeffizient.
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.
Besatz: Verhältnis des Nassgewichts der Fische zum Wasservolumen.
Besatzdichte: Anzahl Fische je Wasservolumen.
VTG (Vitellogenin): Phospholipoglycoprotein-Vorläufer für Eidotterprotein, das in der Regel bei geschlechtlich aktiven weiblichen Tieren aller eierlegenden Arten vorkommt.
HPG-Achse: Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse.
MTC: höchste noch verträgliche Konzentration, etwa 10 % des LC50-Werts.
Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der bzw. das nach dieser Prüfmethode getestet wird.
Anlage 2
Versuchsbedingungen für den Fisch-Screening-Test zur Bestimmung endokriner Wirkungen
| Dickkopfelritze(Pimephales promelas)
| Japanischer Reiskärpfling(Oryzias latipes)
| Zebrabärbling(Danio rerio)
| | Durchflusssystem | Durchflusssystem | Durchflusssystem | | 25 ± 2 °C | 25 ± 2 °C | 26 ± 2 °C | | Leuchtstofflampen (breites Spektrum) | Leuchtstofflampen (breites Spektrum) | Leuchtstofflampen (breites Spektrum) | | 10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lx, oder 50-100 ft-c (Laborqualität) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lx, oder 50-100 ft-c (Laborqualität) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 000 lx, oder 50-100 ft-c (Laborqualität) | | 6. | Photoperiode (Morgen-/Abenddämmerungsphasen optional; nicht unbedingt erforderlich) |
| 16 Std. Licht, 8 Std. Dunkelheit | 12-16 Std. Licht, 12-8 Std. Dunkelheit | 12-16 Std. Licht, 12-8 Std. Dunkelheit | | < 5 g/l | < 5 g/l | < 5 g/l | | 10 l (mind.) | 2 l (mind.) | 5 l (mind.) | | 8 l (mind.) | 1,5 l (mind.) | 4 l (mind.) | | 10. | Erneuerung der Testlösungen |
| Mindestens 6-mal täglich | Mindestens 5-mal täglich | Mindestens 5-mal täglich | | 11. | Alter der Testorganismen |
| Siehe Nummer 20 | Siehe Nummer 20 | Siehe Nummer 20 | | 12. | Ungefähres Nassgewicht der adulten Fische (g) |
| Weibchen: 1,5 ± 20 %Männchen: 2,5 ± 20 %
| Weibchen: 0,35 ± 20 %Männchen: 0,35 ± 20 %
| Weibchen: 0,65 ± 20 %Männchen: 0,4 ± 20 %
| | 13. | Anzahl Fische pro Prüfgefäß |
| 6 (2 Männchen, 4 Weibchen) | 10 (5 Männchen, 5 Weibchen) | 10 (5 Männchen, 5 Weibchen) | | 14. | Anzahl der Behandlungen |
| = 3 (sowie entsprechende Kontrollen) | = 3 (sowie entsprechende Kontrollen) | = 3 (sowie entsprechende Kontrollen) | | 15. | Anzahl Gefäße je Behandlung |
| Mindestens 4 | Mindestens 2 | Mindestens 2 | | 16. | Anzahl der Fische je Testkonzentration |
| 16 adulte Weibchen und 8 Männchen (4 Weibchen und 2 Männchen pro Replikatgefäß) | 10 adulte Weibchen und 10 Männchen (5 Weibchen und 5 Männchen pro Replikatgefäß) | 10 adulte Weibchen und 10 Männchen (5 Weibchen und 5 Männchen pro Replikatgefäß) | | Lebende oder tiefgefrorene adulte Salinenkrebse oder Salinenkrebs-Nauplien zwei- bis dreimal täglich (ad libitum), handelsübliches Futter oder beides in Kombination | Salinenkrebs-Nauplien zwei- bis dreimal täglich (ad libitum), handelsübliches Futter oder beides in Kombination | Salinenkrebs-Nauplien zwei- bis dreimal täglich (ad libitum), handelsübliches Futter oder beides in Kombination | | Keine, es sei denn, der Gehalt an gelöstem Sauerstoff fällt unter eine Luftsättigung von 60 % | Keine, es sei denn, der Gehalt an gelöstem Sauerstoff fällt unter eine Luftsättigung von 60 % | Keine, es sei denn, der Gehalt an gelöstem Sauerstoff fällt unter eine Luftsättigung von 60 % | | Sauberes Oberflächen- oder Brunnenwasser oder rekonstituiertes Wasser oder entchlortes Leitungswasser | Sauberes Oberflächen- oder Brunnenwasser oder rekonstituiertes Wasser oder entchlortes Leitungswasser | Sauberes Oberflächen- oder Brunnenwasser oder rekonstituiertes Wasser oder entchlortes Leitungswasser | | 20. | Dauer der Präexposition |
| möglichst 7 Tage | möglichst 7 Tage | möglichst 7 Tage | | 21 Tage (d) | 21 Tage (d) | 21 Tage (d) | | ÜberlebenVerhalten
Sekundäre Geschlechtsmerkmale
VTG
| ÜberlebenVerhalten
Sekundäre Geschlechtsmerkmale
VTG
| ÜberlebenVerhalten
VTG
| | Gelöster Sauerstoff > 60 % Sättigung; mittlere Temperatur 25 ± 2 °C; 90 %ige Überlebensrate der Fische in den Kontrollen; gemessene Testkonzentrationen innerhalb von 20 % der mittleren Messwerte je Behandlungsstufe. | Gelöster Sauerstoff > 60 % Sättigung; mittlere Temperatur 24 ± 2 °C; 90 %ige Überlebensrate der Fische in den Kontrollen; gemessene Testkonzentrationen innerhalb von 20 % der mittleren Messwerte je Behandlungsstufe. | Gelöster Sauerstoff > 60 % Sättigung; mittlere Temperatur 26 ± 2 °C; 90 %ige Überlebensrate der Fische in den Kontrollen; gemessene Testkonzentrationen innerhalb von 20 % der mittleren Messwerte je Behandlungsstufe. |
Anlage 3Chemische Merkmale eines geeigneten Verdünnungswassers
| Bestandteil | Konzentrationen | | Partikel | < 20 mg/l | | Gesamtgehalt an organischen Kohlenstoffen | < 2 mg/l | | Nichtionisiertes Ammonium | < 1 μg/l | | Restchlor | < 10 μg/l | | Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden plus polychlorierten Biphenylen | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an organischem Chlor | < 25 ng/l |
Anlage 4ALaichsubstrat für Zebrabärblinge
Laichschale: beliebige Instrumentenschale aus Glas, beispielsweise 22 × 15 × 5,5 cm (L × B × T), abgedeckt mit abnehmbarem Maschendrahtgitter aus Edelstahl (Maschenweite 2 mm); das Gitter sollte die Schale unterhalb des Randes komplett abdecken.
 ³⁷⁴⁴Auf dem Gitter das Laichsubstrat fixieren. ³⁷⁴⁵Dabei eine Struktur gewährleisten, in die sich die Fische zurückziehen können. ³⁷⁴⁶Geeignet sind beispielsweise Aquarienpflanzen aus grünem Kunststoff. ³⁷⁴⁷(Hinweis: eine mögliche Adsorption der Prüfchemikalie an das Kunststoffmaterial muss in diesem Fall berücksichtigt werden.) Das Kunststoffmaterial in einer ausreichenden Menge warmen Wassers waschen, um sicherzustellen, dass etwa vorhandene Chemikalien ausgetrieben werden und nicht in das Testwasser gelangen. ³⁷⁴⁸Bei Verwendung von Materialien aus Glas ist sicherzustellen, dass die Fische weder verletzt noch bei heftigen Schwimmbewegungen eingeengt werden.³⁷⁴⁹Der Abstand zwischen der Schale und den Glasscheiben muss mindestens 3 cm betragen, damit die Laichablage nicht außerhalb der Schale erfolgt. ³⁷⁵⁰Die in die Schale abgelegten Eier fallen durch das Gitter und können 45-60 Minuten nach Einschalten der Beleuchtung entnommen werden. ³⁷⁵¹Die transparenten Eier haften nicht aneinander an und können bei transversaler Beleuchtung leicht gezählt werden. ³⁷⁵²Bei fünf Weibchen pro Gefäß gelten bis zu 20 Eier/Tag als wenig, bis zu 100 Eier/Tag als mittel und über 100 Eier/Tag als viel. ³⁷⁵³Die Laichschale herausnehmen, die Eier einsammeln und die Laichschale wieder in das Prüfgefäß stellen — entweder so spät wie möglich am Abend oder sehr früh am Morgen. ³⁷⁵⁴Bis zum erneuten Einstellen darf höchstens eine Stunde vergehen, da der vom Laichsubstrat ausgehende Reiz dazu führen kann, dass es zu ungewöhnlichen Zeitpunkten zu Paarung und Laichablage kommt. ³⁷⁵⁵Wird die Laichschale dennoch später in die das Prüfbecken gestellt, so sollte dies frühestens 9 Stunden nach dem Einschalten der Beleuchtung geschehen. ³⁷⁵⁶Zu diesem späten Tageszeitpunkt erfolgt keine Laichablage mehr.
Anlage 4B
Laichsubstrat für Dickkopfelritzen
Zwei oder drei kombinierte Platten und Schalen aus Kunststoff/Keramik/Glas oder Edelstahl als Laichunterlage in die Prüfkammern (z. B. 80 mm lange graue halbrunde Rinnen, aufgesetzte auf eine gebördelte, 130 mm lange Schale) stellen (siehe Abbildung). Gut akklimatisierte PVC- oder Keramikkacheln haben sich als Laichunterlage bewährt (Thorpe et al, 2007).
³⁷⁵⁸Die Platten anrauhen, um die Haftung zu verbessern. ³⁷⁵⁹Wenn nicht erwiesen ist, dass die Eier zuverlässig an der Laichunterlage haften, die Schalen außerdem mit einem Gitter abdecken, damit die Fische nicht an herabgefallene Eier gelangen.
 ³⁷⁶⁰Die Unterlage soll alle Eier aufnehmen können, die nicht an der Plattenoberfläche haften bleiben und folglich auf den Boden des Beckens fallen (sowie alle Eier, die direkt auf der flache Kunststoffunterlage abgelegt werden). ³⁷⁶¹Alle Laichunterlagen sind vor Gebrauch mindestens 12 Stunden mit Verdünnungswasser zu spülen, um etwa vorhandene Schadstoffe auszutreiben.LITERATUR
Thorpe, K.L., Benstead, R., Hutchinson, T.H., Tyler, C.R., 2007. ³⁷⁶³An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. ³⁷⁶⁴Aquatic Toxicology, 81, 90–98.
Anlage 5A
Bewertung der sekundären Geschlechtsmerkmale bei Dickkopfelritzen zum Nachweis bestimmter Chemikalien mit endokriner Wirkung
Übersicht
Für Tests zum Nachweis endokriner Disruptoren potenziell wichtige äußere Merkmale bei adulten Dickkopfelritzen sind die Körperfarbe (hell/dunkel), die Farbmusterung (Vorhandensein oder Nichtvorhandensein senkrechter Streifen), die Körperform (Kopf- und Rumpfform, abdominale Distension) sowie spezifische sekundäre Geschlechtsmerkmale (Zahl und Größe der Laichknoten (Nuptialtuberkel), Größe des dorsalen Nackenaufwuchses und des Ovipositors).
³⁷⁶⁶Laichausschlag (Nuptialtuberkel) tritt am Kopf (dorsaler Aufwuchs) paarungsbereiter männlicher Dickkopfelritzen auf, gewöhnlich beidseitig symmetrisch (Jensen et al. 2001). ³⁷⁶⁷Bei weiblichen Kontrollfischen sowie juvenilen männlichen und weiblichen Fischen zeigen sich keine Tuberkel (Jensen et al. 2001). ³⁷⁶⁸Um die Augen und zwischen den Nasenöffnungen männlicher Tiere können sich bis zu acht Tuberkel bilden. ³⁷⁶⁹Die meisten und größten Tuberkel finden sich in zwei parallelen Reihen unmittelbar unter den Nasenöffnungen und über dem Maul. ³⁷⁷⁰Bei vielen Fischen befinden sich Tuberkelgruppierungen auch unterhalb des Unterkiefers; die in unmittelbarer Nähe des Mauls befindlichen Tuberkel treten gewöhnlich als einzelnes Paar auf; ventral können sich Gruppen von bis zu vier Tuberkel entwickeln. ³⁷⁷¹In der Regel bilden sich selten mehr als 30 Tuberkel (typischerweise 18-28; Jensen et al. 2001). ³⁷⁷²Zumeist entwickeln sich Nuptialtuberkel als einzelne, verhältnismäßig runde Ausstülpungen, deren Höhe in etwa ihrem Radius entspricht. ³⁷⁷³Die meisten paarungsbereiten Männchen weisen zumindest auch einige Tuberkel auf, die derart groß und auffällig sind, dass sie als Einzelstrukturen kaum noch erkennbar sind.
³⁷⁷⁴Einige Arten endokrin wirkender Chemikalien können beim jeweils anderen Geschlecht zu anomalen sekundären Geschlechtsmerkmalen führen. So können Androgenrezeptor-Agonisten wie 17β-Methyltestosteron oder 17β-Trenbolon bewirken, dass sich bei weiblichen Dickkopfelritzen Nuptialtuberkel bilden (Smith 1974; Ankley et al.³⁷⁷⁵ 2001; 2003), während Östrogenrezeptor-Agonisten bei männlichen Tieren zu einer Verringerung der Anzahl oder Größe der Tuberkel führen können (Miles-Richardson et al. ³⁷⁷⁶1999; Harries et al. 2000).
³⁷⁷⁷Laichausschlag bei Dickkopfelritzen wird nachstehend nach Verfahren charakterisiert, wie sie im Labor der US-amerikanischen Umweltschutzbehörde (Environmental Protection Agency) in Duluth, MN, üblich sind. ³⁷⁷⁸Spezifische Produkte und/oder Geräte können durch verfügbare vergleichbare Materialien ersetzt werden.
³⁷⁷⁹Eine Sichtprüfung erfolgt am besten unter einem beleuchteten Vergrößerungsglas oder einem beleuchteten Stereomikroskop mit Dreifach-Vergrößerung. ³⁷⁸⁰Die Fische dorsal mit der vorderen Körperhälfte nach vorne zeigend (d. h. Kopf zum Betrachter hin) untersuchen.
- a)
- ³⁷⁸¹Fisch mit vorderen Körperhälfte nach vorne zeigend und in Bauchlage in eine kleine Petrischale (z. B. 100 mm Durchmesser) legen. ³⁷⁸²Sucher scharf einstellen, damit die Tuberkel erkennbar werden. ³⁷⁸³Fisch vorsichtig und langsam von einer Seite auf die andere drehen, um die Areale mit Tuberkeln zu bestimmen. ³⁷⁸⁴Tuberkel zählen und einstufen.
- b)
- Untersuchung an der ventralen Kopfseite wiederholen; dazu den Fisch mit der dorsalen vorderen Körperhälfte nach vorne zeigend in die Petrischale legen.
- c)
- Die Untersuchung sollte pro Fisch nicht länger als 2 Minuten dauern.
Zählen und Einstufen der Laichknoten (Nuptialtuberkel)Zur Bewertung der Ausprägung des Laichausschlags bei adulten Dickkopfelritzen wurden sechs Areale identifiziert. ³⁷⁸⁸Zur Darstellung der Region und der Zahl vorhandener Tuberkel wurde eine Vorlage (Formular) entwickelt (siehe Ende dieses Anhangs). ³⁷⁸⁹Die Zahl der Tuberkel aufzeichnen, und die Tuberkel der Größe nach wie folgt einstufen: 0 — keine Tuberkel, 1 — präsent, 2 — vergrößert und 3 — ausgeprägt (Abb. 1).
³⁷⁹⁰Bewertung 0 bedeutet, dass keine Tuberkel vorhanden sind. ³⁷⁹¹Bewertung 1 — Tuberkel präsent — betrifft jeden Knoten, bei dem eine einzelne Ausstülpung in etwa dem Radius des Knotens (Halbmesser) entspricht. ³⁷⁹²Bewertung 2 — vergrößerter Tuberkel — betrifft Knoten mit sternförmig ausgebildetem Gewebe, das sich in der Regel durch eine große Grundfläche mit von der Mitte ausgehenden Rillen oder Furchen auszeichnet. ³⁷⁹³Nach oben sind die Tuberkel häufig stärker gezackt, können aber auch abgerundet sein. ³⁷⁹⁴Bewertung 3 — ausgeprägter Laichausschlag — bedeutet in der Regel, dass das Areal verhältnismäßig groß und abgerundet und weniger strukturiert ist. ³⁷⁹⁵Manchmal verschmelzen diese Tuberkel entlang einer oder mehrerer Regionen (B, C und D; s. u.). ³⁷⁹⁶Farbe und Form sind ähnlich wie bei Bewertung 2, was manchmal die Unterscheidung erschwert. ³⁷⁹⁷Eine Einstufung nach diesem System ergibt bei normalen männlichen Kontrollexemplaren mit 18-20 Tuberkeln einen Gesamtwert von < 50 Tuberkeln (Jensen et al. 2001).
Abbildung 1
 Die tatsächliche Anzahl Tuberkel kann bei bestimmten Fischen größer sein als das Formularfeld (Anlage A) für das einzustufende Ausschlagareal zulässt. ³⁷⁹⁹In diesem Fall können rechts oder links neben dem betreffenden Feld zusätzliche Einstufungen angegeben werden. ³⁸⁰⁰Die Vorlage muss daher nicht unbedingt Symmetrie aufzeigen. ³⁸⁰¹Eine weitere Methode zur Veranschaulichung paarweise auftretender oder vertikal auf der horizontalen Ebene des Mauls verbundener Tuberkel besteht in der doppelten Markierung zweier Einstufungen innerhalb eines einzigen Feldes.Darzustellende Tuberkelregionen:
A— Augenregion: Dorsal bis ventral um den vorderen Augenrand; in der Regel viele Tuberkel bei geschlechtsreifen männlichen Kontrollexemplaren; bei weiblichen Kontrollexemplaren nicht präsent; in der Regel paarweises Auftreten (jeweils ein Tuberkel in der Nähe des Auges) bzw. Einzelvorkommen bei androgen-exponierten weiblichen Tieren.
B— Nasenregion zwischen Nasengruben (Sensorkanalporen): bei männlichen Kontrollexemplaren in der Regel paarweises Auftreten in stärkerer Ausprägung (2 — vergrößert — oder 3 — stark ausgeprägt); bei weiblichen Kontrollexemplaren nicht präsent, jedoch vereinzeltes Vorkommen bei androgen-exponierten weiblichen Tieren.
C— Nasenregion unmittelbar vor den Nasengruben, parallel zum Maul: In der Regel vergrößert oder stark ausgeprägt bei männlichen Kontrollexemplaren; bei weniger entwickelten männlichen Tieren oder androgen-exponierten weiblichen Tieren präsent oder vergrößert.
D— Maulregion (entlang der Maullinie): Bei männlichen Kontrollexemplaren in der Regel ausgeprägt; bei weiblichen Kontrollexemplaren nicht präsent; bei androgen-exponierten weiblichen Tieren können jedoch Tuberkel vorkommen.
E— Unterkieferregion (nahe am Maul): gewöhnlich klein und gepaart; bei männlichen Kontroll- oder exponierten Fischen unterschiedlich ausgeprägt.
F— Rumpfregion (ventral zu E): In der Regel klein und gepaart; bei männlichen Kontrollexemplaren und androgen-exponierten weiblichen Tieren präsent.
LITERATUR
| (1) | Ankley, G.T., Jensen, K.M., Kahl, M.D., Korte, J.J., Makynen. M.E.. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290. |
| (2) | Ankley, G.T., Jensen, K.M., Makynen, E.A., Kahl, M.D., Korte, J.J., Hornung, M.W., Henry, T.R., Denny, J.S., Leino, R.L., Wilson, V.S., Cardon, M.C., Hartig, P.C., Gray, E.L. 2003. ³⁸¹⁰Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. ³⁸¹¹Environ Toxicol Chem 22:1350-1360. |
| (3) | Harries, J.E., Runnalls, T., Hill, E., Harris, C.A.,Maddix, S., Sumpter, J.P., Tyler, C.R. 2000. ³⁸¹³Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). ³⁸¹⁴Environ Sci Technol 34:3003-3011. |
| (4) | Jensen, K.M., Korte, J.J., Kahl, M.D., Pasha, M.S., Ankley, G.T.. 2001. ³⁸¹⁶Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). ³⁸¹⁷Comp Biochem Physiol C 128:127-141. |
| (5) | Kahl, M.D., Jensen, K.M., Korte, J.J., Ankley, G.T. 2001. ³⁸¹⁹Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. ³⁸²⁰J Fish Biol 59:515-523. |
| (6) | Miles-Richardson, S.R., Kramer, V.J., Fitzgerald, S.D., Render, J.A., Yamini, B., Barbee, S.J., Giesy, J.P. 1999. ³⁸²²Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). ³⁸²³Aquat Toxicol 47:129-145. |
| (7) | Smith, R.J.F. 1974. ³⁸²⁵Effects of 17-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). ³⁸²⁶Can J Zool 52:1031-1038. |
| Vorlage — Einstufung des Laichausschlags (Nuptialtuberkel) | Einstufung | | ID | 1 — präsent | | Datum | 2 — vergrößert | | Gesamtbewertung | 3 — ausgeprägt |
| C | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | | D | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 |
Anlage 5BBewertung der sekundären Geschlechtsmerkmale bei Japanischen Reiskärpflingen zum Nachweis bestimmter Chemikalien mit endokriner Wirkung
Im Folgenden wird die Messung von Papillenprozessen als sekundären Geschlechtsmerkmalen Japanischer Reiskärpflinge (Oryzias latipes beschrieben.
| (1) | Nach Ausräumung der Leber (Anlage 6) den Fisch in ein konisches Rohr mit etwa 10 ml 10 %igem neutral gepuffertem Formalin legen (Kopf nach oben, Schwanz nach unten). ³⁸²⁹Wenn die Gonaden in einer anderen Lösung als 10 %igem neutral gepuffertem Formalin fixiert werden, den Körper zwischen dem vorderen Bereich der Afterflosse und dem After mit einer Rasierklinge transversal durchtrennen, ohne die Genitalpapillen und die eigentlichen Gonaden zu beschädigen (Abb. 3). ³⁸³⁰Den Fisch mit der kranialen Seite in die Fixierlösung legen, um die Gonaden zu konservieren; die Schwanzseite in die 10 %ige neutral gepufferte Formalinlösung legen (s. o.). |
| (2) | Nach Einlegen des Fisches in 10 %iges neutral gepuffertes Formalin den vorderen Bereich der Afterflosse mit einer Pinzette fassen und für etwa 30 Sekunden spreizen, um die Afterflosse offen zu halten. Beim Greifen mit einer Pinzette einige Flossenstrahlen im vorderen Bereich vorsichtig mitfassen, um Kratzer auf den Papillen zu vermeiden. |
| (3) | Nach dem Spreizen der Afterflosse für etwa 30 Sekunden den Fisch bis zur Messung der Papillenprozesse in 10 %igem neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur aufbewahren. (Die Messung frühestens nach 24-stündiger Fixierung vornehmen.) |
Messung | (1) | Nach Fixieren des Fischkörpers in 10 %iger neutral gepufferter Formalinlösung für mindestens 24 Stunden die Körper aus dem konischen Rohr nehmen; das Formalin mit Filterpapier (oder Papiertüchern) abtupfen. |
| (2) | Den Fisch mit der Bauchseite nach oben legen. Die Afterflosse mit einer kleinen Sezierschere vorsichtig abtrennen (vorzugsweise mit etwas Pterygiophorgewebe). |
| (3) | Den vorderen Teil der abgetrennten Afterflosse mit einer Pinzette aufnehmen und mit einigen Tropfen Wasser auf einem Glasträger fixieren. ³⁸³⁸Die Afterflosse mit einem Deckglas abdecken. ³⁸³⁹Beim Fassen mit der Pinzette darauf achten, dass die Papillen nicht zerkratzt werden. |
| (4) | Die verbundenen Flossenplatten mit Papillenprozessen mit Hilfe des Zählers unter einem Biomikroskop (aufrechtes oder Inversmikroskop) zählen. ³⁸⁴¹Papillenprozesse liegen vor, wenn am hinteren Rand der verbundenen Platte kleine Papillenbildungen zu erkennen sind. ³⁸⁴²Die Zahl der verbundenen Platten mit Papillenprozessen für jeden einzelnen Flossenstrahl auf dem Arbeitsblatt vermerken (z. B. erster Flossenstrahl: 0, zweiter Flossenstrahl: 10, dritter Flossenstrahl: 12 usw.); die Summe dieser Zahlen, aufgeschlüsselt nach Fischen, in den Excel-Kalkulationsbogen eingetragen. ³⁸⁴³Falls erforderlich, die Afterflosse fotografieren und die Zahl der verbundenen Flossenplatten mit Papillenprozessen auf dem Foto ermitteln. |
| (5) | Nach der Messung die Afterflosse zur Konservierung und Aufbewahrung in das unter Nummer 1 beschriebene konische Rohr legen. |
Abb. 1:Schaubild zur Veranschaulichung der an Form und Größe der Afterflosse erkennbaren Geschlechtsunterschiede; A — männlich; B — weiblich. ³⁸⁴⁶Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. ³⁸⁴⁷Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
 Abb. 2:A — Prozesse auf verbundenen Afterflossenplatten. J.P., verbundene Platte; A.S., axialer Bereich; P., Prozess. ³⁸⁴⁹B — Distales Ende des Flossenstrahls; Actinotrichien (Act.) an der Spitze; Oka, T. B., 1931. ³⁸⁵⁰On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. ³⁸⁵¹Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
 Abb. 3:Foto eines Fischkörpers mit Schnittstelle bei Fixierung der Gonaden in einer anderen Fixierlösung als 10 %iges neutral gepuffertes Formalin; in diesem Fall wird der restliche Körper zwischen der vorderen Region der Afterflosse und dem After mit einer Rasierklinge (rote Linie) abgetrennt; die Kopfseite des Fisches wird in die Fixierlösung für Gonaden, die Schwanzseite in 10 %iges neutral gepuffertes Formalin gelegt.
 Anlage 6Empfohlene Verfahren für die Entnahme von Proben für die Vitellogenin-Analyse
Es ist darauf zu achten, dass es nicht zu Kreuzkontaminationen zwischen den VTG-Proben männlicher und weiblicher Tiere kommt.
Verfahren 1A: Dickkopfelritze, Blutentnahme aus der Schwanzvene/-arterie
Nach der Betäubung den Schwanzansatz mit einem Skalpell teilweise durchtrennen und mit einem heparinisierten Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen aus der Schwanzvene/-arterie Blut entnehmen. ³⁸⁵⁵Nach der Blutentnahme das Plasma schnell durch 3-minütige Zentrifugierung mit 15 000 g (bzw. alternativ 10 min. ³⁸⁵⁶mit 15 000 g bei einer Temperatur von 4 °C) isolieren. ³⁸⁵⁷Soweit erwünscht, kann nach der Zentrifugierung der Hämatokritwert (in %) ermittelt werden. ³⁸⁵⁸Anschließend das Plasma aus dem Mikrohämatokrit-Röhrchen entnehmen und in einem Zentrifugenröhrchen mit 0,13 Einheiten Aprotinin (einem Protease-Inhibitor) bei – 80 °C aufbewahren, bis die VTG-Konzentration bestimmt werden kann. Je nach (geschlechtsabhängiger) Größe der Dickkopfelritze können pro Fisch in der Regel 5-60 μl Plasma entnommen werden (Jensen et al. 2001).
Verfahren 1B: Dickkopfelritze, Blutentnahme aus dem Herzen
Alternativ kann Blut auch durch Herzpunktion mittels heparinisierter Spritze (1 000 Einheiten Heparin pro ml) entnommen werden. ³⁸⁶⁰Das Blut anschließend in Eppendorf-Röhrchen (auf Eis) geben und zentrifugieren (5 min, 7 000 g, Raumtemperatur). ³⁸⁶¹Das Plasma in saubere Eppendorf-Röhrchen füllen (in Aliquoten, wenn das Plasmavolumen dies zulässt), umgehend auf – 80 °C einfrieren und bis zur Analyse aufbewahren (Panter et al., 1998).
Verfahren 2A: Japanische Reiskärpflinge, Exzision der Leber
Entnahme der Prüffische aus dem Prüfbecken
| (1) | Testfische mit dem kleinen Löffelsieb aus dem Prüfbecken nehmen. Dabei darauf achten, dass die Fische nicht in andere Becken fallen. |
| (2) | Die Fische grundsätzlich in nachstehender Reihenfolge entnehmen: Kontrolle, (gegebenenfalls) Lösungsmittelkontrolle, niedrigste Konzentration, mittlere Konzentration, höchste Konzentration. Außerdem aus einem Prüfbecken zunächst alle männlichen Tiere entnehmen, dann die weiblichen. |
| (3) | Anhand der äußerlichen (sekundären) Geschlechtsmerkmale (z. B. Form der Afterflosse) das Geschlecht der Fische bestimmen. |
| (4) | Die Prüffische in ein Transportbehältnis setzen und zur Exzision der Leber an einen Arbeitsplatz bringen. Die Beschriftung des Prüfbeckens und des Transportbehältnisses auf Genauigkeit überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zahl der aus dem Prüfbecken entnommenen Fische mit der Zahl der noch darin verbliebenen Fische übereinstimmt. |
| (5) | Kann das Geschlecht anhand der äußerlichen Merkmale nicht bestimmt werden, alle Fische aus dem Prüfbecken entnehmen. In diesem Fall das Geschlecht durch Sichtprüfung der Gonaden oder der sekundären Geschlechtsmerkmale unter einem Stereomikroskop bestimmen. |
Exzision der Leber | (1) | Die Prüffische aus dem Transportbehältnis nehmen und mit dem kleinen Löffelsieb in die Betäubungslösung setzen. |
| (2) | Nach dem Betäuben den Prüffisch mit einer (handelsüblichen) Pinzette auf Filterpapier (oder ein Papiertuch) legen. Dabei die Pinzette beidseitig am Kopf ansetzen, damit der Schwanz nicht bricht. |
| (3) | Die Oberfläche des Fisches mit Filterpapier (oder einem Papiertuch) trockentupfen. |
| (4) | Den Fisch mit der Bauchseite nach oben legen. Mit einer kleinen Sezierschere zwischen ventralem Halsbereich und Bauchmitte einen kleinen transversalen Einschnitt vornehmen. |
| (5) | Die Sezierschere in diesen kleinen Einschnitt einführen und den Bauch auf ein kaudal zum Kiemenbogen angesetzten Schnittlinie entlang der Bauchmittellinie bis hin zur kranialen Seite des Afters öffnen. Um Leber und Gonaden nicht zu beschädigen, die Sezierschere nicht zu tief einführen. |
| (6) | Unter dem Stereomikroskop folgende Schritte vornehmen: |
| (7) | Den Fisch mit der Bauchseite nach oben auf das Papiertuch (oder eine gläserne Petrischale oder einen Glasträger) legen. |
| (8) | Die Wände der Bauchhöhle mit Präzisionspinzetten spreizen und die inneren Organe freilegen. Falls erforderlich, kann dazu eine Seite der Bauchhöhle entfernt werden. |
| (9) | Den anhaftenden Teil der Leber und der Gallenblase mit einer weiteren Präzisionspinzette freilegen. ³⁸⁸³Den Gallengang fassen und die Gallenblase abtrennen. ³⁸⁸⁴Dabei darauf achten, dass letztere nicht beschädigt wird. |
| (10) | Die Speiseröhre fassen, und auf die gleiche Weise den Magen-Darm-Trakt von der Leber abtrennen. ³⁸⁸⁶Darauf achten, dass kein Magen-Darm-Inhalt austritt. ³⁸⁸⁷Den Magen-Darm-Trakt schwanzseitig vom After trennen und aus der Bauchhöhe nehmen. |
| (11) | Fett und sonstiges Gewebe um die Leber entfernen. Die Leber darf dabei nicht beschädigt werden. |
| (12) | Den Leberausgang mit der Präzisionspinzette fassen und die Leber aus der Bauchhöhle entnehmen. |
| (13) | Die Leber auf den Glasträger legen. Mit der Präzisionspinzette erforderlichenfalls Fett und sonstiges externes Gewebe (z. B. Bauchfell) von der Leberoberfläche entfernen. |
| (14) | Das Gewicht der Leber mit einem 1,5-ml-Mikroröhrchen (Leergewicht) und einer elektronischen Analysewaage bestimmen. ³⁸⁹⁴Den Messwert in das Arbeitsblatt eintragen (auf 0,1 mg genau). ³⁸⁹⁵Mit den Angaben auf dem Etikett des Mikroröhrchens abgleichen. |
| (15) | Das Mikroröhrchen mit der Leber verschließen und in ein Kühlgestell (oder ein Eis-Rack) setzen. |
| (16) | Nach Exzision einer Leber die Sezierinstrumente reinigen oder wechseln. |
| (17) | Die Lebern aller Fische im Transportbehältnis entnehmen, wie oben beschrieben. |
| (18) | Nach Exzision der Lebern aller Fische im Transportbehältnis (d. h. aller männlichen oder allen weiblichen Tieren in einem Prüfbecken) die Leberproben in ein etikettiertes Reagenzglasgestell setzen und in einen Gefrierschrank stellen. Sind die Lebern kurz nach der Exzision einer Vorbehandlung zu unterziehen, die Proben in einem Kühlgestell (oder Eis-Rack) zum nächsten Arbeitsplatz bringen. |
Nach Exzision der Lebern steht der Fischkörper zur Messung der sekundären Geschlechtsmerkmale zu Verfügung.Leberproben
Die von den Prüffischen entnommenen Leberproben bei ≤ – 70 °C lagern, sofern sie nicht kurz nach der Exzision vorbehandelt werden sollen.
Abb. 1
Unmittelbar vor den Brustflossen einen Schereneinschnitt vornehmen.
 Abb. 2Auf der Bauchmittellinie bis zu einem Punkt etwa 2 mm kranial vor dem After einen Scherenschnitt durchführen.
 Abb. 3Die Bauchwände mit einer Pinzette spreizen, um die Leber und die anderen inneren Organe freizulegen. (Alternativ können die Bauchwände seitlich festgesteckt werden.)
 Abb. 4Die Leber grob sezieren und mit einer Pinzette entnehmen.
 Abb. 5Darm mit der Pinzette vorsichtig herausziehen.
 Abb. 6Beide Darmenden und etwaiges mesenteriales Gewebe mit einer Schere durchtrennen.
 Abb. 7 (Weibchen)Das Verfahren ist bei männlichen und weiblichen Fischen dasselbe.
 Abb. 8Verfahren abgeschlossen.
 Verfahren 2B: Japanische Reiskärpflinge (Oryzias latipes), Vorbehandlung der Leber für die Vitellogenin-Analyse:Die Flasche mit dem Homogenatpuffer aus dem ELISA-Kit nehmen und mit zerstoßenem Eis kühlen (Temperatur der Lösung: ≤ 4 °C). Wird Homogenatpuffer aus dem EnBio-ELISA verwendet, die Lösung zunächst bei Raumtemperatur auftauen und die Flasche anschließend auf zerstoßenem Eis kühlen.
³⁹¹³Das Volumen des Homogenatpuffers für die Leber richtet sich nach dem Lebergewicht. ³⁹¹⁴(pro mg Leber je 50 μl Homogenatpuffer.) Wiegt die Leber beispielsweise 4,5 mg, so beträgt das Volumen des Homogenatpuffers 225 μl. ³⁹¹⁵Die Volumina der Homogenatpuffer für sämtliche Lebern in einer Liste erfassen.
Vorbereitung der Lebern zur Vorbehandlung
| (1) | Das 1,5-ml-Mikroröhrchen mit der Leber erst unmittelbar vor der Vorbehandlung aus dem Gefrierschrank nehmen. |
| (2) | Um Vitellogenin-Kontaminationen zu vermeiden, die Lebern männlicher Fische vor den Lebern der weiblichen Fische vorbehandeln. Die Vorbehandlung der Testgruppen sollte zudem in der folgenden Reihenfolge ablaufen: Kontrolle, (gegebenenfalls) Lösungsmittelkontrolle, niedrigste Konzentration, mittlere Konzentration, höchste Konzentration. |
| (3) | Aus dem Gefrierschrank immer nur so viel 1,5-ml-Mikroröhrchen mit Leberproben entnehmen, wie auch gleichzeitig zentrifugiert werden können. |
| (4) | Die 1,5-ml-Mikroröhrchen mit den Leberproben in der Reihenfolge der Nummern der Proben aus dem Eis-Rack anordnen. (Die Lebern brauchen nicht aufgetaut zu werden.) |
Vorbehandlung1. Zugabe des Homogenatpuffers
| (1) | Nachdem anhand der Liste geprüft wurde, welches Volumen des Homogenatpuffers jeweils für ein Leberpräparat zu verwenden ist, die Mikropipette (Volumenbereich 100-1 000 μl) auf das entsprechende Volumen einstellen. Eine saubere Spitze aufsetzen. |
| (2) | Homogenatpuffer aus der Reagenzflasche entnehmen und in die 1,5-ml-Mikroröhrchen mit Leber geben. |
| (3) | Homogenatpuffer allen leberhaltigen 1,5-ml-Mikroröhrchen wie oben beschrieben zugeben. ³⁹²⁵Die Spitze der Mikropipette braucht nicht gewechselt zu werden. ³⁹²⁶Ist die Spitze jedoch verunreinigt oder wird vermutet, dass sie verunreinigt ist, muss sie jedoch ausgewechselt werden. |
2. Homogenisieren der Leber | (1) | Am Homogenisator ein neues Pistill befestigen. |
| (2) | Das Pistill in das 1,5-ml-Mikroröhrchen einführen. Dabei den Mikroröhrchen-Homogenisator so halten, dass die Leber zwischen Pistill-Oberfläche und innere Wand des 1,5-ml-Mikroröhrchens gedrückt wird. |
| (3) | Den Mikroröhrchen-Homogenisator für 15-20 Sekunden bedienen. Danach das 1,5-ml-Mikroröhrchen auf zerstoßenem Eis abkühlen. |
| (4) | Das Pistill aus dem 1,5-ml-Mikroröhrchen nehmen und die Probe etwa 10 Sekunden ruhen lassen. Anschließend eine Sichtprüfung des Suspensionszustands vornehmen. |
| (5) | Sind Leberstückchen in der Suspension zu erkennen, die Schritte (3) und (4) wiederholen, um ein zufriedenstellendes Leberhomogenat zu erhalten. |
| (6) | Das suspendierte Leberhomogenat bis zum Zentrifugieren auf dem Eis-Rack abkühlen. |
| (7) | Das Pistill bei jedem neuen Homogenat auswechseln. |
| (8) | Alle Lebern mit dem Homogenatpuffer homogenisieren, wie oben beschrieben. |
3. Zentrifugen des suspendierten Leberhomogenats | (1) | Sicherstellen, dass die gekühlte Zentrifugierkammer eine Temperatur von ≤ 5 °C aufweist. |
| (2) | Die 1,5-ml-Mikroröhrchen mit dem suspendierten Leberhomogenat in die gekühlte Zentrifuge stellen (erforderlichenfalls nach einer Ausbalancierung). |
| (3) | Das suspendierte Leberhomogenat für 10 Minuten bei einer Temperatur von ≤ 5 °C mit 13 000 g zentrifugieren. Wird der Überstand in geeigneter Weise abgetrennt, können Zentrifugalkraft und Zeitdauer jedoch nach Bedarf eingestellt werden. |
| (4) | Nach der Zentrifugierung kontrollieren, ob der Überstand angemessen abgetrennt wurde (Oberfläche: lipid; Zwischenschicht: Überstand, untere Schicht: Lebergewebe). Bei unangemessener Trennung die Suspension unter denselben Bedingungen erneut zentrifugieren. |
| (5) | Alle Proben aus der gekühlten Zentrifuge nehmen und in der Reihenfolge der Nummern der Proben auf dem Eis-Rack anordnen. Dabei darauf achten, dass die getrennten Schichten nach dem Zentrifugen nicht resuspendieren. |
4. Entnahme des Überstands | (1) | Vier 0,5-ml-Mikroröhrchen zur Entnahme des Überstands in das Reagenzglasgestell setzen. |
| (2) | Jeweils 30 μl Überstand (als Zwischenschicht abgetrennt) mit der Mikropipette entnehmen und in eines der 0,5-ml-Mikroröhrchen geben. Dabei darauf achten, dass kein Lipidmaterial (Oberfläche) oder Lebergewebe (untere Schicht) aufgenommen werden. |
| (3) | Den Überstand entnehmen und wie oben beschrieben in zwei weitere 0,5-ml-Mikroröhrchen dispensieren. |
| (4) | Übrigen Überstand mit der Mikropipette entnehmen (möglichst ≥ 100 μl) und in das verbleibende 0,5-ml-Mikroröhrchen geben. Dabei darauf achten, dass kein Lipidmaterial (Oberfläche) oder Lebergewebe (untere Schicht) aufgenommen wird. |
| (5) | Das 0,5-ml-Mikroröhrchen verschließen und auf dem Etikett das Volumen des Überstands notieren. Danach die Mikroröhrchen sofort auf dem Eis-Rack kühlen. |
| (6) | Für jeden Überstand die Spitze der Mikropipette wechseln. Haftet sehr viel Lipidmaterial an der Spitze an, die Spitze umgehend auswechseln, um den das Leberextrakt nicht mit Fett zu kontaminieren. |
| (7) | Den gesamten zentrifugierten Überstand wie oben beschrieben in vier 0,5-ml-Mikroröhrchen geben. |
| (8) | Danach alle etikettierten Mikroröhrchen in das Reagenzglasgestell setzen und im Gefrierfach einfrieren. ³⁹⁵⁸Werden die VTG-Konzentrationen unmittelbar nach der Vorbehandlung gemessen, ein 0,5-ml-Mikroröhrchen (mit 30 μl des Überstands) im Reagenzglasgestell abkühlen und an den Arbeitsplatz bringen, an dem der ELISA durchgeführt werden soll. ³⁹⁵⁹In diesem Fall die übrigen Mikroröhrchen in die Reagenzglasgestelle setzen und im Gefrierschrank einfrieren. |
| (9) | Nach Entnahme des Überstands den verbleibenden Rückstand angemessen entsorgen. |
Lagerung der ProbeDie 0,5-ml-Mikroröhrchen mit dem Überstand des Leberhomogenats bis zur Durchführung des ELISA bei ≤ – 70 °C lagern.
Verfahren 3A: Zebrabärblinge, Blutentnahme aus der Schwanzvene/-arterie
Unmittelbar nach der Betäubung den Schwanzansatz mit einem Skalpell teilweise durchtrennen und mit einem heparinisierten Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen aus der Schwanzvene/-arterie Blut entnehmen. ³⁹⁶³Die Blutvolumen betragen je nach Größe der Fische 5 bis 15 μl. ³⁹⁶⁴In das Mikrokapillarrohr die gleiche Menge Aprotininpuffer (6 μgml in PBS) geben, und das Plasma durch Zentrifugieren (5 Minuten bei 600 g) vom Blut trennen. ³⁹⁶⁵Das Plasma in den Teströhrchen auffangen und bis zur Bestimmung der Vitellogenin-Konzentration oder anderer relevanter Proteine bei – 20 °C lagern.
Verfahren 3B: Zebrabärblinge, Blutentnahme durch Herzpunktion
Um eine Koagulierung des Bluts und einen Proteinabbau zu vermeiden, die Proben mit heparinisierter (1 000 Einheiten/ml) phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dem Proteasehemmer Aprotinin (2 TIU/ml) entnehmen. ³⁹⁶⁷Als Pufferbestandteile werden Heparin- ammoniumsalz und lyophilisiertes Aprotinin, für die Blutentnahme Spritzen (1 ml) mit fixierter dünner Nadel (z. B. Braun Omnikan-F) empfohlen. ³⁹⁶⁸Die Spritze muss mit der Pufferlösung vorgefüllt sein (ca. ³⁹⁶⁹100 μl), damit die geringen Blutvolumina der einzelnen Fische vollständig eluiert werden können. ³⁹⁷⁰Die Blutproben durch Herzpunktion entnehmen. ³⁹⁷¹Dazu die Fische zunächst mit MS-222 (100 mg/l) betäuben. ³⁹⁷²Bei angemessener Betäubung ist der Herzschlag der Zebrabärblinge wahrnehmbar. ³⁹⁷³Beim Punktieren des Herzens den Spritzenkolben unter leichter Spannung halten. ³⁹⁷⁴Die zu entnehmendem Blutvolumina liegen zwischen 20 und 40 μl. ³⁹⁷⁵Nach der Herzpunktion das Blut-/Puffer-Gemisch in die Teströhrchen geben. ³⁹⁷⁶Das Plasma durch Zentrifugieren (20 min mit 5 000 g) vom Blut trennen und bis zur Analyse bei – 80 °C lagern.
Verfahren 3C: Standardarbeitsverfahren (SOP): Zebrabärblinge, Homogenisierung von Kopf- und Schwanzgewebe
| (1) | Die Fische betäuben und töten, wie für den Test beschrieben. |
| (2) | Kopf und Schwanz der Fische abtrennen, siehe Abbildung 1. |
Wichtig: Alle Sezierinstrumente und das Sezierbrett sind nach jedem Fisch abzuspülen und ordnungsgemäß zu reinigen (z. B. mit 96 %igem Ethanol), um VTG-‚Kontaminationen‘ nicht induzierter Männchen durch weibliche Fische oder induzierte Männchen zu vermeiden.Abbildung 1
 | (3) | Das Gewicht der gepoolten Kopf- und Schwanzteile auf 1 mg genau abmessen. |
| (4) | Nach dem Wiegen die Teile in geeignete Röhrchen (z. B. 1,5 ml Eppendorf) geben und bei – 80 °C bis zur Homogenisierung einfrieren oder unmittelbar mit zwei Kunststoff-Pistillen auf Eis homogenisieren. (Alternativ können auch andere Methoden angewendet werden, sofern sie auf Eis durchgeführt werden und eine homogene Masse entsteht.) Wichtiger Hinweis: Die Röhrchen sind ordnungsgemäß zu nummerieren, damit die Kopf- und Schwanzteile für die histologische Gonadenuntersuchung dem jeweiligen Rumpf zugeordnet werden können. |
| (5) | Nach Herstellung einer homogenen Masse das Vierfache des Gewebegewichts des eisgekühlten Homogenisierungspuffers hinzugeben. ³⁹⁸⁴Mit den Pistillen weiterarbeiten, bis eine homogene Mischung entsteht. ³⁹⁸⁵Wichtiger Hinweis: Für jeden Fisch ist ein frisches Pistill zu verwenden. |
| (6) | Die Proben bis zur Zentrifugierung (4 °C, 50 000 g, 30 Minuten) auf Eis legen. |
| (7) | Mit einer Pipette 20 μl-Portionen des Überstands in mindestens zwei Röhrchen geben; dabei die Spitze der Pipette durch die oberflächige Fettschicht führen und den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne jedoch Fett- oder Pelletfraktionen mitaufzunehmen. |
| (8) | Die Röhrchen bis zur Verwendung bei – 80 °C lagern. |
Anlage 7Vitellogenin-angereicherte Proben und Inter-Assay-Referenzstandard
An jedem Tag, an dem Vitellogenin-Bestimmungen vorgenommen werden, ist eine nach einem Inter-Assay-Referenzstandard hergestellte Anreicherungsprobe zu analysieren. Das für den Inter-Assay-Referenzstandard verwendete Vitellogenin muss aus einer anderen Charge als das Vitellogenin stammen, das zur Herstellung der Kalibrierstandards für den durchzuführenden Assay verwendet wurde.
³⁹⁹¹Die Anreicherungsprobe wird hergestellt, indem eine bekannte Menge des Inter-Assay-Standards einer Plasmaprobe männlicher Kontrollfische zugegeben wird. ³⁹⁹²Die Probe anreichern, bis eine Vitellogenin-Konzentration erreicht wird, die 10- bis 100-mal höher ist als die bei männlichen Kontrollfischen erwartete VTG-Konzentration. ³⁹⁹³Die so angereicherte Probe kann von einem einzelnen Fisch oder von mehreren Fischen stammen.
³⁹⁹⁴In mindestens zwei Mulden eine Teilprobe nicht angereicherten Plasmas männlicher Kontrolltiere analysieren. ³⁹⁹⁵Die angereicherte Probe auch in mindestens zwei Duplikatmulden analysieren. ³⁹⁹⁶Die mittlere VTG-Menge in den beiden nicht angereicherten Plasmaproben männlicher Kontrollfische der berechneten Vitellogenin-Menge hinzurechnen, die zur Anreicherung der Proben zugegeben wurde, um die erwartete Konzentration zu bestimmen. ³⁹⁹⁷Das Verhältnis dieser erwarteten zur gemessenen Konzentration zusammen mit den Ergebnissen der an dem betreffenden Tag durchgeführten Assays protokollieren.
Anlage 8
Flussdiagramm als Entscheidungshilfe für die statistischen Analyse
 C.38. DER AMPHIBIEN-METAMORPHOSE-ASSAY (AMA)EINLEITUNG
| 1. | ³⁹⁹⁸Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 231 (2009). ³⁹⁹⁹Angesichts des Risikos, dass in der Umwelt vorhandene Chemikalien Menschen und wild lebende Pflanzen und Tiere beeinträchtigen könnten, muss eine Prüfung zum Nachweis von auf das Schilddrüsensystem von Vertebraten wirkenden Chemikalien entwickelt und validiert werden. ⁴⁰⁰⁰1998 hat die OECD eine prioritäre Aktivität zur Änderung bestehender technischer Leitlinien zum Screening und zum Testen von Chemikalien mit potenziell endokriner Wirkung initiiert. ⁴⁰⁰¹Ein Element dieser Aktivität bestand in der Entwicklung einer technischen Leitlinie für das Screening von Chemikalien, die auf das Schilddrüsensystem von Wirbeltierarten wirken. ⁴⁰⁰²Vorgeschlagen wurde eine zum einen die Überarbeitung der Studie zur Toxizität bei Nagetieren nach wiederholter 28-tägiger oraler Gabe (Kapitel B.7 in diesem Anhang) und zum anderen die Entwicklung des Amphibien-Metamorphose-Assays (AMA). ⁴⁰⁰³Die überarbeitete Prüfmethode B.7 wurde einer Validierung unterzogen und anschließend veröffentlicht. ⁴⁰⁰⁴Der Amphibien-Metamorphose-Assay (AMA) wurde ebenfalls in einem umfassenden Validierungsprogramm mit Intra- und Interlaborstudien untersucht, in denen die Relevanz und die Zuverlässigkeit des Tests nachgewiesen wurden (1, 2). ⁴⁰⁰⁵Anschließend wurde der Test einem Peer-Review durch eine Gruppe unabhängiger Experten unterzogen (3). ⁴⁰⁰⁶Diese Prüfmethode beruht auf den Erfahrungen aus Validierungsstudien zum Nachweis von auf die Schilddrüse wirkenden Chemikalien und auf Arbeiten in anderen OECD-Mitgliedsländern. |
PRINZIP DER PRÜFUNG | 2. | ⁴⁰⁰⁷Der Amphibien-Metamorphose-Assay (AMA) ist ein Test zur empirischen Bestimmung von Chemikalien, die das normale Funktionieren der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsen-Achse (HPT-Achse) beeinträchtigen können. ⁴⁰⁰⁸Der AMA stellt ein generalisiertes Vertebratenmodell dar, das auf den konservierten Strukturen und Funktionen der HPT-Achse beruht. ⁴⁰⁰⁹Der Test ist deshalb von Bedeutung, weil die Metamorphose von Amphibien einen gut untersuchten schilddrüsenbezogenen Prozess darstellt, der auf in der HPT-Achse wirksame Chemikalien reagiert. ⁴⁰¹⁰Außerdem ist dieser Test der einzige Test mit dem thyroidale Aktivität in einem Tier während der Metamorphose nachgewiesen werden kann. |
| 3. | ⁴⁰¹¹Das allgemeine Prüfprotokoll sieht die Exposition von Krallenfrosch-Larven (Xenopus-laevis) des Stadiums 51 durch mindestens drei verschiedene Konzentrationen einer Prüfchemikalie und eine Verdünnungswasserkontrolle über einen Zeitraum von 21 Tagen vor. ⁴⁰¹²Für jede Prüfkonzentration werden vier Replikate verwendet. ⁴⁰¹³Zu Beginn des Tests werden bei allen Behandlungsgruppen 20 Larven pro Prüfbecken eingesetzt. ⁴⁰¹⁴Als Endpunkte werden die Länge der Hinterbeine, die Kopf-Rumpf-Länge, das Entwicklungsstadium, die Feuchtmasse, die Histologie der Schilddrüse und die tägliche Mortalität erfasst. |
BESCHREIBUNG DER METHODEPrüfspezies
| 4. | ⁴⁰¹⁵Der Krallenfrosch (Xenopus laevis) wird weltweit in Labors kultiviert und ist im Handel ohne Weiteres zu beschaffen. ⁴⁰¹⁶Bei dieser Art kann die Reproduktion ganzjährig leicht durch Injektionen von humanem Choriongonadotropin (hCG) angeregt werden; die entstehenden Larven können in großer Anzahl bis zu den gewünschten Entwicklungsstadien aufgezogen werden, die dann in auf bestimmte Stadien bezogenen Prüfprotokollen verwendet werden können. ⁴⁰¹⁷Die im Test zu verwendenden Larven sollten vorzugsweise von im jeweiligen Labor gezogenen adulten Tieren stammen. ⁴⁰¹⁸Alternativ (wenngleich nicht als bevorzugtes Verfahren) können auch Eier oder Embryos an die mit dem Test beauftragten Labors geschickt werden; in den Labors muss dann eine gewisse Akklimatisierungszeit vorgesehen werden. ⁴⁰¹⁹Der Versand von Larven ist bei diesem Test nicht annehmbar. |
Ausrüstung und Verbrauchsmaterial | 5. | Zur Durchführung dieses Tests werden die folgende Ausrüstung und die folgenden Verbrauchsmaterialien benötigt:- a)
- Expositionssystem (siehe folgende Beschreibung);
- b)
- Aquarien aus Glas oder Edelstahl (siehe folgende Beschreibung);
- c)
- Brutbecken;
- d)
- Temperaturregelung (z. B. Heiz- oder Kühlgeräte, einstellbar auf 22 ± 1 °C);
- e)
- Thermometer;
- f)
- binokulares Präpariermikroskop;
- g)
- Digitalkamera (mit einer Auflösung von mindestens 4 Megapixeln und mit Mikroskopfunktion);
- h)
- Software zur Bilddigitalisierung
- i)
- Petrischale (z. B. 100 × 15 mm) oder transparente Kulturschalen aus Kunststoff in vergleichbarer Größe;
- j)
- Analysewaage mit einer Messgenauigkeit von 3 Dezimalstellen (mg);
- k)
- Oxi-Meter (zur Messung des gelösten Sauerstoffs);
- l)
- pH-Messgerät;
- m)
- Gerät zur Messung der Lichtintensität (Anzeige in lx);
- n)
- verschiedene Labor-Glasgeräte und -Werkzeuge;
- o)
- einstellbare Pipetten (10-5 000 μl) oder Pipettensortiment in entsprechenden Größen;
- p)
- Prüfchemikalie in hinreichenden Mengen zur Durchführung des Tests, vorzugsweise aus einer Charge;
- q)
- Analysegeräte zur Untersuchung der zu prüfenden Chemikalien bzw. ein entsprechender Analyse-Dienstleister.
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Prüfbarkeit der Chemikalie | 6. | ⁴⁰²¹Der AMA beruht auf einem Protokoll zur Exposition in Wasser, bei dem die Prüfchemikalie über ein Durchflusssystem in die Becken geleitet wird. ⁴⁰²²Mit Durchflusssystemen sind jedoch Einschränkungen hinsichtlich der Chemikalientypen verbunden, die geprüft werden können. ⁴⁰²³Maßgeblich sind die jeweiligen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Chemikalie. ⁴⁰²⁴Vor der Anwendung dieses Protokolls sind daher grundlegende Informationen zur jeweiligen Chemikalie zu beschaffen, die für die Durchführbarkeit des Tests von Bedeutung sind. Außerdem ist das OECD Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures (4) zu konsultieren. ⁴⁰²⁵Folgende Merkmale sind Anzeichen dafür, dass die betreffende Chemikalie in aquatischen Systemen vielleicht schwierig zu untersuchen ist: hohe Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (log Kow), hohe Flüchtigkeiten, Hydrolyse- und Photolysetendenz im Labor bei Umgebungsbeleuchtung. ⁴⁰²⁶Ob Chemikalien geprüft werden können, hängt unter Umständen noch von weiteren Faktoren ab, die im Einzelfall ebenfalls zu berücksichtigen sind. ⁴⁰²⁷Wenn die zu untersuchende Chemikalie mit einem Durchflusssystem nicht getestet werden kann, ist vielleicht ein System mit statischer Exposition geeignet. ⁴⁰²⁸Kommt bei einer Chemikalie keine dieser beiden Möglichkeiten in Betracht, kann die Chemikalie mit diesem Protokoll nicht geprüft werden. |
Expositionssystem | 7. | ⁴⁰²⁹Vorzugsweise ist ein Durchflusssystem zu verwenden. ⁴⁰³⁰Wenn die physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften einer Prüfchemikalie die Verwendung eines Durchflusssystems nicht zulassen, kann ein alternatives Expositionssystem (z. B. ein System mit statischer Exposition) eingesetzt werden. ⁴⁰³¹Bestandteile des Systems, die mit Wasser in Berührung kommen, müssen aus Glas, Edelstahl und/oder Polytetrafluorethylen bestehen. ⁴⁰³²Wenn die Untersuchungsergebnisse nicht beeinträchtigt werden, kann alternativ auch geeignetes Kunststoffmaterial verwendet werden. ⁴⁰³³Als Expositionsbecken sind Glas- oder Edelstahlaquarien mit Standrohren, einem Volumen zwischen 4,0 und 10,0 l und einer Wassertiefe von mindestens 10-15 cm zu verwenden. ⁴⁰³⁴Das System muss für sämtliche Expositionskonzentrationen und eine Kontrolle sowie vier Replikate pro Behandlung ausgelegt sein. ⁴⁰³⁵Der Durchfluss in die einzelnen Becken muss konstant sein; dabei sind sowohl die Aufrechterhaltung der biologischen Bedingungen als auch die Exposition durch die Chemikalie zu berücksichtigen (z. B. 25 ml/min). ⁴⁰³⁶Die Becken mit den Prüfkonzentrationen sind im Expositionssystem randomisiert aufzustellen, um Beeinflussungen infolge der Aufstellung zu reduzieren (u. a. geringfügige Unterschiede in Temperatur oder Lichtintensität). Mit Leuchtstofflampen wird eine Photoperiode von 12 h Licht: 12 h Dunkelheit mit einer Intensität von 600-2 000 lx (Lumen/m2) auf der Wasseroberfläche eingestellt. ⁴⁰³⁷In den Becken müssen eine Wassertemperatur von 22 ± 1 °C und ein pH-Wert von 6,5-8,5 aufrechterhalten werden; die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in den Becken mit den verschiedenen Prüfkonzentrationen muss > 3,5 mg/l betragen (> 40 % der Luftsättigung). ⁴⁰³⁸Mindestens die Wassertemperatur, der pH-Wert und der Anteil an gelöstem Sauerstoff sind wöchentlich zu messen. ⁴⁰³⁹Die Temperatur sollte vorzugsweise in mindestens einem Prüfgefäß kontinuierlich gemessen werden. ⁴⁰⁴⁰In Anlage 1 werden die Versuchsbedingungen des Prüfprotokolls beschrieben. Weitere Informationen zum Aufbau von Durchfluss-Expositionssystemen und/oder von Systemen mit statischer Erneuerung sind dem ASTM Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians (5) sowie den Beschreibungen allgemeiner aquatischer Toxizitätsprüfungen zu entnehmen. |
Wasserqualität | 8. | ⁴⁰⁴¹Für den Test kann beliebiges vor Ort verfügbares Wasser (z. B. Quellwasser oder mit Aktivkohle gefiltertes Leitungswasser) verwendet werden, bei dem Krallenfrosch-Larven normal wachsen und sich entwickeln. ⁴⁰⁴²Da die Wasserqualität je nach Standort von Region zu Region sehr unterschiedlich sein kann, ist die Wasserqualität insbesondere dann zu analysieren, wenn keine historischen Daten über die Verwendbarkeit des Wassers für die Aufzucht von Krallenfröschen verfügbar sind. ⁴⁰⁴³Besonders ist darauf zu achten, dass das Wasser frei von Kupfer, Chlor und Chloraminen ist; da diese Chemikalien für Frösche und Kaulquappen giftig sind. ⁴⁰⁴⁴Außerdem wird empfohlen, das Wasser auf eine Grundbelastung durch Fluorid, Perchlorat und Chlorat (bei der Desinfektion von Trinkwasser entstehende Nebenprodukte) zu untersuchen, da es sich bei den betreffenden Anionen um Substrate des Jodtransports der Schilddrüse handelt, die in erhöhten Konzentrationen das Ergebnis der Studie beeinflussen können. ⁴⁰⁴⁵Die Analysen sind vor Beginn der Tests vorzunehmen. ⁴⁰⁴⁶Im für den Test vorgesehenen Wasser sollten die genannten Anionen nicht enthalten sein. |
Jodkonzentration des Testwassers | 9. | ⁴⁰⁴⁷Damit die Schilddrüse Hormone synthetisieren kann, muss für die Larven im Wasser und im Futter ausreichend Jod verfügbar sein. ⁴⁰⁴⁸Gegenwärtig liegen keine empirisch ermittelten Leitlinien für mindestens erforderliche Jodkonzentrationen vor. ⁴⁰⁴⁹Die Jodverfügbarkeit kann jedoch die Empfindlichkeit verändern, mit der das Schilddrüsensystem auf Wirkstoffe reagiert, die auf die Schilddrüse wirken. ⁴⁰⁵⁰Es ist bekannt, dass Jod die Grundaktivität der Schilddrüse beeinflusst; dies ist bei der Auswertung der Ergebnisse histopathologischer Untersuchungen der Schilddrüse zu beachten. ⁴⁰⁵¹Daher sind Jodkonzentrationen, die in dem für den Test vorgesehenen Wasser gemessen wurden, zu protokollieren. Den verfügbaren Daten aus den Validierungsstudien zufolge hat sich das Protokoll bei Jodkonzentrationen (I–) zwischen 0,5 und 10 μg/l im Testwasser als geeignet erwiesen. ⁴⁰⁵²Im Idealfall sollte die minimalste Jodkonzentration im zu verwendenden Wasser bei 0,5 μg/l liegen. ⁴⁰⁵³Wenn das Testwasser aus entionisiertem Wasser rekonstituiert wird, muss Jod in einer Konzentration von mindestens 0,5 μg/l hinzugegeben werden. ⁴⁰⁵⁴Jegliche weitere Zugabe von Jod oder sonstigen Salzen zum Testwasser ist im Bericht zu vermerken. |
Hälterung der TiereHälterung der adulten Tiere und Zucht
| 10. | ⁴⁰⁵⁵Die Hälterung der adulten Tiere und die Zucht erfolgen entsprechend den Standardleitlinien. ⁴⁰⁵⁶Weitere Informationen sind der Standardanleitung zur Durchführung des Froschembryo-Teratogeneseassay-Xenopus (Fetax) (6) zu entnehmen. ⁴⁰⁵⁷Diese Standardleitlinien sind ein Beispiel für geeignete Haltungs- und Zuchtverfahren; eine strenge Befolgung ist aber nicht erforderlich. ⁴⁰⁵⁸Um die Laichreifung zu induzieren, wird Paaren (3-5) von adulten weiblichen und männlichen Tieren humanes Choriongonadotropin (hCG) injiziert. ⁴⁰⁵⁹Weiblichen und männlichen Exemplaren werden etwa 800 IU-1 000 IU bzw. 600 IU-800 IU hCG gelöst in 0,6- bis 0,9 %iger Salzlösung gespritzt. ⁴⁰⁶⁰Die Zuchtpaare werden in großen Becken ohne Störungen unter statischen Bedingungen gehalten, um den Amplexus zu fördern. ⁴⁰⁶¹Die Unterseite der Brutbecken sollte jeweils einen Zwischenboden aus Edelstahl- oder Kunststoffgitter enthalten, durch den der Laich auf den Boden des Beckens sinken kann. ⁴⁰⁶²Frösche, die am späten Nachmittag eine Injektion erhalten haben, laichen meist am Vormittag des Folgetages. ⁴⁰⁶³Nachdem eine hinreichende Anzahl an Eiern abgelegt und befruchtet wurden, sind die adulten Tiere aus den Brutbecken zu nehmen. |
Versorgung und Auswahl der Larven | 11. | ⁴⁰⁶⁴Nachdem die adulten Tiere aus den Brutbecken genommen wurden, werden die Eier entnommen und anhand einer repräsentativen Teilprobe der Embryos aus allen Brutbecken hinsichtlich ihrer Lebensfähigkeit beurteilt. ⁴⁰⁶⁵Der beste Laich (möglichst sollten 2-3 Laichproben auf ihre Qualität untersucht werden) wird aufbewahrt; die Qualität des Laichs wird anhand der zu erwartenden Lebensfähigkeit der Embryos und einer angemessenen Anzahl von Embryos (mindestens 1 500) beurteilt. ⁴⁰⁶⁶Alle in der Studie verwendeten Tiere sollten aus einem einzigen Laich stammen; der abgelegte Laich darf also nicht gemischt werden. ⁴⁰⁶⁷Die Embryos werden in eine große flache Schale oder Schüssel gegeben, und alle offensichtlich toten oder anomal ausgebildeten Eier (siehe Definition in (5)) werden mit einer Pipette entfernt. ⁴⁰⁶⁸Die gesunden Embryos aus den drei Gelegen werden in drei getrennte Brutbecken gesetzt. ⁴⁰⁶⁹Vier Tage nach dem Einsetzen in die Brutbecken wird der gemessen an seiner Lebensfähigkeit und der Anzahl der geschlüpften Tiere beste Laich ausgewählt, und die Larven werden in eine geeignete Anzahl an Aufzuchtbecken mit einer Temperatur von 22 ± 1 °C gesetzt. ⁴⁰⁷⁰Außerdem werden einige zusätzliche Larven in weitere Becken gesetzt, die verwendet werden können, wenn in der ersten Woche Tiere in den Aufzuchtbecken sterben. ⁴⁰⁷¹So können die Besatzdichte aufrechterhalten und Entwicklungsunterschiede innerhalb der Kohorte eines einzigen Laichs reduziert werden. ⁴⁰⁷²Alle Aufzuchtbecken sind täglich durch Absaugen zu reinigen. ⁴⁰⁷³Vorsichtshalber sollten keine Latexhandschuhe, sondern Handschuhe aus Vinyl oder Nitril verwendet werden. ⁴⁰⁷⁴In der ersten Woche werden tote Larven täglich entfernt und durch neue Larven ersetzt, um die Besatzdichte aufrechtzuerhalten. ⁴⁰⁷⁵Die Fütterung muss mindestens zweimal täglich erfolgen. |
| 12. | ⁴⁰⁷⁶Vor der Exposition werden die Larven (Kaulquappen) an die Bedingungen der eigentlichen Testphase gewöhnt (Futtertyp, Temperatur, Photoperiode und Kulturmedium). ⁴⁰⁷⁷Daher sollte in der Phase vor der Exposition dasselbe Kultur-/Verdünnungswasser verwendet werden wie in der Expositionsphase. ⁴⁰⁷⁸Wenn die Larven vor der Exposition in einer statischen Kultur gehalten werden, ist das Kulturmedium mindestens zweimal wöchentlich vollständig zu ersetzen. ⁴⁰⁷⁹Eine überhöhte Besatzdichte infolge einer zu großen Anzahl an Larven in der Phase vor der Exposition ist zu vermeiden, weil dies die Entwicklung der Larven während der anschließenden Testphase deutlich beeinträchtigen könnte. ⁴⁰⁸⁰Daher sollte eine Besatzdichte von etwa 4 Larven/l Kulturmedium (statisches Expositionssystem) bzw. 10 Larven/l Kulturmedium (bei einem Durchfluss von z. B. 50 ml/min vor der Exposition bzw. im Kultursystem) nicht überschritten werden. ⁴⁰⁸¹Unter diesen Bedingungen sollten sich die Larven innerhalb von zwölf Tagen von den Stadien 45/46 bis zu Stadium 51 entwickeln. ⁴⁰⁸²Repräsentative Larven dieser Stammpopulation sind täglich hinsichtlich ihres Entwicklungsstadiums zu prüfen, um den ungefähren Zeitpunkt für den Beginn der Exposition abschätzen zu können. ⁴⁰⁸³Es ist sorgfältig darauf zu achten, dass Belastungen und Verletzungen der Larven minimiert werden, insbesondere beim Umsetzen der Larven, beim Reinigen der Aquarien und der Handhabung mit den Larven. ⁴⁰⁸⁴Belastende Umgebungsbedingungen/Maßnahmen sind zu vermeiden (beispielsweise hoher und/oder kontinuierlicher Lärm, Klopfen an die Aquarien, Schwingungen in den Aquarien, übermäßige Aktivität im Labor und rasche Änderungen der Umgebungsbedingungen (Beleuchtung, Temperatur, pH-Wert, gelöster Sauerstoff, Wasserdurchfluss usw.)). ⁴⁰⁸⁵Wenn die Larven innerhalb von 17 Tagen nach der Befruchtung Stadium 51 nicht erreicht haben, ist dies möglicherweise auf übermäßige Stressbelastung zurückzuführen. |
Kultivierung und Füttern der Larven | 13. | ⁴⁰⁸⁶Während der gesamten Phase vor der Exposition (nach Nieuwkoop und Faber (NF) Stadium 45/46) (8) und während der gesamten Testdauer von 21 Tagen werden die Larven. ⁴⁰⁸⁷mit handelsüblichem Larvenfutter (z.B. Sera Micron ®) versorgt (siehe Anlage 1); alternativ kann auch ein sonstiges Futter verwendet werden, das sich für die Durchführung des Amphibien-Metamorphose-Assays in gleichwertiger Weise als geeignet erwiesen hat. ⁴⁰⁸⁸Das Fütterungsprotokoll in der Phase vor der Exposition ist sorgfältig auf den Bedarf der sich entwickelnden Larven abzustimmen. ⁴⁰⁸⁹Frisch geschlüpften Larven sind also mehrmals täglich (mindestens zweimal) kleinere Futtermengen anzubieten. Es darf jedoch nicht zu viel Futter bereitgestellt werden; ansonsten i) wird die Wasserqualität beeinträchtigt, und ii) führen Futterpartikel und Detritus zum Verstopfen der Kiemen. ⁴⁰⁹⁰Die tägliche Futtermenge ist entsprechend dem Wachstum der Larven bis auf etwa 30 mg/Tier/Tag kurz vor Beginn des Tests zu erhöhen. Das im Handel erhältliche Futter hat sich in den Validierungsstudien als geeignet erwiesen, um ein angemessenes Wachstum und eine angemessene Entwicklung von X.-laevis-Larven zu ermöglichen. ⁴⁰⁹¹Es besteht aus feinen Partikeln, die in der Wassersäule lange Zeit gelöst bleiben und mit dem Durchfluss ausgewaschen werden. ⁴⁰⁹²Daher ist die gesamte tägliche Futtermenge auf kleinere Portionen zu verteilen, die mindestens zweimal täglich verabreicht werden. ⁴⁰⁹³Das Fütterungsprotokoll für dieses Futter ist Tabelle 1 zu entnehmen. ⁴⁰⁹⁴Die Futtermenge wird protokolliert. ⁴⁰⁹⁵Das Futter kann trocken oder als mit Verdünnungswasser hergestellte Stammlösung verabreicht werden. ⁴⁰⁹⁶Diese Stammlösung wird jeden zweiten Tag frisch zubereitet und bei 4 °C gelagert.Tabelle 1
Fütterungsprotokoll bei handelsüblichem Larvenfutter (z.B. Sera Micron ® ) in den Validierungsstudien mit X.-laevis-Larven während der In-vivo-Phase des AMA mit einem Durchflusssystem
| Studientag | Futtermenge (mg Futter/Tier/Tag) | | 0-4 | 30 | | 5-7 | 40 | | 8-10 | 50 | | 11-14 | 70 | | 15-21 | 80 |
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Analytik | 14. | ⁴⁰⁹⁷Vor der Durchführung einer Studie muss die Stabilität der Prüfchemikalie ermittelt werden. ⁴⁰⁹⁸Dazu sind die verfügbaren Informationen über die Löslichkeit, die Abbaubarkeit und die Flüchtigkeit zu verwenden. ⁴⁰⁹⁹Aus den Becken mit den Replikaten in den verschiedenen Konzentrationen werden zu Beginn des Tests (Tag 0) sowie während des Tests wöchentlich mindestens vier Proben der Testlösungen für chemische Analysen entnommen. ⁴¹⁰⁰Außerdem sollten die einzelnen Prüfkonzentrationen während der Vorbereitung des Systems vor Beginn des Tests analysiert werden, um das Systemverhalten zu prüfen. ⁴¹⁰¹Ferner wird empfohlen, die Stammlösungen beim Wechseln zu analysieren, insbesondere wenn das Volumen der Stammlösung die Chemikalie nicht in hinreichender Menge für die gesamte Dauer der regelmäßigen Probenahmen enthält. ⁴¹⁰²Wenn Chemikalien in einzelnen oder allen im Test verwendeten Konzentrationen nicht nachgewiesen werden können, sind die Stammlösungen zu messen und die Durchflussraten des Systems zu protokollieren, um die nominellen Konzentrationen berechnen zu können. |
Applikation der Chemikalie | 15. | ⁴¹⁰³Die Prüfchemikalie kann je nach physikalisch-chemischen Eigenschaften auf unterschiedliche Weise in das Prüfsystem eingebracht werden. ⁴¹⁰⁴Wasserlösliche Chemikalien können in Aliquoten des Testwassers in einer Konzentration gelöst werden, mit der die für den Test vorgesehene Zielkonzentration in einem Durchflusssystem erreicht wird. ⁴¹⁰⁵Chemikalien, die bei Raumtemperatur flüssig sind und sich nur beschränkt in Wasser lösen, können über Flüssig:Flüssig-Sättigungssäulen zugeführt werden. ⁴¹⁰⁶Chemikalien, die bei Raumtemperatur fest sind und sich nur beschränkt in Wasser lösen, können über Sättigungssäulen mit Glaswolle eingebracht werden (7). ⁴¹⁰⁷Vorzugsweise ist ein trägerfreies Prüfsystem zu verwenden; die Prüfchemikalien haben jedoch unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften, die wahrscheinlich unterschiedliche Ansätze bei der chemischen Aufbereitung des Wassers erfordern. Aus den folgenden Gründen sollten vorzugsweise weder Lösungsmittel noch Träger verwendet werden: i) Bestimmte Lösungsmittel können ihrerseits toxisch wirken und/oder unerwünschte oder unerwartete endokrine Reaktionen auslösen; ii) die Prüfung von Chemikalien oberhalb ihrer Wasserlöslichkeit (was bei Verwendung von Lösungsmitteln häufig vorkommt) kann die Genauigkeit beeinträchtigen, mit der die wirksamen Konzentrationen ermittelt werden; und iii) die Verwendung von Lösungsmitteln in länger dauernden Tests kann aufgrund der Aktivität von Mikroorganismen zur Entwicklung erheblicher ‚Biofilme‘ führen. ⁴¹⁰⁸Bei schwierig zu testenden Chemikalien kann, wenn unbedingt erforderlich, ein Lösungsmittel eingesetzt werden. Zur Ermittlung der besten Methode ist das OECD Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures zu konsultieren (4). ⁴¹⁰⁹Welches Lösungsmittel zu verwenden ist, hängt von den chemischen Eigenschaften der Chemikalie ab. ⁴¹¹⁰Bei aquatischen Toxizitätstests haben sich u. a. Aceton, Ethanol, Methanol, Dimethylformamid und Triethylen-Glykol als wirksam erwiesen. ⁴¹¹¹Wenn ein Lösungsmittel verwendet wird, müssen die Lösungsmittelkonzentrationen unter der chronischen höchsten geprüften Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung (NOEC) liegen; die OECD-Leitlinie empfiehlt höchstens 100 μl/l. ⁴¹¹²In einer kürzlich veröffentlichten Änderung wird eine Lösungsmittelkonzentration von nur 20 μl/l Verdünnungswasser empfohlen (12). ⁴¹¹³Wenn Lösungsmittel verwendet werden, sind zusätzlich zu den Kontrollen ohne Lösungsmittel auch geeignete Lösungsmittelkontrollen zu untersuchen (sauberes Wasser). ⁴¹¹⁴Kann eine Chemikalie nicht mit Wasser zugeführt werden (entweder aufgrund der physikalisch-chemischen Merkmale (geringe Löslichkeit) oder wegen der eingeschränkten chemischen Verfügbarkeit), kann eine Verabreichung mit dem Futter in Betracht gezogen werden. ⁴¹¹⁵Zur Verabreichung über das Futter wurden zwar Untersuchungen durchgeführt; dieser Expositionspfad ist allgemein aber nicht üblich. ⁴¹¹⁶Die ausgewählte Methode ist zu dokumentieren und analytisch zu verifizieren. |
Auswahl der PrüfkonzentrationenBestimmung der höchsten Prüfkonzentration
| 16. | Bei diesem Test sollte die höchste Konzentration der Löslichkeitsgrenze der Prüfchemikalie, — bei akut toxischen Chemikalien — der höchsten noch verträglichen Konzentration (Maximum Tolerated Concentration = MTC) oder 100 mg/l entsprechen; maßgeblich ist die jeweils niedrigste Konzentration. |
| 17. | ⁴¹¹⁸Als MTC wird die höchste Prüfkonzentration der Chemikalie bezeichnet, bei der die akute Mortalität weniger als 10 % beträgt. ⁴¹¹⁹Dieser Ansatz geht davon aus, dass empirische Daten zur akuten Mortalität vorliegen, nach denen die MTC bestimmt werden kann. ⁴¹²⁰Die Abschätzung der MTC ist unter Umständen ungenau und setzt in der Regel einschlägige Erfahrung voraus. ⁴¹²¹Die Verwendung von Regressionsmodellen dürfte der technisch solideste Ansatz für die Bestimmung der MTC sein. ⁴¹²²Eine brauchbare Abschätzung der MTC kann aber auch auf vorhandenen akuten Daten beruhen. In diesem Fall ist 1/3 des akuten LC50-Werts anzunehmen. ⁴¹²³Für die im Test verwendete Art liegen allerdings vielleicht keine Daten zur akuten Toxizität vor. ⁴¹²⁴Wenn für eine Art keine Daten zur akuten Toxizität verfügbar sind, kann ein auf 96 Stunden angelegter Test zur Ermittlung des LC50-Werts mit repräsentativen Larven (d. h. mit Larven aus demselben Stadium wie die für den AMA zu verwendenden Larven) durchgeführt werden. ⁴¹²⁵Wenn Daten anderer aquatischer Arten verfügbar sind (z. B. ermittelte LC50-Werte bei Fischen oder sonstigen Amphibienarten), kann die wahrscheinliche MTC mit entsprechender Erfahrung durch Extrapolation auf andere Arten bestimmt werden. |
| 18. | Wenn die Chemikalie nicht akut toxisch und bei einer Konzentration über 100 mg/l löslich ist, wird die Konzentration von 100 mg/l als höchste Prüfkonzentration (HTC = Highest Test Concentration) betrachtet, da diese Konzentration in der Regel als ‚praktisch ungiftig‘ angesehen wird. |
| 19. | ⁴¹²⁷Methoden zur statischen Erneuerung werden zwar nicht empfohlen, können aber verwendet werden, wenn die MTC mit Durchflussmethoden nicht erreicht werden kann. ⁴¹²⁸Wenn Methoden zur statischen Erneuerung zur Anwendung kommen, ist die Stabilität der Konzentration der Prüfchemikalie zu dokumentieren; die Konzentration muss innerhalb der Grenzwerte der Leistungskriterien erhalten werden. ⁴¹²⁹Zu empfehlen ist eine Erneuerung alle 24 Stunden: Erneuerungsperioden von über 72 Stunden sind nicht annehmbar. ⁴¹³⁰Außerdem müssen jeweils am Ende der Erneuerungsperioden unmittelbar vor der Erneuerung Parameter für die Wasserqualität (beispielsweise gelöster Sauerstoff, Temperatur oder pH-Wert) gemessen werden. |
Prüfkonzentrationsbereich | 20. | ⁴¹³¹Es werden mindestens drei Prüfkonzentrationen und eine Kontrolle mit sauberem Wasser (sowie erforderlichenfalls eine Kontrolle mit Lösungsmittel) benötigt. ⁴¹³²Die höchste und die niedrigste Prüfkonzentration müssen sich mindestens um eine Größenordnung unterscheiden. ⁴¹³³Der Abstandsfaktor der Dosierungen darf höchstens 0,1 und muss mindestens 0,33 sein. |
VERFAHRENBeginn und Durchführung der Prüfung
Tag 0
| 21. | ⁴¹³⁴Die Exposition wird begonnen, wenn in der noch nicht der Prüfchemikalie ausgesetzten Stammpopulation eine hinreichende Anzahl an Larven Entwicklungsstadium 51 (nach Nieuwkoop und Faber) (8) erreicht hat und höchstens 17 Tage nach der Befruchtung vergangen sind. ⁴¹³⁵Zur Auswahl der Testtiere werden gesunde und normal aussehende Larven der Stammpopulation in einem Gefäß mit einer geeigneten Menge an Verdünnungswasser gepoolt. ⁴¹³⁶Zur Bestimmung des Entwicklungsstadiums müssen die Larven mit einem kleinen Netz oder einem Sieb einzeln aus dem Sammelbecken entnommen und in eine durchsichtige Messkammer (z. B. eine 100-mm-Petrischale) mit Verdünnungswasser gegeben werden. ⁴¹³⁷Bei der Bestimmung des Stadiums sollte keine Betäubung vorgenommen werden; einzelne Larven können jedoch vor der Untersuchung mit 100 mg/l Tricainmethansulfonat (z. B. MS-222) betäubt werden, das in geeigneter Weise mit Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 7,0 gepuffert wurde. ⁴¹³⁸Wenn das Betäubungsmittel MS-222 angewandt wird, sollten Informationen über die richtige Anwendung bei erfahrenen Labors eingeholt werden. ⁴¹³⁹Die Methode ist zusammen mit den Testergebnissen zu protokollieren. ⁴¹⁴⁰Beim Umsetzen sind die Tiere sorgfältig zu behandeln, um Stressbelastung während der Behandlung zu minimieren und um Verletzungen zu vermeiden. |
| 22. | ⁴¹⁴¹Das Entwicklungsstadium der Tiere wird mit einem binokularen Präpariermikroskop bestimmt. ⁴¹⁴²Um die Unterschiede der Entwicklungsstadien zu minimieren, müssen die jeweiligen Entwicklungsstadien möglichst genau bestimmt werden. ⁴¹⁴³Nach Nieuwkoop und Faber (8) ist das wichtigste Anzeichen für das Erreichen von Stadium 41 die Morphologie der Hinterbeine. ⁴¹⁴⁴Die morphologischen Merkmale der Hinterbeine sind unter dem Mikroskop zu prüfen. ⁴¹⁴⁵Anhand auffälliger morphologischer Merkmale lässt sich das Stadium zuverlässig bestimmen, umfassende Informationen zur Bestimmung des Entwicklungsstadiums der Larven sind hingegen dem vollständigen Leitfaden von Nieuwkoop und Faber (8) zu entnehmen. ⁴¹⁴⁶Eine normale Entwicklung vorausgesetzt, kann mithilfe der folgenden Tabelle die Bestimmung der Entwicklungsstadien im gesamten Test vereinfacht und standardisiert werden, indem die auffälligen morphologischen Merkmale ermittelt werden, die mit den jeweiligen Stadien verbunden sind.Tabelle 2
Auffällige morphologische Merkmale von Entwicklungsstadien nach der Beschreibung von Nieuwkoop und Faber
| Auffällige morphologische Merkmale | Entwicklungsstadium | | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | | Hinterbeine | X | X | X | X | X | X | X | | | | | | | | | | | Vorderbeine | | | | | | X | X | X | X | X | | | | | | | | Kraniofaziale Struktur | | | | | | | | | | X | X | X | X | | | | | Morphologie des Geruchsnervs | | | | | | | | | | | X | X | X | | | | | Schwanzlänge | | | | | | | | | | | | | X | X | X | X |
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| 23. | ⁴¹⁴⁷Bei Beginn des Tests müssen alle Larven das Stadium 51 erreicht haben. ⁴¹⁴⁸Das auffälligste morphologische Merkmal dieses Entwicklungsstadiums ist die Morphologie der Hinterbeine (siehe Abbildung 1).Abbildung 1
Morphologie der Hinterbeine bei einer X.-laevis-Larve in Stadium 51
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| 24. | ⁴¹⁴⁹Neben dem Entwicklungsstadium kann für die Auswahl auch die Größe der Versuchstiere berücksichtigt werden. ⁴¹⁵⁰Dazu ist die gesamte Körperlänge (nicht die Kopf-Rumpf-Länge) an Tag 0 bei einer Unterprobe von etwa 20 Larven im NF-Stadium 51 zu messen. ⁴¹⁵¹Nach der Berechnung der mittleren Körperlänge dieser Gruppe können Mindest- und Höchstwerte für die gesamte Körperlänge der Versuchstiere zuzüglich einer Toleranz von ± 3 mm festgelegt werden (Mittelwerte der gesamten Körperlänge im Bereich von 24,0-28,1 mm für Larven im Stadium 51). ⁴¹⁵²Das Entwicklungsstadium ist jedoch das Hauptkriterium dafür, ob die einzelnen Tiere für den Test verwendet werden können. ⁴¹⁵³Larven mit offensichtlichen groben Fehlbildungen oder Verletzungen sind vom Test auszuschließen. |
| 25. | ⁴¹⁵⁴Larven, die die oben beschriebenen Anforderungen an das Entwicklungsstadium erfüllen, werden in einem Becken mit sauberem Kulturwasser gehalten, bis die Bestimmung des Entwicklungsstadiums abgeschlossen ist. ⁴¹⁵⁵Nach der Bestimmung des Entwicklungsstadiums werden die Larven randomisiert auf die Expositionsbecken verteilt, bis sich in jedem Becken 20 Larven befinden. ⁴¹⁵⁶Danach werden die einzelnen Becken auf Tiere mit Auffälligkeiten (Verletzungen, ungewöhnliches Schwimmverhalten usw.) untersucht. ⁴¹⁵⁷Offensichtlich nicht gesunde Larven sind aus den Becken zu entfernen und durch frisch ausgewählte Larven aus dem Sammelbecken zu ersetzen. |
Beobachtungen | 26. | Detailliertere Informationen über Verfahren zum Abschluss der Prüfung und zur Behandlung der Larven sind dem OECD Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology (9) zu entnehmen. |
Messungen an Tag 7 | 27. | ⁴¹⁵⁹An Tag 7 werden aus jedem Prüfbecken fünf zufällig ausgewählte Larven pro Replikat entnommen. ⁴¹⁶⁰Das Randomisierungsverfahren muss gewährleisten, dass für alle Tiere die gleiche Auswahlwahrscheinlichkeit gegeben ist. ⁴¹⁶¹Dies kann mit einem beliebigen Randomisierungsverfahren sichergestellt werden; allerdings müssen alle Larven entnommen werden. ⁴¹⁶²Nicht ausgewählte Larven werden wieder in das ursprüngliche Becken gesetzt. ⁴¹⁶³Die ausgewählten Larven werden getötet, indem sie (z. B.) in 150-200 mg/l MS-222 (mit Natriumbicarbonat auf pH 7,0 gepuffert) eingelegt werden. ⁴¹⁶⁴Die getöteten Larven werden mit Wasser abgespült und trockengetupft; anschließend wird das Körpergewicht mit einer Genauigkeit von 1 mg bestimmt. ⁴¹⁶⁵Bei den Larven werden jeweils die Länge der Hinterbeine, die Kopf-Rumpf-Länge und (mit einem Präpariermikroskop) das Entwicklungsstadium bestimmt. |
Messungen an Tag 21 (Beendigung der Prüfung) | 28. | ⁴¹⁶⁶Am Ende der Prüfung (an Tag 21) werden die übrigen Larven aus den Prüfbecken entnommen und wie oben beschrieben getötet, indem sie (z. B.) in 150-200 mg/l MS-222 (mit Natriumbicarbonat auf pH 7,0 gepuffert) eingelegt werden. ⁴¹⁶⁷Die Larven werden mit Wasser abgespült und trockengetupft; anschließend wird das Körpergewicht mit einer Genauigkeit von 1 mg bestimmt. ⁴¹⁶⁸Für die Larven werden jeweils das Entwicklungsstadium, die Kopf-Rumpf-Länge und die Länge der Hinterbeine bestimmt. |
| 29. | ⁴¹⁶⁹Alle Larven werden zur anschließenden histologischen Untersuchung entweder als Ganzkörperproben oder als Kopfgewebe-Proben, einschließlich Unterkiefer, 48-72 Stunden in Davidson-Fixierlösung gelegt. ⁴¹⁷⁰Für die histologischen Untersuchungen sind insgesamt fünf Larven pro Replikatbecken zu entnehmen. ⁴¹⁷¹Da die Höhe der follikulären Zellen vom Entwicklungsstadium abhängt (10), sollten für die histologische Untersuchung am besten möglichst Exemplare im gleichen Entwicklungsstadium verwendet werden. ⁴¹⁷²Um Exemplare im gleichen Entwicklungsstadium auszuwählen, sind sämtliche Larven zunächst einer Bestimmung des Entwicklungsstadiums zu unterziehen, bevor sie ausgewählt und anschließend zur Datenerfassung untersucht werden. ⁴¹⁷³Dieser Schritt ist erforderlich, weil aufgrund der normalen Entwicklungsunterschiede auch in den Becken mit den einzelnen Replikaten unterschiedliche Entwicklungsstadien erreicht werden. |
| 30. | ⁴¹⁷⁴Die für die histopathologischen Untersuchungen ausgewählten Tiere (n = 5 pro Replikat) sollten möglichst dem Median der Entwicklungsstadien der Kontrollen (gepoolte Replikate) entsprechen. ⁴¹⁷⁵Wenn sich in einzelnen Replikatbecken mehr als fünf Larven im betreffenden Stadium befinden, sind fünf Larven zufällig auszuwählen. |
| 31. | ⁴¹⁷⁶Wenn sich in Replikatbecken weniger als fünf Larven im betreffenden Stadium befinden, sind zufällig ausgewählte Larven des nächstniedrigeren oder -höheren Entwicklungsstadiums zu entnehmen (insgesamt bis zu fünf Larven pro Replikat). ⁴¹⁷⁷Vorzugsweise sollte die Entscheidung zur Untersuchung weiterer Larven aus dem nächsthöheren oder -niedrigeren Entwicklungsstadium auf einer Gesamtbewertung der Verteilung der Entwicklungsstadien in den Kontrollen und in den Becken mit den Prüfkonzentrationen beruhen. ⁴¹⁷⁸Wenn die Exposition eine Entwicklungsverzögerung bewirkt, sollten also zusätzliche Larven aus dem nächstniedrigeren Entwicklungsstadium verwendet werden. ⁴¹⁷⁹Bewirkt die Exposition eine schnellere Entwicklung, sollten zusätzliche Larven aus dem nächsthöheren Entwicklungsstadium verwendet werden. |
| 32. | ⁴¹⁸⁰Bei erheblichen Veränderungen in der Entwicklung der Larven infolge der Exposition gegenüber einer Prüfchemikalie gibt es unter Umständen keine Überschneidungen der Verteilung der verschiedenen Entwicklungsstadien bei den Becken mit den Prüfchemikalien mit dem berechneten Median der Entwicklungsstadien der Kontrollen. ⁴¹⁸¹Nur in diesen Fällen ist der Auswahlprozess zu modifizieren, indem ein vom Median der Entwicklungsstadien der Kontrollen abweichendes Stadium verwendet wird, um für die histopathologische Untersuchung der Schilddrüse eine Entnahme von Larven mit übereinstimmenden Entwicklungsstadien zu erzielen. ⁴¹⁸²Zudem werden bei unbestimmten (d. h. asynchronen) Stadien von jedem Replikat fünf Larven zufällig zur histologischen Analyse ausgewählt. ⁴¹⁸³Die Entnahme von Larven, die sich nicht in einem dem Median der Entwicklungsstadien der Kontrolle entsprechenden Entwicklungsstadium befinden, ist zu protokollieren. |
Bestimmung biologischer Endpunkte | 33. | ⁴¹⁸⁴Während der 21-tägigen Expositionsdauer werden primäre Endpunkte an den Tagen 7 und 21 gemessen; die Testtiere werden jedoch täglich einer visuellen Prüfung unterzogen. ⁴¹⁸⁵Tabelle 3 bietet einen Überblick über die Endpunkte der Messungen und die Zeitpunkte, zu denen Beobachtungen vorzunehmen sind. ⁴¹⁸⁶Detailliertere Informationen über technische Verfahren zur Messung von apikalen Endpunkten und von histologischen Untersuchungen sind den OECD-Leitfäden zu entnehmen (9).Tabelle 3
Zeitpunkte der Beobachtungen zur Kontrolle primärer Endpunkte im AMA
| Apikale Endpunkte | Täglich | Tag 7 | Tag 21 | | ߦ | | | | | ߦ | ߦ | | | ߦ | ߦ | | | ߦ | ߦ | | | ߦ | ߦ | | — | Histologische Untersuchung der Schilddrüse |
| | | ߦ |
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Apikale Endpunkte | 34. | ⁴¹⁸⁷Das Entwicklungsstadium, die Länge der Hinterbeine, die Kopf-Rumpf-Länge und die Feuchtmasse sind die apikalen Endpunkte des AMA. ⁴¹⁸⁸Diese Endpunkte werden im Folgenden kurz erläutert. ⁴¹⁸⁹Weitere technische Informationen zur Erfassung dieser Daten sind den Leitfäden zu entnehmen, auf die in der Anlage verwiesen wird. ⁴¹⁹⁰Diese enthalten auch Informationen zur computergestützten Analyse. ⁴¹⁹¹Die Berücksichtigung dieser Leitfäden ist zu empfehlen. |
Entwicklungsstadium | 35. | ⁴¹⁹²Das Entwicklungsstadium der X.-laevis-Larven wird anhand der entsprechenden Kriterien von Nieuwkoop und Faber (8) bestimmt. ⁴¹⁹³Aufgrund von Daten zu den Entwicklungsstadien wird festgestellt, ob eine Entwicklung beschleunigt, asynchron oder verzögert verläuft oder nicht beeinträchtigt wird. ⁴¹⁹⁴Eine beschleunigte oder verzögerte Entwicklung ist aus einem Vergleich des Medians der Entwicklungsstadien der Kontrollen und der Gruppen mit den Prüfkonzentrationen zu erkennen. ⁴¹⁹⁵Eine asynchrone Entwicklung ist zu protokollieren, wenn die untersuchten Gewebe zwar keine Fehlbildungen oder Anomalien aufweisen, die relativen Zeitpunkte der Morphogenese oder der Entwicklung verschiedener Gewebe eines einzelnen Tieres aber uneinheitlich sind. |
Länge der Hinterbeine | 36. | ⁴¹⁹⁶Die Differenzierung und das Wachstum der Hinterbeine werden durch Schilddrüsenhormone gesteuert und sind wesentliche Merkmale, die bereits für die Bestimmung des Entwicklungsstadiums herangezogen werden. ⁴¹⁹⁷Die Entwicklung der Hinterbeine wird bei der Bestimmung des Entwicklungsstadiums als qualitativer Aspekt berücksichtigt; hier wird sie jedoch als quantitativer Endpunkt betrachtet. ⁴¹⁹⁸Daher wird die Länge der Hinterbeine als Endpunkt gemessen, um Wirkungen auf die Schilddrüsenachse zu erkennen (Abbildung 2). ⁴¹⁹⁹Um eine konsistente Erfassung zu gewährleisten, wird immer die Länge des linken Hinterbeins ermittelt. ⁴²⁰⁰Die Länge der Hinterbeine wird sowohl an Tag 7 als auch an Tag 21 des Tests gemessen. ⁴²⁰¹An Tag 7 wird die Länge bei gestrecktem Hinterbein gemessen, wie in Abbildung 2 dargestellt. ⁴²⁰²An Tag 21 dagegen gestaltet sich die Messung der Hinterbeine wegen der Beugung der Beine schwieriger. ⁴²⁰³An diesem Tag wird daher von der Körperwand aus über die Mittellinie des Beins und über alle Winkel gemessen. ⁴²⁰⁴Änderungen der Hinterbeinlänge an Tag 7 werden auch dann als signifikant für eine potenzielle Aktivität der Schilddrüse betrachtet, wenn sie an Tag 21 nicht mehr auffallen. Die Längenmessungen werden anhand von Digitalfotos mithilfe einer Software zur Bildanalyse vorgenommen, wie im OECD Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology (9) beschrieben. |
Körperlänge und Feuchtmasse | 37. | ⁴²⁰⁵Im Prüfprotokoll ist die Messung der Kopf-Rumpf-Länge (KRL) (Abbildung 2) und der Feuchtmasse vorgesehen, um mögliche Wirkungen der Prüfchemikalien auf das Wachstum der Larven im Vergleich zur Kontrollgruppe beurteilen zu können. ⁴²⁰⁶Außerdem ermöglichen die Messwerte den Nachweis einer allgemeinen Toxizität der Prüfchemikalie. ⁴²⁰⁷Da die Entfernung des anhaftenden Wassers bei Gewichtsmessungen für die Larven belastend sein und die Haut der Larven beschädigt werden kann, werden die entsprechenden Messungen an Tag 7 nur an einer Unterprobe der Larven und erst am letzten Tag des Tests (Tag 21) an allen übrigen Larven vorgenommen. ⁴²⁰⁸Bei der Messung wird regelmäßig das kraniale Ende der Kloake als caudale Begrenzung angenommen. |
| 38. | Das Wachstum der Larven wird anhand der Kopf-Rumpf-Länge (KRL) beurteilt (siehe Abbildung 2).Abbildung 2
Verfahren zur Messung von (A) Körperlänge und (B) Hinterbeinlänge bei X.-laevis-Larven (1)
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Histologische Untersuchung der Schilddrüse | 39. | ⁴²¹⁰Das Entwicklungsstadium und die Hinterbeinlänge sind wichtige Endpunkte bei der Bewertung expositionsbezogener Änderungen der Metamorphose. ⁴²¹¹Eine Entwicklungsverzögerung an sich kann aber nicht als diagnostischer Indikator für eine antithyroidale Aktivität betrachtet werden. ⁴²¹²Einige Änderungen sind vielleicht nur in regelmäßigen histopathologischen Analysen feststellbar. ⁴²¹³Diagnosekriterien sind u. a. eine Hypertrophie/Atrophie der Schilddrüse, eine Hypertrophie der follikulären Zellen, eine Hyperplasie der follikulären Zellen und als zusätzliche qualitative Kriterien: das Follikellumen, die Kolloidqualität und die Höhe/Form der follikulären Zellen. ⁴²¹⁴Die Symptome sind mit vier Schweregraden zu erfassen. Informationen über die Entnahme und die Behandlung von Proben für histologische Analysen sowie zur Durchführung histologischer Analysen von Gewebeproben sind den Veröffentlichungen ‚Amphibian Metamorphosis Assay: Part 1 — Technical guidance for morphologic sampling and histological preparation‘ und ‚Amphibian Metamorphosis Assay: Part 2 — Approach to reading studies, diagnostic criteria, severity grading and atlas‘ (9) zu entnehmen. ⁴²¹⁵Labors, die den Test zum ersten Mal durchführen, sollten sich von erfahrenen Pathologen schulen lassen, bevor sie selbst histologische Analysen und Untersuchungen der Schilddrüse vornehmen. ⁴²¹⁶Bei offensichtlichen und signifikanten Änderungen der apikalen Endpunkte, die auf eine beschleunigte Entwicklung oder eine Asynchronie schließen lassen, ist eine histopathologische Analyse der Schilddrüse unter Umständen nicht erforderlich. ⁴²¹⁷Sind allerdings keine offensichtlichen morphologischen Änderungen oder Entwicklungsverzögerungen erkennbar, müssen histologische Analysen vorgenommen werden. |
Mortalität | 40. | ⁴²¹⁸Alle Prüfbecken sind täglich auf tote Larven zu prüfen, und für alle Becken ist jeweils die Anzahl der toten Larven zu protokollieren. ⁴²¹⁹Wenn Mortalitäten festgestellt werden, sind grundsätzlich Datum, Konzentration und Beckennummer zu vermerken. ⁴²²⁰Bemerkte tote Tiere sind umgehend aus den Becken zu entfernen. ⁴²²¹Mortalitäten von mehr als 10 % können auf ungeeignete Testbedingungen oder toxische Wirkungen der Prüfchemikalie hindeuten. |
Zusätzliche Beobachtungen | 41. | ⁴²²²Anomales Verhalten und offensichtliche erhebliche Fehlbildungen und Läsionen sind zu protokollieren. ⁴²²³Wenn diese festgestellt werden, sind grundsätzlich Datum, Konzentration und Beckennummer zu vermerken. ⁴²²⁴Normal ist, wenn sich die Larven in der Wassersäule so bewegen, dass sich der Schwanz über dem Kopf befindet, die Schwanzflosse regelmäßig rhythmisch schlägt, die Tiere regelmäßig an die Wasseroberfläche kommen, durch die Kiemen atmen und auf Reize reagieren. ⁴²²⁵Anomal wäre beispielsweise, wenn die Larven auf der Oberfläche treiben, am Boden des Beckens liegen, mit dem Bauch nach oben oder unregelmäßig schwimmen, nicht an die Oberfläche kommen und nicht auf Reize reagieren. ⁴²²⁶Außerdem sind deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Konzentrationen im Hinblick auf die Futteraufnahme zu protokollieren. ⁴²²⁷Erhebliche Fehlbildungen und Läsionen sind etwa morphologische Anomalien (z. B. Fehlbildungen der Beine), blutende Läsionen oder durch Bakterien oder Pilze verursachte Infektionen, um nur einige Beispiele zu nennen. ⁴²²⁸Die entsprechenden Beobachtungen sind qualitativer Art; sie sind klinischen Anzeichen für Krankheiten/Stressbelastung vergleichbar und in Relation zu den Tieren in den Kontrollen zu sehen. ⁴²²⁹Wenn in den Becken mit der Prüfchemikalie Fehlbildungen oder Läsionen in größerem Umfang und häufiger auftreten als in den Kontrollen, ist dies als Beleg für eine offensichtliche Toxizität zu betrachten. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGDatenerfassung
| 42. | ⁴²³⁰Alle Daten sind mit elektronischen Systemen oder manuell entsprechend der guten Laborpraxis (GLP) zu erfassen. ⁴²³¹Folgende Informationen sollten ermittelt werden: | Prüfchemikalie:- —
- Beschreibung der Prüfchemikalie: physikalisch-chemische Merkmale; Angaben zur Stabilität und zur biologischen Abbaubarkeit;
- —
- chemische Informationen und Daten: Methode und Häufigkeit der Herstellung von Verdünnungen; zu den Informationen über die Prüfchemikalien zählen die tatsächlichen und die nominellen Konzentrationen der Prüfchemikalien sowie gegebenenfalls auch von Chemikalien, die nicht als Ausgangschemikalien zu betrachten sind. Die Konzentration der Prüfchemikalie muss unter Umständen in den Stammlösungen und in den Testlösungen gemessen werden;
- —
- Lösungsmittel (andere als Wasser): Begründung der Auswahl des jeweiligen Lösungsmittels und Beschreibung des Lösungsmittels (Beschaffenheit und verwendete Konzentration);
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| Prüfbedingungen:- —
- Daten zu den Prüfbedingungen: Die Daten umfassen Beobachtungen zum Funktionieren des Prüfsystems sowie zur Testumgebung und zur Infrastruktur. Typische Daten sind beispielsweise Umgebungstemperatur, Testtemperatur, Photoperiode, Zustand kritischer Bestandteile des Expositionssystems (z. B. Pumpen, Zykluszähler, Druckwerte), Durchflusswerte, Wasserstände, Wechsel der Vorratsflaschen und Angaben zur Fütterung. Zu den allgemeinen Parametern der Wasserqualität zählen der pH-Wert, der Anteil an gelöstem Sauerstoff, die Leitfähigkeit, der Gesamtgehalt an Jod, die Alkalität und die Härte;
- —
- Abweichungen von der Prüfmethode: Zu erfassen sind alle Informationen über Abweichungen von der Prüfmethode; außerdem sind die Abweichungen ausführlich zu beschreiben;
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| Ergebnisse:- —
- Biologische Beobachtungen und Daten: tägliche Beobachtungen zur Mortalität, Nahrungsaufnahme, anomalem Schwimmverhalten, Lethargie, Gleichgewichtsverlust, Fehlbildungen, Läsionen usw.; zu bestimmten vorab festgelegten Zeitpunkten sind folgende Beobachtungen und Daten zu erfassen: Entwicklungsstadium, Länge der Hinterbeine, Kopf-Rumpf-Länge und Feuchtmasse;
- —
- statistische Analyseverfahren und Gründe für die Auswahl der verwendeten Verfahren; Ergebnisse der statistischen Analysen, vorzugsweise in tabellarischer Form;
- —
- histologische Daten: Zu diesen Daten zählen ausführliche Beschreibungen sowie Angaben zur Ausprägung und zur Häufigkeit bestimmter Beobachtungen, wie im Leitliniendokument zu histopathologischen Untersuchungen erläutert;
- —
- spontane Bemerkungen: Ausführliche Beschreibungen von Beobachtungen während der Studie, die sich keiner der vorstehenden Kategorien zuordnen lassen.
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Berichtlegung | 43. | ⁴²³³Anlage 2 enthält Tabellen zur täglichen Datenerfassung, die als Orientierung für die Eingabe von Rohdaten und für Berechnungen zusammenfassender Statistiken verwendet werden können. ⁴²³⁴Außerdem werden Tabellen zur Eingabe zusammengefasster Endpunktdaten bereitgestellt. ⁴²³⁵Tabellen für histologische Bewertungen sind Anlage 2 zu entnehmen. |
Leistungskriterien und Annehmbarkeit/Validität des Tests | 44. | ⁴²³⁶Bei erheblichen Abweichungen von der Prüfmethode sind die ermittelten Daten für Beurteilungen und für Berichte im Allgemeinen nicht annehmbar. ⁴²³⁷Daher wurden die folgenden Kriterien (Tabelle 4) als Leitlinien zur qualitativen Bewertung der durchgeführten Tests und des allgemeinen Verhaltens der Kontrollorganismen entwickelt.Tabelle 4.
Leistungskriterien des AMA
| Kriterium | Annehmbare Grenzwerte | | Prüfkonzentrationen | Kultivierung über eine Testdauer von 21 Tagen bei ≤ 20 % VK (Variabilität der gemessenen Prüfkonzentration) | | Mortalität in Kontrollen | ≤ 10 % — In den Kontrollen darf die Mortalität zwei Larven pro Replikat nicht übersteigen. | | Mindest-Medianwert der Entwicklungsstadien der Kontrollen am Ende des Tests | 57 | | Spanne der Entwicklungsstadien in der Kontrollgruppe | Das 10. ⁴²³⁹und das 90. ⁴²⁴⁰Perzentil der Verteilung der Entwicklungsstadien dürfen sich um höchstens vier Stadien unterscheiden. | | Gelöster Sauerstoff | ≥ 40 % Luftsättigung | | pH-Wert | Der pH-Wert muss zwischen 6,5 und 8,5 gehalten werden. Die einzelnen Replikate/Konzentrationen dürfen sich höchstens um 0,5 unterscheiden. | | Wassertemperatur | 22 ± 1 °C — Die einzelnen Replikate/Konzentrationen dürfen sich höchstens um 0,5 °C unterscheiden. | | Prüfkonzentrationen ohne offensichtliche Toxizität | ≥ 2 | | Leistungsfähigkeit der Replikate | Im gesamten Test dürfen nicht mehr als 2 Replikate beeinträchtigt sein. | | Besondere Bedingungen bei Verwendung eines Lösungsmittels | Wenn ein Trägerlösungsmittel verwendet wird, sind jeweils eine Kontrolle mit dem Lösungsmittel und eine Kontrolle mit sauberem Wasser zu verwenden und die Ergebnisse zu protokollieren. | | Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Kontrollgruppen mit dem Lösungsmittel und mit dem Wasser sind in besonderer Weise zu behandeln (s. u.). | | Besondere Bedingungen für statische Prüfsysteme | Repräsentative chemische Analysen vor und nach der Erneuerung sind im Bericht zu vermerken. | | Unmittelbar vor der Erneuerung wird der Ammoniakgehalt gemessen. | | Unmittelbar vor der Erneuerung sind alle in Anlage 1 Tabelle 1 genannten Parameter für die Wasserqualität zu messen. | | Erneuerungen sind spätestens nach 72 Stunden vorzunehmen. | | Angemessenes Fütterungsprotokoll (50 % der täglichen Menge von handelsüblichem Larvenfutter (z.B. Sera Micron ®)) |
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Validität des Tests | 45. | Ein Test kann dann als annehmbar/gültig betrachtet werden, wenn die folgenden Anforderungen erfüllt sind: | Ein valider Test ergibt hinsichtlich der Aktivität der Schilddrüse einen negativen Befund:| (1) | Bei einer Konzentration der Prüfchemikalie (und in den Kontrollen) darf die Mortalität höchstens bei 10 % liegen. In allen Replikaten muss sich die Mortalität auf drei Larven beschränken; ansonsten ist das Replikat als beeinträchtigt zu betrachten. |
| (2) | Für die Analysen müssen mindestens zwei Konzentrationen (sowie die betreffenden vier nicht beeinträchtigten Replikate) zur Verfügung stehen. |
| (3) | Für die Analysen müssen zwei Konzentrationen ohne offensichtlich toxische Wirkung verfügbar sein. |
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| Ein valider Test ergibt hinsichtlich der Aktivität der Schilddrüse einen positiven Befund:| (4) | In der Kontrollgruppe muss sich die Mortalität auf zwei Larven/Replikate beschränken. |
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Entscheidungslogik des AMA | 46. | ⁴²⁵⁶Die Entscheidungslogik wurde für den AMA entwickelt, um eine logische Struktur für die Durchführung des Bioassays und für die Interpretation der Ergebnisse bereitzustellen (siehe Flussdiagramm in Abbildung 3). ⁴²⁵⁷In der Entscheidungslogik werden im Wesentlichen die Endpunkte gewichtet. ⁴²⁵⁸Eine beschleunigte Entwicklung, eine asynchrone Entwicklung und die histopathologische Untersuchung der Schilddrüse werden stark gewichtet, während eine verzögerte Entwicklung, die Kopf-Rumpf-Länge und die Feuchtmasse als Parameter, die potentiell durch die Toxizität des Prüfstoffs beeinträchtigt werden könnten, weniger schwer gewichtet werden.Abbildung 3
Entscheidungslogik des Amphibien-Metamorphose-Assays
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Beschleunigte Entwicklung (anhand der Entwicklungsstadien sowie aufgrund der Kopf-Rumpf-Länge und der Hinterbeinlänge zu ermitteln) | 47. | ⁴²⁵⁹Eine beschleunigte Entwicklung ist ausschließlich infolge von Effekten bekannt, die von Schilddrüsenhormonen verursacht werden. ⁴²⁶⁰Sie kann bei peripheren Geweben auf eine unmittelbare Wechselwirkung mit dem Schilddrüsenhormonrezeptor (z. B. mit T4) oder auf Effekte zurückzuführen sein, die eine Änderung des Spiegels der zirkulierenden Schilddrüsenhormone nach sich ziehen können. ⁴²⁶¹In beiden Fällen wird dies als hinreichendes Anzeichen dafür betrachtet, dass die Chemikalie auf die Schilddrüse wirkt. ⁴²⁶²Zur Feststellung einer beschleunigten Entwicklung bestehen zwei Möglichkeiten. ⁴²⁶³Erstens kann das allgemeine Entwicklungsstadium nach dem von Nieuwkoop und Faber (8) beschriebenen Standardansatz bewertet werden. ⁴²⁶⁴Zweitens können spezifische morphologische Merkmale quantifiziert werden z. B. die Hinterbeinlänge an den Tagen 7 und 21, die mit einer agonistischen Wirkung auf den Schilddrüsenhormonrezeptor in Zusammenhang steht. ⁴²⁶⁵Wenn bei dem Test eine statistisch signifikant beschleunigte Entwicklung oder Veränderung der Länge der Hinterbeine festzustellen ist, ist dies ein Hinweis darauf, dass die Chemikalie auf die Schilddrüse wirkt. |
| 48. | Die Bewertung der Testtiere auf eine im Vergleich zur Kontrollpopulation beschleunigte Entwicklung beruht auf den Ergebnissen statistischer Analysen der folgenden vier Endpunkte:- —
- Hinterbeinlänge (normalisiert auf die KRL) an Tag 7 des Tests
- —
- Hinterbeinlänge (normalisiert auf die KRL) an Tag 21 des Tests
- —
- Entwicklungsstadium an Tag 7 des Tests
- —
- Entwicklungsstadium an Tag 21 des Tests
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| 49. | ⁴²⁶⁶Die statistischen Analysen der Hinterbeinlängen sind anhand der Länge des linken Hinterbeins vorzunehmen. ⁴²⁶⁷Die Hinterbeinlänge wird entsprechend dem Verhältnis der Hinterbeinlänge zur Kopf-Rumpf-Länge eines Exemplars normalisiert. ⁴²⁶⁸Danach wird der Mittelwert der normalisierten Werte der einzelnen Konzentrationen verglichen: Anzeichen für eine beschleunigte Entwicklung ist ein signifikanter Anstieg der mittleren Hinterbeinlänge (normalisiert) in der Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe an Tag 7 und/oder Tag 21 des Tests (siehe Anlage 3). |
| 50. | ⁴²⁶⁹Die statistischen Analysen der Entwicklungsstadien werden vorgenommen, nachdem die Entwicklungsstadien aufgrund der von Nieuwkoop und Faber beschriebenen morphologischen Kriterien (8) bestimmt wurden. ⁴²⁷⁰Eine beschleunigte Entwicklung ist dann gegeben, wenn an Tag 7 und/oder Tag 21 des Tests bei der multiquantalen Analyse ein signifikanter Anstieg der Werte eines Entwicklungsstadiums in einer Behandlungsgruppe festgestellt wird. |
| 51. | ⁴²⁷¹Beim AMA wird eine signifikante Wirkung auf einen der vier oben genannten Endpunkte als hinreichender Beleg für eine beschleunigte Entwicklung betrachtet. ⁴²⁷²Signifikante Wirkungen auf die Hinterbeinlänge zu einem bestimmten Zeitpunkt müssen also nicht durch signifikante Wirkungen auf die Hinterbeinlänge zu anderen Zeitpunkten oder auf das Entwicklungsstadium zum betreffenden Zeitpunkt bestätigt werden. ⁴²⁷³Im Umkehrschluss bedeutet das, dass signifikante Wirkungen auf das Entwicklungsstadium zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht durch signifikante Wirkungen auf das Entwicklungsstadium zu anderen Zeitpunkten oder durch signifikante Wirkungen auf die Hinterbeinlänge zum betreffenden Zeitpunkt bestätigt werden müssen. ⁴²⁷⁴Die Anzeichen für eine beschleunigte Entwicklung gewinnen jedoch an Bedeutung, wenn signifikante Wirkungen für mehrere Endpunkte festgestellt werden. |
Asynchrone Entwicklung (ermittelt anhand von Kriterien zur Bestimmung des Entwicklungsstadiums) | 52. | ⁴²⁷⁵Eine asynchrone Entwicklung ist durch die Störung des relativen Zeitpunkts der Morphogenese oder der Entwicklung unterschiedlicher Gewebe bei einer einzelnen Larve gekennzeichnet. ⁴²⁷⁶Wenn das Entwicklungsstadium eines Organismus aufgrund der für ein bestimmtes Stadium als typisch betrachteten morphologischen Endpunkte nicht bestimmt werden kann, durchlaufen die Gewebe eine asynchrone Metamorphose. ⁴²⁷⁷Eine asynchrone Entwicklung ist ein Anzeichen für eine thyroidale Aktivität. ⁴²⁷⁸Die einzigen bekannten Wirkungen, die eine asynchrone Entwicklung verursachen können, sind Wirkungen von Chemikalien auf periphere Schilddrüsenhormone und/oder auf den Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone bei der Ausbildung von Geweben, wie dies beispielsweise bei Deiodinaseinhibitoren zu beobachten ist. |
| 53. | Die Bewertung von Testtieren hinsichtlich einer asynchronen Entwicklung im Vergleich zur Kontrollpopulation beruht auf einer groben morphologischen Beurteilung der Testtiere an Tag 7 und an Tag 21 des Tests. |
| 54. | ⁴²⁸⁰Die Beschreibung der normalen Entwicklung von Xenopus laevis durch Nieuwkoop und Faber (8) bietet den Rahmen für die Bestimmung der Abfolge einer normalen Gewebebildung. ⁴²⁸¹Der Begriff ‚asynchrone Entwicklung‘ bezieht sich speziell auf die Abweichungen von der allgemeinen morphologischen Entwicklung der Larven, die die Bestimmung eines Entwicklungsstadiums nach den Kriterien von Nieuwkoop und Faber (8) unmöglich machen, weil wesentliche morphologische Merkmale unterschiedlichen Stadien zuzuordnen sind. |
| 55. | ⁴²⁸²Entsprechend dem Wortsinn des Begriffs der ‚asynchronen Entwicklung‘ sind nur die Fälle zu berücksichtigen, in denen hinsichtlich der Bildung bestimmter Gewebe im Vergleich zu anderen Geweben Unterschiede festzustellen sind. ⁴²⁸³Einige klassische Phänotypen sind die verzögerte oder fehlende Entwicklung der vorderen Extremitäten trotz normaler oder sogar rascher voranschreitender Ausprägung der Hinterbeine und des Schwanzgewebes oder die vorzeitige Resorption der Kiemen gemessen an der Morphogenese der Hinterbeine und der Resorption des Schwanzes. ⁴²⁸⁴Die Entwicklung eines Tieres wird dann als asynchron bewertet, wenn ein Tier keinem bestimmten Stadium zugeordnet werden kann, weil wesentliche Kriterien für ein Entwicklungsstadium nach Niewkoop und Faber (8) mehrheitlich nicht erfüllt sind oder weil die Ausprägung eines oder mehrerer wesentlicher Merkmale erheblich verzögert oder beschleunigt ist (z. B. Schwanz vollständig resorbiert, Vorderbeine aber noch nicht durchgebrochen). ⁴²⁸⁵Bei der entsprechenden qualitativen Beurteilung sind sämtliche von Nieuwkoop und Faber (8) genannten Merkmale zu berücksichtigen. ⁴²⁸⁶Die Entwicklungsstadien der verschiedenen wesentlichen beobachteten Merkmale der Tiere brauchen allerdings nicht protokolliert zu werden. ⁴²⁸⁷Wenn bei einem Tier eine asynchrone Entwicklung festgestellt wurde, werden die Tiere keinem Entwicklungsstadium nach Nieuwkoop und Faber (8) zugeordnet. |
| 56. | ⁴²⁸⁸Ein entscheidendes Kriterium für die Einstufung anomaler morphologischer Entwicklungen als ‚asynchrone Entwicklung‘ ist eine Störung des relativen zeitlichen Verlaufs des Gewebeumbaus und der Morphogenese von Geweben ohne offensichtliche Anomalie der Morphologie der betreffenden Gewebe an sich. ⁴²⁸⁹Eine erhebliche morphologische Anomalie ist beispielsweise gegeben, wenn die Morphogenese der Hinterbeine gemessen an der Entwicklung anderer Gewebe das Kriterium der ‚asynchronen Entwicklung‘ erfüllt. ⁴²⁹⁰Fehlende Hinterbeine, anomale Fehlentwicklung von Fingern oder Zehen (z. B. Ektrodaktylie oder Polydaktilie) oder sonstige offensichtliche Fehlbildungen der Extremitäten sind hingegen nicht als ‚asynchrone Entwicklung‘ zu bewerten. |
| 57. | In diesem Zusammenhang gelten etwa die Morphogenese der Hinter- und der Vorderbeine, der Durchbruch der Vorderbeine, das Stadium der Schwanzresorption (sowie insbesondere die Resorption der Schwanzflosse) und die Morphologie des Kopfes (z. B. die Größe der Kiemen und das Stadium der Kiemenresorption, die Morphologie des Unterkiefers und das Hervortreten des Meckelschen Knorpels) als wesentliche morphologische Merkmale, die hinsichtlich der zeitlich abgestimmten Metamorphose bewertet werden müssen. |
| 58. | ⁴²⁹²Je nach Art der chemischen Wirkung können unterschiedliche morphologische Phänotypen auftreten. ⁴²⁹³Klassische Phänotypen sind die verzögerte oder fehlende Entwicklung der vorderen Extremitäten trotz normaler oder sogar rascher voranschreitender Entwicklung der Hinterbeine und des Schwanzgewebes oder die Resorption der Kiemen vor der Entwicklung der Hinterbeine und dem Umbau des Schwanzes. |
Histopathologie | 59. | ⁴²⁹⁴Wenn eine Chemikalie keine offensichtlich toxische Wirkung verursacht, die Entwicklung nicht beschleunigt und nicht zu asynchroner Entwicklung führt, wird die Histopathologie der Schilddrüsen gemäß dem betreffenden Leitfaden (9) bewertet. ⁴²⁹⁵Eine verzögerte Entwicklung ohne feststellbare toxische Wirkung ist ein starker Indikator für eine anti-thyroidale Wirkung; die Analyse aufgrund der Entwicklungsstadien ist jedoch weniger empfindlich und hat eine geringere diagnostische Aussagekraft als die histopathologische Analyse der Schilddrüse. ⁴²⁹⁶In diesem Fall müssen daher die Schilddrüsen histopathologisch untersucht werden. ⁴²⁹⁷Effekte auf die Histologie der Schilddrüse wurden auch ohne begleitende Effekte auf die Entwicklung nachgewiesen. ⁴²⁹⁸Wenn in histopathologischen Untersuchungen der Schilddrüse Veränderungen festgestellt werden, ist davon auszugehen, dass die betreffende Chemikalie eine thyroidale Wirkung hat. ⁴²⁹⁹Werden keine Entwicklungsverzögerungen oder histologische Läsionen an den Schilddrüsen festgestellt, wird davon ausgegangen, dass die Chemikalie nicht auf die Schilddrüse wirkt. ⁴³⁰⁰Die Schilddrüse wird nämlich durch TSH gesteuert, und alle Chemikalien, die auf zirkulierende Schilddrüsenhormone so wirken, dass sie die TSH-Sekretion verändern, führen zu histopathologischen Veränderungen der Schilddrüse. ⁴³⁰¹Das zirkulierende Schilddrüsenhormon kann auf verschiedene Weise und durch unterschiedliche Mechanismen verändert werden. ⁴³⁰²Der Hormonspiegel der Schilddrüse ist zwar ein Anzeichen für eine Wirkung auf die Schilddrüse; er ist jedoch nicht hinreichend, um festzustellen, auf welche Weise oder über welchen Mechanismus die betreffende Reaktion erfolgt. |
| 60. | Da dieser Endpunkt nicht ohne weiteres mit grundlegenden statistischen Ansätzen analysiert werden kann, ist eine auf die Exposition gegenüber einer Chemikalie zurückzuführende Wirkung durch einen sachverständigen Pathologen festzustellen. |
Verzögerte Entwicklung (anhand der Entwicklungsstadien sowie anhand von Hinterbeinlänge, Körpergewicht und Kopf-Rumpf-Länge zu ermitteln) | 61. | ⁴³⁰⁴Eine verzögerte Entwicklung kann durch anti-tyroidaleMechanismen und durch indirekte Toxizität bedingt sein. ⁴³⁰⁵Geringe Entwicklungsverzögerungen in Verbindung mit offensichtlichen Anzeichen für eine toxische Wirkung lassen auf eine unspezifische toxische Wirkung schließen. ⁴³⁰⁶Die Bewertung einer nicht auf die Schilddrüse wirkenden Toxizität ist ein wesentlicher Bestandteil des Tests, der dazu dienen soll, die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse zu reduzieren. ⁴³⁰⁷Übermäßige Mortalität ist ein offensichtliches Anzeichen für anderweitige toxische Mechanismen. ⁴³⁰⁸Auch geringe Wachstumsbeeinträchtigungen, die z. B. aufgrund der Feuchtmasse und/oder der Kopf-Rumpf-Länge festgestellt werden, lassen auf eine nicht auf die Schilddrüse wirkende Toxizität schließen. ⁴³⁰⁹Ein offensichtlich stärkeres Wachstum ist häufig bei Chemikalien zu beobachten, die die normale Entwicklung beeinträchtigen. ⁴³¹⁰Entsprechend deutet das Vorkommen größerer Tiere nicht zwangsläufig auf eine nicht auf die Schilddrüse wirkende Toxizität hin. ⁴³¹¹Das Wachstum sollte jedoch nie der einzige Parameter sein, auf den sich die Feststellung einer Toxizität für die Schilddrüse stützt. ⁴³¹²Um eine Wirkung auf die Schilddrüse konstatieren zu können, sollten zusätzlich zum Wachstum auch das Entwicklungsstadium und die Ergebnisse einer histopathologischen Untersuchung der Schilddrüse herangezogen werden. ⁴³¹³Bei der Feststellung einer offensichtlichen Toxizität sind auch andere Endpunkte zu berücksichtigen, u. a. Ödeme, hämorrhagische Läsionen, Lethargie, verringerte Nahrungsaufnahme und erratisches/verändertes Schwimmverhalten. ⁴³¹⁴Wenn bei allen Prüfkonzentrationen Anzeichen einer offensichtlichen Toxizität festgestellt werden, ist die Prüfchemikalie zunächst einer erneuten Bewertung bei niedrigeren Konzentrationen zu unterziehen, bevor entschieden wird, ob die Chemikalie potenziell auf die Schilddrüse wirkt oder keine Wirkung auf die Schilddrüse hat. |
| 62. | ⁴³¹⁵Statistisch signifikante Entwicklungsverzögerungen ohne sonstige Anzeichen einer offensichtlichen Toxizität deuten auf eine Wirkung der jeweiligen Chemikalie auf die Schilddrüse hin (als Antagonist). ⁴³¹⁶Wenn keine starken statistischen Abhängigkeiten bestehen, kann dieser Befund durch Ergebnisse einer histopathologischen Untersuchung der Schilddrüse bestätigt werden. |
Statistische Analysen | 63. | ⁴³¹⁷Statistische Datenanalysen sollten nach den Verfahren im Dokument ‚Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application‘ (11) durchgeführt werden. ⁴³¹⁸Für alle kontinuierlichen quantitativen Endpunkte (Hinterbeinlänge, Kopf-Rumpf-Länge, Feuchtmasse), die mit einer monotonen Dosis-Wirkungs-Beziehung einhergehen, ist der Jonckheere-Terpstra-Test (Step-down) vorzunehmen, um eine signifikante Wirkung infolge der Exposition feststellen zu können. |
| 64. | ⁴³¹⁹Wenn kontinuierliche Endpunkte nicht im Einklang mit einer monotonen Dosis-Wirkungs-Beziehung stehen, sind die Daten auf Normalverteilung (vorzugsweise mit dem Shapiro-Wilk- oder dem Anderson-Darling-Test) und auf Varianzhomogenität (vorzugsweise mit dem Levene-Test) zu prüfen. ⁴³²⁰Beide Tests werden mit den Residuen einer ANOVA durchgeführt. ⁴³²¹Anstelle der Durchführung dieser förmlichen Tests auf Normalverteilung und Varianzhomogenität kann auch fachliches Ermessen angewendet werden; Tests sind jedoch zu bevorzugen. ⁴³²²Wenn eine Abweichung von der Normalverteilung oder eine Varianzheterogenität festgestellt wird, ist eine normalisierende bzw. die Varianz stabilisierende Transformation zu versuchen. ⁴³²³Ergibt sich (vielleicht nach einer Transformation) eine Normalverteilung mit homogener Varianz, wird mit dem Dunnett-Test eine signifikante Wirkung festgestellt. ⁴³²⁴Wenn (unter Umständen nach einer Transformation) eine Normalverteilung mit heterogener Varianz festgestellt wird, ist mit dem Tamhane/Dunnett-Test, dem T3-Test oder dem Mann-Whitney-Wilcoxon-U-Test eine signifikante Wirkung zu ermitteln. ⁴³²⁵Führt die Transformation nicht zu einer Normalverteilung, ist nach einer Anpassung der p-Werte nach Bonferroni-Holm ebenfalls mit dem Mann-Whitney-Wilcoxon-U-Test eine signifikante Wirkung festzustellen. ⁴³²⁶Der Dunnett-Test wird unabhängig von einem F-Test im Rahmen einer ANOVA durchgeführt, und der Mann-Whitney-Test erfolgt unabhängig von einem allgemeinen Kruskall-Wallis-Test. |
| 65. | Auch wenn eine signifikante Mortalität nicht erwartet wird, ist die Mortalität doch durch einen Cochran-Armitage-Test im Step-down-Verfahren zu prüfen, bei dem die Daten mit der monotonen Dosis-Wirkungs-Beziehung übereinstimmen; ansonsten ist ein Exakter Test nach Fisher mit einer Anpassung nach Bonferroni-Holm vorzunehmen. |
| 66. | ⁴³²⁸Eine signifikante Wirkung der Exposition auf die Entwicklungsstadien wird mit dem Jonckheere-Terpstra-Test im Step-down-Verfahren bezogen auf die Mediane der Replikate ermittelt. ⁴³²⁹Alternativ und vorzugsweise sollte die Wirkung mit einem multiquantalen Jonckheere-Test vom 20. ⁴³³⁰bis zum 80. ⁴³³¹Perzentil festgestellt werden, da so Änderungen des Verteilungsprofils berücksichtigt werden können. |
| 67. | ⁴³³²Bei der Analyse ist von den Replikaten auszugehen; beim Jonckheere-Terpstra- und beim Mann-Whitney-U-Test besteht das Datenmaterial aus den Medianen der Replikate und beim Dunnett-Test aus den Mittelwerten der Replikate. ⁴³³³Eine monotone Dosis-Wirkungs-Beziehung kann aus den Mittelwerten oder Medianen der Replikate und der Prüfkonzentrationen nach Augenschein oder durch förmliche Tests (s. o.) festgestellt werden (11). ⁴³³⁴Wenn weniger als fünf Replikate pro Prüfkonzentration oder pro Kontrolle verfügbar sind, sollten der Jonckheere-Terpstra- und der Mann-Whitney-Tests möglichst exakt durchgeführt werden. ⁴³³⁵Bei allen Tests wird eine Signifikanz von 0,05 als statistisch relevant betrachtet. |
| 68. | Abbildung 4 zeigt ein Flussdiagramm zur Durchführung statistischer Prüfungen bei kontinuierlichen Daten.Abbildung 4
Flussdiagramm statistischer Verfahren für kontinuierliche Daten zur Dosis-Wirkung-Beziehung
 |
Besondere Erwägungen zur DatenanalyseBehandlung von Konzentrationen mit offensichtlich toxischer Wirkung
| 69. | ⁴³³⁷Um festzustellen, ob ein Replikat oder eine Prüfkonzentration insgesamt offensichtlich toxisch wirkt und von der Analyse ausgeschlossen werden muss, sind mehrere Faktoren zu berücksichtigen. ⁴³³⁸Eine offensichtliche Toxizität ist bei > 2 toten Larven in einem Replikat gegeben, wenn die Mortalität nicht durch einen technischen Fehler, sondern nur durch die toxische Wirkung zu erklären ist. ⁴³³⁹Andere Anzeichen einer offensichtlichen Toxizität sind Hämorrhagien, Verhaltensauffälligkeiten, anomales Schwimmverhalten, Anorexie und sonstige klinische Anzeichen einer Erkrankung. ⁴³⁴⁰Bei Anzeichen einer subletalen Toxizität können qualitative Untersuchungen erforderlich sein; in diesen Fällen ist grundsätzlich ein Vergleich mit der Kontrollgruppe mit sauberem Wasser vorzunehmen. |
Lösungsmittelkontrollen | 70. | ⁴³⁴¹Die Verwendung eines Lösungsmittels ist nur als letzte Möglichkeit in Betracht zu ziehen, wenn alle sonstigen Verfahren zur Applikation der betreffenden Chemikalie geprüft wurden. ⁴³⁴²Wenn ein Lösungsmittel verwendet wird, ist auch eine Kontrolle mit sauberem Wasser zu prüfen. ⁴³⁴³Bei Ende des Tests werden die potenziellen Wirkungen des Lösungsmittels bestimmt. ⁴³⁴⁴Dazu wird ein statistischer Vergleich der Kontrollgruppe mit dem Lösungsmittel und der Kontrollgruppe mit dem sauberen Wasser vorgenommen. ⁴³⁴⁵Die wichtigsten Endpunkte für diese Analyse sind das Entwicklungsstadium, die Kopf-Rumpf-Länge und die Feuchtmasse, da diese Parameter auch durch nicht auf die Schilddrüse wirkende Toxizität beeinträchtigt werden können. ⁴³⁴⁶Wenn bei diesen Endpunkten statistisch signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe mit dem sauberen Wasser und der Kontrollgruppe mit dem Lösungsmittel festgestellt werden, sind die in der Studie verwendeten Endpunkte für die Reaktionsparameter anhand der Kontrolle mit dem sauberen Wasser festzulegen. ⁴³⁴⁷Besteht zwischen der Kontrolle mit dem sauberen Wasser und der Lösungsmittelkontrolle bei keiner der gemessenen Reaktionsvariablen ein statistisch signifikanter Unterschied, werden die Endpunkte für die Reaktionsparameter aus den gepoolten Werten der Kontrollen mit dem Verdünnungswasser und mit dem Lösungsmittel ermittelt. |
Behandlungsgruppen mit Larven mindestens im Entwicklungsstadium 60 | 71. | ⁴³⁴⁸Ab Stadium 60 verringern sich Größe und Gewicht der Larven, weil Gewebe resorbiert wird und der absolute Wassergehalt zurückgeht. ⁴³⁴⁹Messungen der Feuchtmasse und der Kopf-Rumpf-Länge können in statistischen Analysen zur Feststellung unterschiedlicher Wachstumsentwicklungen nicht in geeigneter Weise verwendet werden. ⁴³⁵⁰Daher sollten Daten zur Feuchtmasse und zur Länge von Tieren oberhalb des NF-Entwicklungsstadiums 60 ausgeklammert und bei der Analyse der Mittelwerte oder der Mediane von Replikaten nicht verwendet werden. ⁴³⁵¹Zur Analyse dieser wachstumsbezogenen Parameter können zwei andere Ansätze verfolgt werden. |
| 72. | ⁴³⁵²Bei einem Ansatz werden in statistischen Analysen der Feuchtmasse und/oder der KRL ausschließlich Larven mit Entwicklungsstadien ≤ 60 berücksichtigt. ⁴³⁵³Dieser Ansatz dürfte hinreichend belastbare Informationen über den Umfang möglicher Wachstumseffekte ergeben, wenn nur wenige Testtiere aus den Analysen herausgenommen werden (≤ 20 %). ⁴³⁵⁴Hat eine größere Anzahl an Larven (≥ 20 %) in mindestens einer Nominalkonzentration der Prüfchemikalie ein höheres Entwicklungsstadium als Stadium 60 erreicht, ist für alle Larven eine Zwei-Faktor-ANOVA mit geschachtelter Varianzstruktur vorzunehmen, um die Auswirkungen der jeweiligen Chemikalie auf das Wachstum der Larven zu bewerten; dabei ist zu berücksichtigen, wie sich die Entwicklung in späteren Stadien auf die Wachstumsentwicklung auswirkt. ⁴³⁵⁵Anlage 3 enthält Leitlinien zur ANOVA mit den beiden Faktoren Gewicht und Länge. |
LITERATUR | (1) | OECD (2004) Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay for the detection of thyroid active substances: Phase 1 — Optimisation of the Test Protocol. ⁴³⁵⁷Environmental Health and Safety Publications. ⁴³⁵⁸Series on Testing and Assessment. No. 77, Paris. |
| (2) | OECD (2007) Final Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay: Phase 2 — Multi-chemical Interlaboratory Study. ⁴³⁶⁰Environmental Health and Safety Publications. ⁴³⁶¹Series on Testing and Assessment. No. 76. Paris. |
| (3) | OECD (2008) Report of the Validation Peer Review for the Amphibian Metamorphosis Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. ⁴³⁶³Environmental Health and Safety Publications. ⁴³⁶⁴Series on Testing and Assessment. No. 92. Paris. |
| (4) | OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. ⁴³⁶⁶Environmental Health and Safety Publications. ⁴³⁶⁷Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris. |
| (5) | ASTM (2002) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. American Society for Testing and Materials, ASTM E729-96(2002), Philadelphia, PA. |
| (6) | ASTM (2004) Standard Guide for Conducting the Frog Embryo Teratogenesis Assay — Xenopus (FETAX). E 1439-98 |
| (7) | Kahl, M.D., Russom, C.L., DeFoe, D.L. und Hammermeister, D.E. (1999) Saturation units for use in aquatic bioassays. Chemosphere 39, S. 539-551. |
| (8) | Nieuwkoop, P.D., und Faber, J. ⁴³⁷⁴(1994) Normal Table of Xenopus laevis. ⁴³⁷⁵Garland Publishing, New York. |
| (9) | OECD (2007) Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology. ⁴³⁷⁷Environmental Health and Safety Publications. ⁴³⁷⁸Series on Testing and Assessment. No. 82. Paris. |
| (10) | Dodd, M.H.I., und Dodd, J.M. (1976) Physiology of Amphibia. Lofts, B. (Hrsg,), Academic Press, New York, S. 467-599 |
| (11) | OECD (2006) Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 54. Paris |
| (12) | Hutchinson TH, Shillabeer N, Winter MJ, Pickford DB, 2006. ⁴³⁸²Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. ⁴³⁸³Aquatic Toxicology, 76; S. 69–92. |
Anlage 1Tabelle 1
Versuchsbedingungen des 21-Tage-Amphibien-Metamorphose-Assay (21-Tage-AMA)
| Testtier | Xenopus-laevis-Larven | | Ausgangsstadium der Larven | Nieuwkoop und Faber, Stadium 51 | | Expositionsdauer | 21 Tage | | Kriterien für die Auswahl der Larven | Entwicklungsstadium und Gesamtlänge (optional) | | Prüfkonzentrationen | Mindestens 3 Konzentrationen, verteilt über etwa eine Größenordnung | | Expositionsprotokoll | Durchfluss (vorzugsweise) und/oder statische Erneuerung | | Durchfluss des Prüfsystems | 25 ml/min (vollständiger Austausch etwa nach 2,7 h) | | Primäre Endpunkte / Erfassungstage | Mortalität | Täglich | | Entwicklungsstadium | D 7 und 21 | | Länge der Hinterbeine | D 7 und 21 | | Kopf-Rumpf-Länge | D 7 und 21 | | Feuchtmasse der Larven | D 7 und 21 | | Histologie der Schilddrüse | D 21 | | Verdünnungswasser / Laborkontrolle | dechloriniertes Leitungswasser (mit Aktivkohle gefiltert) oder entsprechendes Laborwasser | | Besatzdichte | 20 Larven / Prüfbecken (5 / l) | | Testlösung / Prüfbecken | 4-10 l (mindestens 10-15 cm Wassertiefe) / Glas- oder Edelstahlbecken (z. B. 22,5 cm × 14 cm × 16,5 cm) | | Replikation | 4 Replikatprüfbecken / Prüfkonzentration und Kontrolle | | Annehmbare Mortalität in den Kontrollen | ≤ 10 % pro Replikatprüfbecken | | Fixierung der Schilddrüse | Anzahl fixierter Tiere | Alle Larven (zunächst werden 5 pro Replikat bewertet) | | Region | Kopf oder gesamter Körper | | Fixierlösung | Davidson-Fixierlösung | | Fütterung | Futter | Sera Micron® oder gleichwertig | | Menge / Häufigkeit | Zum Fütterungsprotokoll mit Sera Micron® siehe Tabelle 1. | | Beleuchtung | Photoperiode | 12 h Licht: 12 h Dunkelheit | | Intensität | 600-2 000 lx (gemessen an der Wasseroberfläche) | | Wassertemperatur | 22 ± 1 °C | | pH-Wert | 6,5-8,5 | | Konzentration des gelösten Sauerstoffs | > 3,5 mg/l (> 40 % Luftsättigung) | | Stichprobenahme zur chemischen Analyse | Einmal pro Woche (4 Probenahmen / Test) |
Anlage 2Berichttabellen für Rohdaten und Zusammenfassung
Tabelle 1
Allgemeine Informationen zur Prüfchemikalie
| Chemische Informationen | | Prüfchemikalie, Konzentrationseinheiten und Konzentrationen eingeben | | Prüfchemikalie: | | | | Konzentrationseinheiten: | | | | Konzentration 1 | | | | Konzentration 2 | | | | Konzentration 3 | | | | Konzentration 4 | | | | | | | | Datum (Tag 0): | | Datumsformat: MM/TT/JJ | | Datum (Tag 7): | | Datumsformat: MM/TT/JJ | | Datum (Tag 21): | | Datumsformat: MM/TT/JJ |
Tabelle 2
Rohdatenbogen für die Tage 7 und 21
TAG XDATUM 00/00/00
| | Konzentration | Behdlg. Nr. | Replikat. Nr. | Nr. des Individuums | ID-Nummer | Entwicklungsstadium | Kopf-Rumpf-Länge (mm) | Hinterbeinlänge (mm) | Feuchtmasse des gesamten Organismus (mg) | | ZEILE | BEHANDLG. | BEHDLG. Nr. | Replikat. | INDIV. | ID-Nr. | STADIUM | KÖRPERL. | HBL | GEW. | | 1 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 2 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 3 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 4 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 5 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 6 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 7 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 8 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 9 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 10 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 11 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 12 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 13 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 14 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 15 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 16 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 17 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 18 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 19 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 20 | 0,00 | 1 | | | | | | | | | 21 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 22 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 23 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 24 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 25 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 26 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 27 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 28 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 29 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 30 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 31 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 32 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 33 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 34 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 35 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 36 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 37 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 38 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 39 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 40 | 0,00 | 2 | | | | | | | | | 41 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 42 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 43 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 44 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 45 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 46 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 47 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 48 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 49 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 50 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 51 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 52 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 53 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 54 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 55 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 56 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 57 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 58 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 59 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 60 | 0,00 | 3 | | | | | | | | | 61 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 62 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 63 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 64 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 65 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 66 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 67 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 68 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 69 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 70 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 71 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 72 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 73 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 74 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 75 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 76 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 77 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 78 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 79 | 0,00 | 4 | | | | | | | | | 80 | 0,00 | 4 | | | | | | | |
Tabelle 3
Berechnete Summen der Endpunktdaten der Tage 7 und 21
| | Entwicklungsstadium | KRL (mm) | Hinterbeinlänge (mm) | Gewicht (mg) | | Konzen-tration | Replikat | min | Median | max | Mittelwert | Standart-abw. | Mittelwert | Standart-abw. | Mittelwert | Standart-abw. | | 1 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 1 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 1 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 1 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 2 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 2 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 2 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 2 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 3 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 3 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 3 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 3 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 4 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 4 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 4 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | 4 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | | Hinweis: Die Werte in den Zellen werden anhand der Dateneingaben in Tabelle 2 berechnet. |
Tabelle 4
Tägliche Mortalität
| Testtag | Datum | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | | 0 | 00/00/00 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 1 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 5 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 6 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 7 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 9 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 10 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 11 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 12 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 13 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 14 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 17 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 18 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 19 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 20 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Anz. Replikate | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | | Anz. Behandl. | 0 | | | | 0 | | | | 0 | | | | 0 | | | | | Hinweis: Die Werte in den Zellen werden anhand der Dateneingaben in Tabelle 1 berechnet. |
Tabelle 5Kriterien für die Wasserqualität
Expositionssystem (Durchfluss/statische Erneuerung):
Temperatur:
Lichtintensität:
Hell-Dunkel-Zyklus:
Futter:
Fütterungsprotokoll:
pH-Wert des Wassers:
Jodkonzentration des Testwassers:
Tabelle 6
Zusammenfassung chemische Daten
| Name der Chemikalie: | | CAS-Nr.: | | Testtag | Datum | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | | 0 | 00/00/00 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 1 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 5 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 6 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 7 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 9 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 10 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 11 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 12 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 13 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 14 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 16 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 17 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 18 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 19 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 20 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | #Value! | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Hinweis: Die Werte in den Zellen werden anhand der Dateneingaben in Tabelle 1 berechnet. |
Tabelle 7Histopathologische Berichttabellen — Kernkriterien
| Datum: | Chemikalie: | | | Pathologie: | | Hypertrophie der Schilddrüse | Atrophie der Schilddrüse | Hypertrophie der follikulären Zellen | Hyperplasie der follikulären Zellen | | Hypertrophie der Schilddrüse | Atrophie der Schilddrüse | Hypertrophie der follikulären Zellen | Hyperplasie der follikulären Zellen | | Kontrolle Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Kontrolle Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Summe: | | | | | Summe: | | | | |
| Hypertrophie der Schilddrüse | Atrophie der Schilddrüse | Hypertrophie der follikulären Zellen | Hyperplasie der follikulären Zellen | | | Hypertrophie der Schilddrüse | Atrophie der Schilddrüse | Hypertrophie der follikulären Zellen | Hyperplasie der follikulären Zellen | | Dosis Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Summe: | | | | | Summe: | | | | |
Tabelle 8Weitere histopathologische Kriterien
| Datum: | Chemikalie: | | | Pathologie: | | | | | | | | Zunahme des Follikellumens | Verringerung des Follikellumens | Zunahme des Follikellumens | Verringerung des Follikellumens | | Kontrolle Tier-ID — Replikat 1 | | | | Dosis Tier ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Kontrolle Tier-ID — Replikat 2 | | | | Dosis Tier ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Summe: | | | Summe: | | |
| Zunahme des Follikellumens | Verringerung des Follikellumens | | | Zunahme des Follikellumens | Verringerung des Follikellumens | | Dosis Tier-ID — Replikat 1 | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Summe: | | | Summe: | | |
Tabelle 9Ausformulierte Beschreibungen der histopathologischen Ergebnisse
| Datum: | | Chemikalie: | | Pathologie: | | Ausformulierte Beschreibung | | Kontrolle Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | Kontrolle Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | | | | Kontrolle Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 1 | | | | | | | | | | | | Dosis Tier-ID — Replikat 2 | | | | | | | | | | |
Tabelle 10
Zusammenfassende Übersicht Tag x (7 oder 21) des AMA
| | Kontrolle | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | | Endpunkt | Replikat | Mittelwert | SD | CV | N | Mittelwert | SD | CV | N | p-Wert | Mittelwert | SD | CV | N | p-Wert | Mittelwert | SD | CV | N | p-Wert | Hinterbeinlänge(mm)
| 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mittelwert: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | KRL(mm)
| 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mittelwert: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Feuchtmasse(mg)
| 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mittelwert: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
Tabelle 11
Zusammenfassende Übersicht Tag x (7 oder 21) Daten zu Entwicklungsstadien im AMA
| | Kontrolle | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | | Replikat | Median | min | max | N | Median | min | max | N | p-Wert | Median | min | max | N | p-Wert | Median | min | max | Median | p-Wert | | Entwicklungsstadium | 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Mittelwert: | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
Anlage 3Alternative Gewichts- und Längenanalyse in späten Entwicklungsstadien bei > 20 % der Larven in einer oder mehreren Konzentrationen
Befindet sich eine größere Anzahl an Larven (≥ 20 %) in mindestens einer Nominalkonzentration der Prüfchemikalie in einem höheren Entwicklungsstadium als Stadium 60, ist für alle Larven eine Zwei-Faktor-ANOVA mit geschachtelter Varianzstruktur vorzunehmen, um die Auswirkungen der jeweiligen Chemikalie auf das Wachstum der Larven zu bewerten. Dabei ist zu berücksichtigen, wie sich die Entwicklung in späteren Stadien auf das Wachstum auswirkt.
⁴³⁹²Vorgeschlagen wird die Verwendung aller Daten; dabei ist jedoch der Effekt eines späten Entwicklungsstadiums zu berücksichtigen. ⁴³⁹³Die entsprechende Prüfung kann mit einer Zwei-Faktor-ANOVA mit verschachtelter Varianzstruktur vorgenommen werden. ⁴³⁹⁴Für ein Tier ist die Eingabe LateStage=‚Yes‘ zu definieren, wenn ein Tier mindestens das Entwicklungsstadium 61 erreicht. ⁴³⁹⁵Ansonsten ist LateStage=‚No‘ zu definieren. ⁴³⁹⁶Dann kann eine ANOVA mit zwei Faktoren (Concentration und LateStage) mit Rep(Conc) als Zufallsfaktor und mit dem Faktor Tadpole(Rep) als einem weiteren zufälligen Effekt vorgenommen werden. ⁴³⁹⁷Auch hier wird das Replikat als Analyseeinheit behandelt. ⁴³⁹⁸Es ergeben sich im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in einer gewichteten Analyse der Mittelwerte rep*latestage, gewichtet nach der Anzahl der Tiere pro Mittelwert. ⁴³⁹⁹Wenn die Daten die Anforderungen der ANOVA an die Normalverteilung oder die Varianzhomogenität nicht erfüllen, kann eine normalisierte Rangtransformation vorgenommen werden.
⁴⁴⁰⁰Zusätzlich zu den Standard-F-Tests auf die Effekte der Parameter Conc und LateStage sowie ihrer Wechselwirkungen im Rahmen der ANOVA kann der F-Test zur Ermittlung von Wechselwirkungen in zwei zusätzliche F-Tests ‚aufgespalten‘ werden: einen Test zur Ermittlung der durchschnittlichen Reaktionen über die verschiedenen Konzentrationen für LateStage=‚No‘ und einen weiteren für die mittleren Reaktionen über die verschiedenen Konzentrationen für LateStage=‚Yes‘. ⁴⁴⁰¹Weitere Vergleiche der Mittelwerte von Konzentrationen im Vergleich zu den Kontrollen werden jeweils für die verschiedenen Ausprägungen des Parameters LateStage vorgenommen. ⁴⁴⁰²Mit geeigneten Kontrasten oder mit einfachen paarweisen Vergleichen kann eine Trendanalyse vorgenommen werden, wenn Anzeichen für eine nicht monotone Dosis-Wirkungs-Beziehung innerhalb einer Ebene des Parameters LateStage bestehen. ⁴⁴⁰³Eine Anpassung der p-Werte nach Bonferroni-Holm erfolgt nur dann, wenn der entsprechende F-Test nicht signifikant ist. ⁴⁴⁰⁴Die Anpassung kann mit SAS und wahrscheinlich auch mit sonstiger Statistik-Software vorgenommen werden. ⁴⁴⁰⁵Komplikationen können sich ergeben, wenn bei einigen Konzentrationen keine Tiere ein spätes Entwicklungsstadium erreichen; diese Fälle können aber eher pragmatisch gehandhabt werden.
Anlage 4
Begriffsbestimmungen
Chemikalie: ein Stoff oder Gemisch
Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode getestet wird.
C.39. COLLEMBOLEN-REPRODUKTIONSTESTS IN BÖDEN
EINLEITUNG
| 1. | ⁴⁴⁰⁷Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 232 (2009). ⁴⁴⁰⁸Mit der Prüfmethode sollen die Wirkungen von Chemikalien auf die Reproduktionsleistung von bodenbewohnenden Collembolen untersucht werden. ⁴⁴⁰⁹Die Methode beruht auf bestehenden Verfahren (1)(2). Zwei der am besten zugänglichen Arten sind die parthenogenetische Art Folsomia candida und die sich geschlechtlich vermehrende Art Folsomia fimetaria, die beide kultivierbar und kommerziell erhältlich sind. ⁴⁴¹⁰Wenn spezifische Lebensräume zu bewerten sind, die durch diese beiden Arten nicht abgedeckt werden, ist die Methode auch auf andere Collembola-Arten übertragbar, sofern diese die Validitätskriterien des Tests erfüllen. |
| 2. | ⁴⁴¹¹Erdbewohnende Collembolen sind für Ökotoxizitätsprüfungen ökologisch relevante Arten. ⁴⁴¹²Collembolen sind Sechsfüßer mit einem dünnen und stark luft- und wasserdurchlässigen Exoskelett; sie repräsentieren Arthropoden, mit anderem Expositionspfad und anderer Expositionsrate als Regenwürmer und Enchytraeen. |
| 3. | ⁴⁴¹³In vielen terrestrischen Ökosystemen beträgt die Populationsdichte von Collembolen 105 m– 2 in Böden und in Laubschichten (3)(4). ⁴⁴¹⁴Adulte Tiere sind gewöhnlich 0,5-5 mm lang; ihr Anteil an der gesamten tierischen Biomasse und Respiration im Boden beschränkt sich auf geschätzte 1-5 % (5). ⁴⁴¹⁵Ihre wichtigste Rolle könnte daher die mögliche Regelung von Prozessen durch Fressen von Mikroorganismen und Mikrofauna darstellen. ⁴⁴¹⁶Springschwänze sind Beutetiere für zahlreiche endogäische und epigäische Invertebraten (z. B. Milben, Hundertfüßer, Spinnen, Laufkäfer und Kurzflügler). ⁴⁴¹⁷Collembolen unterstützen Zersetzungsprozesse in sauren Böden, wo sie neben Enchytraeen die wichtigsten Invertebraten sein können, da Regenwürmer und Diplopoden dort gewöhnlich nicht vorkommen. |
| 4. | F. fimetaria ist weltweit verbreitet und in verschiedenen Bodentypen von Sandböden bis zu Lehmböden und von Mull- bis Rohhumusböden anzutreffen. ⁴⁴¹⁹Die augenlose, pigmentlose Collembolenart wurde in landwirtschaftlichen Nutzflächen in ganz Europa nachgewiesen (6). ⁴⁴²⁰Sie ist ein Allesfresser und ernährt sich u. a. von Pilzhyphen, Bakterien, Protozoen und Detritus. Durch das Abweiden kann F. fimetaria einen Einfluss auf Infektionen pflanzenpathogener Pilze haben (7) und kann Mycorrhiza verändern; dies ist beispielsweise bei F. candida bekannt. Wie die meisten Collembolen-Arten vermehrt sich auch F. fimetaria geschlechtlich. ⁴⁴²²Zur Befruchtung der Eier müssen kontinuierlich männliche Tiere vorhanden sein. |
| 5. | F. candida kommt ebenfalls weltweit vor. ⁴⁴²⁴In den meisten natürlichen Böden ist diese Art zwar nicht üblich; an humusreichen Standorten ist sie aber in sehr großer Anzahl zu finden. ⁴⁴²⁵Die augenlose, pigmentlose Collembolenart besitzt eine gut entwickelte Furca (Springgabel); die Tiere bewegen sich lebhaft und springen, wenn sie gestört werden. Die ökologische Bedeutung von F. candida ist der Bedeutung von F. fimetaria vergleichbar; sie lebt jedoch in Böden, die reicher an organischen Bestandteilen sind. F. candida vermehrt sich parthenogenetisch. ⁴⁴²⁸Weniger als 1/1 000 aller Exemplare sind männliche Tiere. |
PRINZIP DER PRÜFUNG | 6. | Synchrone adulte (F. fimetaria) bzw. juvenile (F. candida) Collembolen werden in einem modifizierten künstlichen Boden (8) mit 5 % organischen Bestandteilen (oder einem alternativen Boden) verschiedenen Konzentrationen der Prüfchemikalie ausgesetzt. Die Prüfung kann in zwei Schritte unterteilt werden:- —
- Wenn keine hinreichenden Informationen zur Toxizität vorliegen, wird ein Vorversuch zur Bestimmung des Prüfkonzentrationsbereichs durchgeführt, bei dem nach 2 Wochen (bei F. fimetaria) bzw. nach 3 Wochen (bei F. candida) die Mortalität und die Reproduktionsleistung als wichtigste Endpunkte beurteilt werden.
- —
- Im definitiven Reproduktionstest werden die Gesamtzahl der aus den adulten Tieren hervorgegangenen juvenilen Tiere und die Anzahl der überlebenden adulten Tiere ermittelt. Dieser definitive Test dauert bei F. fimetaria 3 Wochen und bei F. candida vier Wochen.
Die toxische Wirkung der Prüfchemikalie auf die Mortalität adulter Tiere und auf die Reproduktionsleistung wird mit den Parametern LCx und ECx mittels nicht-linearer Regression mit einem geeigneten Modell bestimmt, um die Konzentration abzuschätzen, die eine Mortalität von x % oder einen Rückgang der Reproduktionsleistung um x % verursachen würde; alternativ kann die NOEC/LOEC bestimmt werden (9). |
INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 7. | ⁴⁴³⁴Die physikalischen Eigenschaften, die Wasserlöslichkeit, der log Kow-Wert, der Boden-Wasser-Verteilungskoeffizient und der Dampfdruck der Prüfchemikalie sollten möglichst bekannt sein. ⁴⁴³⁵Wünschenswert sind zudem Informationen über die Persistenz der Chemikalie im Boden (z. B. die Photolyse- und die Hydrolysegeschwindigkeit sowie der biotische Abbau). ⁴⁴³⁶So weit vorliegend, sind der IUPAC-Name sowie CAS-Nummer, Charge, Los, Strukturformel und Reinheit anzugeben. |
| 8. | ⁴⁴³⁷Diese Prüfmethode kann wahlweise für wasserlösliche und für nicht lösliche Chemikalien verwendet werden. ⁴⁴³⁸Allerdings ist die Prüfchemikalie den Eigenschaften entsprechend unterschiedlich einzubringen. ⁴⁴³⁹Für flüchtige Chemikalien ist die Prüfmethode nicht geeignet (d. h. für Chemikalien, bei denen die Henry-Konstante oder der Luft-Wasser-Verteilungskoeffizient größer als 1 ist oder für Chemikalien, bei denen der Dampfdruck bei 25 °C mehr als 0,0133 Pa beträgt). |
VALIDITÄT DES TESTS | 9. | Damit ein Testergebnis als gültig gewertet werden kann, müssen die unbehandelten Kontrollen die folgenden Kriterien erfüllen:- —
- Die mittlere Mortalität adulter Tiere darf am Ende des Versuchs höchstens 20 % betragen.
- —
- Die mittlere Anzahl juveniler Tiere pro Gefäß muss am Ende des Tests mindestens bei 100 liegen.
- —
- Der für die Anzahl an juvenilen Tieren berechnete Variationskoeffizient muss am Ende des definitiven Tests weniger als 30 % betragen.
|
REFERENZCHEMIKALIE | 10. | ⁴⁴⁴³Eine Referenzchemikalie muss bei ihrer EC50-Konzentration im ausgewählten Testboden getestet werden; entweder in regelmäßigen Abständen oder nach Möglichkeit bei jeder einzelnen Prüfung, um sicherzustellen, dass die Reaktion der Testorganismen im Prüfsystem im normalen Bereich liegt. ⁴⁴⁴⁴Eine geeignete Referenzchemikalie ist Borsäure; unter der Wirkung von Borsäure muss die Reproduktionsleistung bei beiden Arten und bei etwa 100 mg/kg Boden (bezogen auf die Trockenmasse) um 50 % zurückgehen (10)(11). |
BESCHREIBUNG DES TESTSPrüfgefäße und Apparatur
| 11. | ⁴⁴⁴⁵Die Prüfgefäße sollten hinreichend groß für mindestens 30 g feuchten Boden sein und aus Glas oder inertem (nicht-toxischem) Kunststoff bestehen. ⁴⁴⁴⁶Die Verwendung von Kunststoffbehältern ist jedoch zu vermeiden, wenn die Exposition gegenüber der Prüfchemikalie durch Sorption verringert wird. ⁴⁴⁴⁷Der Querschnitt der Prüfgefäße muss eine Verteilung des Bodens im Gefäß auf eine Tiefe von 2-4 cm ermöglichen. ⁴⁴⁴⁸Die Deckel der Gefäße (z. B. aus Glas oder Polyethylen) müssen so beschaffen sein, dass sie die Wasserverdunstung reduzieren und gleichzeitig den Gasaustausch zwischen dem Bodenmaterial und der Atmosphäre ermöglichen. ⁴⁴⁴⁹Die Behältnisse müssen mindestens zum Teil transparent sein, damit die erforderliche Lichtdurchlässigkeit gegeben ist. |
| 12. | Es wird eine normale Laborausrüstung mit folgenden Bestandteilen benötigt:- —
- Trockenschrank;
- —
- Stereomikroskop;
- —
- pH-Messgerät und Luxmeter;
- —
- Waagen mit geeigneter Genauigkeit;
- —
- geeignete Vorrichtungen zur Temperaturregelung;
- —
- geeignete Ausrüstung zur Luftfeuchtigkeitsregelung (nicht erforderlich, wenn die Expositionsgefäße mit Deckeln verschlossen werden);
- —
- Inkubator oder kleiner Raum mit Temperaturregelung;
- —
- Pinzette oder Sauggerät mit niedriger Saugleistung.
|
Herstellung des Testbodens | 13. | ⁴⁴⁵¹Für den Test wird ein modifizierter künstlicher Boden (8) mit einem Anteil von 5 % an organischen Bestandteilen verwendet. ⁴⁴⁵²Alternativ kann natürlicher Boden eingesetzt werden, da der künstliche nicht mit natürlichen Böden vergleichbar ist. Der künstliche Boden sollte folgende Zusammensetzung haben (bezogen auf Trockenmassen, nach Trocknung bei 105 °C auf ein konstantes Gewicht):- —
- 5 % Torfmoose, luftgetrocknet und fein gemahlen (eine Partikelgröße von 2 ± 1 mm ist annehmbar);
- —
- 20 % Kaolin-Ton (mit einem Kaolinit-Anteil vorzugsweise von mehr als 30 %);
- —
- ca. 74 % luftgetrockneter Industriesand (je nach erforderlichem CaCO3-Anteil), hauptsächlich feiner Sand mit mehr als 50 % Partikeln mit einer Größe von 50-200 μm; die genaue Menge des Sands hängt vom CaCO3-Gehalt ab (s. u.); insgesamt muss ein Anteil von 75 % erreicht werden.
- —
- 1,0 % Calciumcarbonat (CaCO3, Pulver, Analysequalität), um einen pH-Wert von 6,0 ± 0,5 zu erzielen; wie viel Calciumcarbonat hinzuzugeben ist, kann vor allem von der Qualität/Beschaffenheit des Torfs abhängen (siehe Hinweis 1).
Hinweis 1: Die benötigte Menge an CaCO3 hängt von den Bestandteilen des Bodensubstrats ab und ist durch Messung des pH-Werts der feuchten Unterproben des Bodens unmittelbar vor der Inkubation zu ermitteln.Hinweis 2: Der pH-Wert und (optional) das C-N-Verhältnis, die Kationenaustauschkapazität und der Anteil des Bodens an organischen Bestandteilen sollten ermittelt werden, um in einem späteren Stadium eine Normalisierung vornehmen und die Ergebnisse besser interpretieren zu können.
Hinweis 3: Wenn erforderlich, z. B. für spezifische Testanforderungen, können auch natürliche Böden aus nicht verunreinigten Standorten als Test- und/oder Kultursubstrate dienen. ⁴⁴⁵⁸Wenn Naturboden verwendet wird, sollten mindestens die Herkunft (Entnahmestandort), der pH-Wert, die Textur (Partikelgrößenverteilung), die Kationenaustauschkapazität und der Gehalt an organischen Bestandteilen angegeben werden. ⁴⁴⁵⁹Außerdem darf der Boden in keiner Weise kontaminiert sein. ⁴⁴⁶⁰Bei Naturböden ist es anzuraten, vor ihrer Verwendung in einem definitiven Test nachzuweisen, dass sie für einen Test geeignet sind und die Validitätskriterien erfüllt werden können.
|
| 14. | ⁴⁴⁶¹Die trockenen Bestandteile des Bodens werden gründlich gemischt (z. B. in einem großen Labormischer). ⁴⁴⁶²Die maximale Wasserrückhaltefähigkeit des künstlichen Bodens wird mit den in Anlage 5 beschriebenen Verfahren ermittelt. ⁴⁴⁶³Der Feuchtegehalt des Testbodens ist so zu optimieren, dass sich eine lockere poröse Struktur ergibt, in die sich die Collembolen zurückziehen können. ⁴⁴⁶⁴Gewöhnlich ist dies bei einem Feuchtegehalt von 40-60 % der maximalen Wasserrückhaltefähigkeit gegeben. |
| 15. | ⁴⁴⁶⁵Der trockene künstliche Boden wird vorgetränkt, indem so viel entionisiertes Wasser hinzugegeben wird, dass 2-7 Tage vor Beginn des Tests etwa die Hälfte des endgültigen Wassergehalts erreicht ist, damit sich der Säuregrad ausgleichen/stabilisieren kann. Zur Bestimmung des pH-Werts wird eine Mischung aus Boden und 1 mol Kaliumchlorid- (KCl) oder 0,01 mol Calciumchlorid-Lösung (CaCl2) im Verhältnis 1:5 verwendet (siehe Anlage 6). Wenn der Boden saurer als erforderlich ist, kann der pH-Wert durch Zugabe einer geeigneten Menge CaCO3 korrigiert werden. ⁴⁴⁶⁶Ist der Boden zu alkalisch, kann durch Zugabe einer anorganischen und für Collembolen unschädlichen Säure korrigiert werden. |
| 16. | ⁴⁴⁶⁷Der vorgetränkte Boden wird entsprechend der Anzahl der im Test zu verwendenden Prüfkonzentrationen (sowie gegebenenfalls der Referenzchemikalie) und Kontrollen aufgeteilt. ⁴⁴⁶⁸Die Prüfchemikalien werden hinzugegeben, und der Wassergehalt wird eingestellt, wie in Nummer 24 beschrieben. |
Auswahl und Vorbereitung der im Test zu verwendenden Tiere | 17. | Die parthenogenetische Art F. candida wird empfohlen, da diese Art im Ringtest der Prüfmethode (11) die Validitätskriterien hinsichtlich der Überlebensquote häufiger erfüllt hat als F. fimetaria. ⁴⁴⁶⁹Wenn eine andere Art verwendet wird, muss diese die in Nummer 9 beschriebenen Validitätskriterien erfüllen. Zu Beginn des Tests müssen die Tiere gut gefüttert sein und ein Alter von 23-26 Tagen (F. fimetaria) bzw. von 9-12 Tagen (F. candida) haben. Jedes Replikat muss jeweils 10 männliche und weibliche Tiere (F. fimetaria) bzw. 10 weibliche Tiere (F. candida) enthalten (siehe Anlage 2 und 3). ⁴⁴⁷¹Die synchronisierten Tiere werden zufällig aus den Gefäßen ausgewählt; anschließend werden für jede in ein Replikat eingesetzte Charge der Gesundheitszustand und die physischen Merkmale geprüft. Jede Gruppe von 10/20 Tieren wird in ein zufällig ausgewähltes Testbehältnis gesetzt; bei F. fimetaria werden die großen weiblichen Tiere auswählt, damit die weiblichen Tiere leicht von den männlichen Tieren zu unterscheiden sind. |
Herstellung der Prüfkonzentrationen | 18. | ⁴⁴⁷³Für die Applikation der Prüfchemikalie kommen vier Methoden in Betracht: 1) Verwendung von Wasser als Trägerstoff zum Mischen der Prüfchemikalie in den Boden; 2) Verwendung eines organischen Lösungsmittels als Trägerstoff zum Mischen der Prüfchemikalie in den Boden, 3) Verwendung von Sand als Trägerstoff zum Mischen der Prüfchemikalie in den Boden und 4) Applikation der Prüfchemikalie auf die Oberfläche des Bodens. ⁴⁴⁷⁴Welche Methode jeweils zu verwenden ist, hängt von den Merkmalen der jeweiligen Chemikalie und vom Zweck der Untersuchung ab. ⁴⁴⁷⁵Im Allgemeinen wird empfohlen, die Prüfchemikalie in den Boden einzumischen. ⁴⁴⁷⁶Es können allerdings Applikationsverfahren entsprechend der Verwendung der Prüfchemikalie in der Praxis erforderlich sein (z. B. Aufsprühen einer flüssigen Formulierung oder Verwendung spezieller Pestizidformulierungen wie z. B. Granulate oder Saatgutbeizen). ⁴⁴⁷⁷Die Collembolen werden erst eingesetzt, wenn der Boden mit der Prüfchemikalie gemischt wurde. ⁴⁴⁷⁸Wird jedoch die Prüfchemikalie auf den Boden aufgebracht, sind die Collembolen vorher einzusetzen, wobei abgewartet werden muss, bis sie in den Boden eingedrungen sind. |
In Wasser lösliche Prüfchemikalie | 19. | ⁴⁴⁷⁹Eine Lösung der Prüfchemikalie wird in entionisiertem Wasser in ausreichender Menge für alle Replikate einer Prüfkonzentration hergestellt. ⁴⁴⁸⁰Jede Lösung mit der Prüfchemikalie wird gründlich mit einer Charge des vorgetränkten Bodens gemischt, bevor sie in das Prüfgefäß gegeben wird. |
In Wasser nicht lösliche Prüfchemikalie | 20. | ⁴⁴⁸¹Chemikalien, die zwar nicht in Wasser, dafür aber in organischen Lösungsmitteln löslich sind, können in der geringstmöglichen Menge eines geeigneten Lösungsmittels (z. B. Aceton) gelöst werden. ⁴⁴⁸²Auch in diesem Fall sind eine angemessene Mischung der Chemikalie im Boden sowie ggf. ⁴⁴⁸³die Durchmischung mit Quarzsand erforderlich. ⁴⁴⁸⁴Es sind jedoch ausschließlich flüchtige Lösungsmittel zu verwenden. ⁴⁴⁸⁵Wenn ein organisches Lösungsmittel eingesetzt wird, müssen alle Prüfkonzentrationen sowie eine zusätzliche negative Lösungsmittelkontrolle denselben Mindestgehalt des Lösungsmittels aufweisen. ⁴⁴⁸⁶Die Testbehältnisse bleiben eine Zeit lang geöffnet, damit in Verbindung mit der Prüfchemikalie eingebrachte flüchtige Lösungsmittel verdunsten können; dabei ist allerdings sicherzustellen, dass die toxische Chemikalie in dieser Zeit nicht ebenfalls verdunstet. |
In Wasser schlecht lösliche Prüfchemikalie und organische Lösungsmittel | 21. | ⁴⁴⁸⁷Bei Chemikalien, die sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln schlecht löslich sind, wird Quarzsand (als Anteil der Gesamtmenge des dem Boden zugesetzten Sandes) mit der Prüfchemikalie gemischt, bis die gewünschte Prüfkonzentration erreicht ist. ⁴⁴⁸⁸Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfchemikalie wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und nach Hinzugabe einer entsprechenden Menge entionisierten Wassers gründlich gemischt, um den erforderlichen Feuchtegehalt zu erhalten. ⁴⁴⁸⁹Die endgültige Mischung wird auf die Prüfgefäße verteilt. ⁴⁴⁹⁰Dieses Verfahren wird für alle Prüfkonzentrationen wiederholt. ⁴⁴⁹¹Außerdem wird eine geeignete Kontrolle hergestellt. |
Aufbringung der Prüfchemikalie auf die Bodenoberfläche | 22. | ⁴⁴⁹²Wenn die Prüfchemikalie ein Pestizid ist, kann es angebracht sein, die Chemikalie auf den Boden aufzusprühen. ⁴⁴⁹³Der Boden wird nach dem Einsetzen der Collembolen behandelt. ⁴⁴⁹⁴Zunächst werden die Testbehältnisse mit dem vorgetränkten Bodensubstrat befüllt; anschließend werden die Tiere eingesetzt. ⁴⁴⁹⁵Danach werden die Testbehältnisse gewogen. ⁴⁴⁹⁶Um eine direkte Exposition der Tiere durch direkten Kontakt mit der Prüfchemikalie zu vermeiden, wird die Prüfchemikalie frühestens eine halbe Stunde nach Einsetzen der Collembolen eingebracht. ⁴⁴⁹⁷Die Prüfchemikalie ist mit einer geeigneten Labor-Sprühflasche möglichst gleichmäßig auf den Boden aufzubringen, um ein Versprühen auf dem Feld zu simulieren. ⁴⁴⁹⁸Die Applikation muss bei einer Temperatur innerhalb einer Variationsbreite von ± 2 °C erfolgen; bei wässrigen Lösungen, Emulsionen und Dispersionen erfolgt die Applikation mit dem Wasserdurchfluss entsprechend den auf Risikobewertungen beruhenden Empfehlungen. ⁴⁴⁹⁹Die Durchflussmenge ist mit einem geeigneten Kalibrierverfahren zu kontrollieren. ⁴⁵⁰⁰Spezielle Formulierungen (z. B. Granulate oder Saatgutbeizen) können entsprechend der landwirtschaftlichen Praxis aufgebracht werden. ⁴⁵⁰¹Nach dem Aufsprühen wird Futter hinzugegeben. |
VERFAHRENPrüfbedingungen
| 23. | ⁴⁵⁰²Die mittlere Testtemperatur muss bei 20 ± 1 °C liegen (Temperaturbereich 20 ± 2 °C). ⁴⁵⁰³Der Test wird unter kontrollierten Licht-Dunkel-Zyklen (vorzugsweise 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit) mit einer Beleuchtungsstärke von 400-800 lx um die Testbehältnisse durchgeführt. |
| 24. | ⁴⁵⁰⁴Um die Feuchte des Bodens zu ermitteln, werden die Gefäße zu Beginn des Tests, nach Ablauf der halben Testdauer und am Ende des Tests gewogen. ⁴⁵⁰⁵Gewichtsverluste von > 2 % werden durch Zugabe entionisierten Wassers ausgeglichen. ⁴⁵⁰⁶Wasserverluste können durch Aufrechterhaltung einer hohen Luftfeuchtigkeit (> 80 %) im Testinkubator reduziert werden. |
| 25. | ⁴⁵⁰⁷Der pH-Wert ist jeweils am Beginn und am Ende sowohl des Vorversuchs als auch des definitiven Tests zu messen. ⁴⁵⁰⁸Die Messungen sind an einer zusätzlichen Kontrolle und an einer zusätzlichen Probe des mit der Prüfchemikalie (in allen Konzentrationen) behandelten Bodens vorzunehmen. ⁴⁵⁰⁹Die zusätzliche Kontrolle und die zusätzliche Probe werden in der gleichen Weise wie die Testkulturen hergestellt und gehandhabt, enthalten aber keine Collembolen. |
Prüfverfahren und Messungen | 26. | ⁴⁵¹⁰Für alle Prüfkonzentrationen wird eine geeignete Menge Testboden (entsprechend 30 g Frischgewicht) in die Prüfgefäße gegeben. ⁴⁵¹¹Außerdem werden Wasserkontrollen ohne die Prüfchemikalie hergestellt. ⁴⁵¹²Wenn zur Applikation der Prüfchemikalie ein Trägerstoff verwendet wird, ist zusätzlich zu den Testreihen eine Kontrollreihe mit dem Trägerstoff zu prüfen. ⁴⁵¹³Die Konzentration des Lösungsmittels oder des Dispergiermittels sollte mit der Konzentration übereinstimmen, die auch in den Prüfgefäßen mit der Prüfchemikalie verwendet wurde. |
| 27. | ⁴⁵¹⁴Die einzelnen Springschwänze werden randomisiert vorsichtig in die verschiedenen Prüfgefäße auf die Bodenoberfläche gesetzt. ⁴⁵¹⁵Um die Tiere möglichst effizient handhaben zu können, kann ein Sauggerät mit niedriger Saugleistung verwendet werden. ⁴⁵¹⁶Die Anzahl der Replikate der Prüfkonzentrationen und der Kontrollen hängt vom jeweiligen Prüfprotokoll ab. ⁴⁵¹⁷Die Prüfgefäße werden zufällig in den Testinkubator gestellt, und die Positionen werden wöchentlich neu randomisiert. |
| 28. | Bei F. fimetaria werden 20 adulte Tiere (10 männliche und 10 weibliche Tiere) im Alter von 23-26 pro Testgefäß verwendet. ⁴⁵¹⁹An Tag 21 werden die Collembolen aus dem Boden extrahiert und gezählt. Bei F. fimetaria werden in der für den Test synchronisierten Charge die Geschlechter aufgrund ihrer Größe unterschieden. ⁴⁵²¹Die weiblichen Tiere sind deutlich größer als die männlichen (siehe Anlage 3). |
| 29. | Bei F. candida sind zehn 9-12 Tage alte juvenile Tiere pro Prüfgefäß zu verwenden. An Tag 28 werden die Collembolen aus dem Boden extrahiert und gezählt. |
| 30. | Als geeignetes Futter wird am Anfang des Tests und nochmals nach etwa 2 Wochen in jedes Behältnis eine hinreichende Menge (z. B. 2-10 mg) Trockenhefe in Haushaltsqualität gegeben. |
| 31. | ⁴⁵²⁵Am Ende des Tests werden die Mortalität und die Reproduktionsleistung bewertet. Nach 3 Wochen (F. fimetaria) bzw. nach 4 Wochen (F. candida) werden die Collembolen aus dem Testboden extrahiert (siehe Anlage 4) und gezählt (12). ⁴⁵²⁷In der Extraktion nicht erfasste Collembolen werden als tot gezählt. ⁴⁵²⁸Das Extraktions- und das Zählverfahren sind zu validieren. ⁴⁵²⁹Als Validititäskriterium gilt auch eine Extraktionsleistung von mehr als 95 % juvenilen Tieren; dies ist beispielsweise anhand einer Bodenprobe mit einer bekannten Anzahl an Collembolen zu prüfen. |
| 32. | Anlage 2 enthält eine praktische Übersicht und den Zeitplan des Prüfverfahrens. |
PrüfprotokollVorversuch
| 33. | ⁴⁵³¹Wenn erforderlich, wird ein Vorversuch beispielsweise mit fünf Konzentrationen der Prüfchemikalie von 0,1, 1,0, 10, 100 und 1 000 mg/kg Bodentrockengewicht und zwei Replikate pro Prüfkonzentration und pro Kontrolle vorgenommen. ⁴⁵³²Zusätzliche Informationen aus Untersuchungen ähnlicher Chemikalien oder aus der Literatur hinsichtlich der Mortalität oder der Reproduktionsleistung von Collembolen können ebenfalls bei der Auswahl der im Vorversuch zu verwendenden Konzentrationen herangezogen werden. |
| 34. | Um sicherzustellen, dass tatsächlich ein Gelege juveniler Tiere entstanden ist, wird der Vorversuch bei F. fimetaria zwei Wochen und bei F. candida drei Wochen fortgesetzt. ⁴⁵³⁴Am Ende des Tests werden die Mortalität und die Reproduktionsleistung der Collembolen bewertet. ⁴⁵³⁵Die Anzahl der adulten und der jungen Tiere wird jeweils protokolliert. |
Definitiver Test | 35. | ⁴⁵³⁶Zur Ermittlung des ECx-Werts (z. B. EC10 oder EC50) sind zwölf Konzentrationen zu prüfen. ⁴⁵³⁷Zu empfehlen sind mindestens zwei Replikate pro Prüfkonzentration und sechs Replikate pro Kontrolle. ⁴⁵³⁸Der Abstandsfaktor kann je nach Dosis-Wirkungs-Beziehung unterschiedlich sein. |
| 36. | ⁴⁵³⁹Zur Bestimmung der NOEC/LOEC sind mindestens fünf Konzentrationen in einer geometrischen Reihe zu prüfen. ⁴⁵⁴⁰Zu empfehlen sind vier Replikate je Prüfkonzentration und acht Kontrollen. ⁴⁵⁴¹Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden. |
| 37. | Ein kombinierter Ansatz ermöglicht die Bestimmung sowohl der NOEC/LOEC als auch des ECx-Werts. ⁴⁵⁴²Bei diesem kombinierten Ansatz sind acht Behandlungskonzentrationen in einer geometrischen Reihe zu verwenden. ⁴⁵⁴³Zu empfehlen sind vier Replikate je Behandlung und acht Kontrollen. ⁴⁵⁴⁴Die Konzentrationen dürfen sich maximal um den Faktor 1,8 unterscheiden. |
| 38. | ⁴⁵⁴⁵Wenn im Vorversuch bei der höchsten Konzentration (1 000 mg/kg) keine Wirkungen festzustellen sind, kann der Reproduktionstest als Limit-Test mit der Prüfkonzentration 1 000 mg/kg durchgeführt werden. ⁴⁵⁴⁶Mit einem Limit-Test kann nachgewiesen werden, dass bei der Limit-Konzentration keine statistisch signifikante Wirkung gegeben ist. ⁴⁵⁴⁷Sowohl für den behandelten Boden als auch für die Kontrollen sind jeweils acht Replikate durchzuführen. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 39. | ⁴⁵⁴⁸Wesentlicher Endpunkt ist die Reproduktionsleistung (z. B. gemessen an der Anzahl der pro Prüfgefäß entstandenen juvenilen Tiere). ⁴⁵⁴⁹In statistischen Analysen (z. B. durch ANOVA-Verfahren) werden die Ergebnisse der verschiedenen Konzentrationen anhand eines Student-t-Tests, eines Dunnett-Tests oder eines Williams-Tests verglichen. ⁴⁵⁵⁰Für die Mittelwerte der einzelnen Konzentrationen werden 95- %-Konfidenzintervalle berechnet. |
| 40. | ⁴⁵⁵¹Die Anzahl der überlebenden adulten Tiere in den unbehandelten Kontrollen ist ein wichtiges Validitätskriterium und muss dokumentiert werden. ⁴⁵⁵²Ebenso wie im Vorversuch sind jedoch im Abschlussbericht auch alle sonstigen Anzeichen für schädliche Wirkungen zu erfassen. |
LCx und ECx | 41. | ⁴⁵⁵³ECx-Werte einschließlich der entsprechenden oberen und unteren 95- %-Konfidenzintervalle für die einzelnen Parameter werden mit geeigneten statistischen Methoden berechnet (z. B. Logit- oder Weibull-Model oder Trimmed Spearman-Karber-Methode oder einfache Interpolation). Ein ECx-Wert wird ermittelt, indem der x % des Mittelwerts der Kontrollen entsprechende Wert in die gefundene Gleichung eingesetzt wird. Um den EC50-Wert oder einen sonstigen ECx-Wert zu ermitteln, sind sämtliche Daten einer Regressionsanalyse zu unterziehen. ⁴⁵⁵⁴Der LC50-Wert wird gewöhnlich mit einer Probit-Analyse oder einem ähnlichen Analyseverfahren bestimmt, bei dem die Binomialverteilung der Mortalitätsdaten berücksichtigt wird. |
NOEC/LOEC | 42. | ⁴⁵⁵⁵Wenn eine statistische Analyse beabsichtigt ist, um die NOEC/LOEC zu bestimmen, werden Statistiken für die einzelnen Gefäße benötigt. (Die Gefäße werden jeweils als Replikate betrachtet.) Es sind geeignete statistische Methoden anzuwenden; maßgeblich ist das OECD-Dokument 54 ‚Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application‘ (9). ⁴⁵⁵⁶Im Allgemeinen werden schädliche Wirkungen der Prüfchemikalie im Vergleich zur Kontrolle einer einseitigen Hypothesenprüfung mit p ≤ 0,05 unterzogen. |
| 43. | ⁴⁵⁵⁷Die Normalverteilung und die Varianzhomogenität können mit einem geeigneten statistischen Test geprüft werden (z. B. mit dem Shapiro-Wilk- bzw. dem Levene-Test (p ≤ 0,05)). ⁴⁵⁵⁸Nach einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) können Methoden zur multiplen Testung durchgeführt werden. ⁴⁵⁵⁹Mit multiplen Tests (z. B. mit dem Dunnett-Test) oder Step-down-Trendtests (z. B. dem Williams-Test) kann berechnet werden, ob zwischen den Kontrollen und den verschiedenen Prüfkonzentrationen der Prüfchemikalie signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) bestehen. ⁴⁵⁶⁰Welcher Test vorzunehmen ist, wird im OECD-Dokument 54 (9) beschrieben. ⁴⁵⁶¹Andernfalls müssen nicht parametrische Methoden (z. B. ein U-Test mit Bonferroni-/Holm-Korrektur oder ein Jonckheere-Terpstra-Trendtest) verwendet werden, um die NOEC und die LOEC zu bestimmen. |
Limit-Test | 44. | ⁴⁵⁶²Wenn ein Limit-Test (Vergleich der Kontrolle mit einer einzigen Prüfkonzentration) durchgeführt wurde und die Voraussetzungen für parametrische Testverfahren (Normalität, Homogenität) erfüllt sind, können metrische Antworten mit dem Student-Test (t-Test) ausgewertet werden. ⁴⁵⁶³Sind diese Bedingungen nicht erfüllt, so kann ein t-Test für ungleiche Varianzen (Welch-Test) oder ein nicht-parametrischer Test wie der Wilcoxon-Mann-Whithey-U-Test verwendet werden. |
| 45. | ⁴⁵⁶⁴Um signifikante Unterschiede zwischen den Kontrollen (Kontrollen und Lösungsmittelkontrollen) zu ermitteln, können die Replikate der einzelnen Kontrollen geprüft werden, wie für den Limit-Test beschrieben. ⁴⁵⁶⁵Werden bei diesen Tests keine signifikanten Unterschiede festgestellt, können alle Replikate (Kontrollen und Lösungsmittelkontrollen) zusammengefasst werden. ⁴⁵⁶⁶Ansonsten sind alle Behandlungen mit der Lösungsmittelkontrolle zu vergleichen. |
Prüfbericht | 46. | Der Testbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten: | Prüfchemikalie- —
- Identität der Prüfchemikalie (Charge, Los, CAS-Nummer und Reinheit);
- —
- physikalisch-chemische Eigenschaften der Prüfchemikalie (z. B. log Kow, Wasserlöslichkeit, Dampfdruck und Henry-Konstante (H) sowie vorzugsweise Angaben zur Persistenz der Prüfchemikalie im Boden) (so weit verfügbar);
- —
- wenn die Chemikalie nicht in reiner Form verwendet wird, sind die Formulierung der Prüfchemikalie und verwendete Additive anzugeben;
|
| Testorganismen| — | Art und Herkunft der Testorganismen, Beschreibung der Zuchtbedingungen und Altersspektrum der Testorganismen; |
|
| Prüfbedingungen- —
- Beschreibung des Prüfprotokolls und des Prüfverfahrens;
- —
- Angaben zur Herstellung des im Versuch verwendeten Bodens; bei natürlichem Boden eine ausführliche Beschreibung (Herkunft, Geschichte, Partikelgrößenverteilung, pH-Wert, organische Bestandteile);
- —
- Wasserrückhaltefähigkeit des Bodens;
- —
- Beschreibung des Verfahrens zur Einbringung der Prüfchemikalie in den Boden;
- —
- Prüfbedingungen: Lichtintensität, Dauer der Licht-Dunkel-Zyklen, Temperatur;
- —
- Beschreibung der Fütterung; Typ und Menge des im Versuch verwendeten Futters; Zeitpunkte der Fütterung;
- —
- pH-Wert und Wassergehalt des Bodens zu Beginn und während des Versuchs (Kontrolle und jede einzelne Prüfkonzentration);
- —
- detaillierte Beschreibung des Extraktionsverfahrens und der Wirksamkeit des Verfahrens;
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| Prüfergebnisse:- —
- Anzahl der in den einzelnen Testbehältnissen ermittelten Jungtiere am Ende des Versuchs;
- —
- Anzahl der in den einzelnen Testbehältnissen ermittelten adulten Tiere und der ermittelten adulten toten Tiere ( %) am Ende des Versuchs;
- —
- Beschreibung offensichtlicher physiologischer oder pathologischer Symptome oder deutlicher Verhaltensänderungen;
- —
- Ergebnisse mit der Referenzchemikalie;
- —
- die NOEC/LOEC, der LCx-Wert (Mortalität) und die ECx-Werte für die Reproduktionsleistung (in erster Linie LC50, LC10, EC50 und EC10) sowie die 95- %-Konfidenzintervalle; eine grafische Darstellung des Regressionsmodells; die Funktionsgleichung und die Parameter der Gleichung (9);
- —
- sämtliche Informationen und Beobachtungen, die für die Interpretation der Ergebnisse hilfreich sein könnten,
- —
- wenn eine Hypothesenprüfung vorgenommen wird, die Aussagekraft des Tests (9);
- —
- Abweichungen von den für diese Prüfmethode beschriebenen Verfahren und außergewöhnliche Vorkommnisse während der Prüfung;
- —
- die Validität des Tests;
- —
- für die NOEC (wenn bestimmt), der minimal nachweisbare Unterschied.
|
|
LITERATUR | (1) | Wiles, JA, und Krogh, PH (1998) Testing with the collembolans I. viridis, F. candida and F. fimetaria. ⁴⁵⁶⁸Handbook of soil invertebrate toxicity tests (Hrsg. ⁴⁵⁶⁹H Løkke und CAM Van Gestel), S. 131-156. ⁴⁵⁷⁰John Wiley & Sons, Ltd., Chichester |
| (2) | ISO (1999) Bodenbeschaffenheit — Wirkung von Schadstoffen auf Collembolen (Folsomia candida) — Verfahren zur Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung, Nr. 11267, International Organisation for Standardisation, Genf. |
| (3) | Burges, A, und Raw, F. ⁴⁵⁷²(Hrsg.) (1967) Soil Biology. ⁴⁵⁷³Academic Press. London |
| (4) | Petersen, H., und Luxton, M. (1982) A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388 |
| (5) | Petersen, H. (1994) A review of collembolan ecology in ecosystem context. Acta Zoologica Fennica 195: 111-118 |
| (6) | Hopkin, S.P. (1997). Biology of the Springtails (Insecta: Collembola). Oxford University Press. 330 S. (ISBN 0-19-854084-1) |
| (7) | Ulber, B. (1983) Einfluss von Onychirurus fimatus Gisin (Collembola, Onychiuridae) und Folsomia fimetaria L. (Collembola, Isotomidae) auf Pythium ultimum Trow. ⁴⁵⁷⁷einen Erreger des Wurzelbrandes der Zuckerrübe. ⁴⁵⁷⁸In: New trends in soil Biology (Lebrun Ph, André HM, De Medts A, Grégoire-Wibo, Wauthy G (Hrsg.), Unterlagen des VI. internationalen Kolloquiums über Bodenzoologie (International Colloquium on Soil Zoology), Louvain-la-Neuve (Belgien), 30. August bis 2. September 1982, I Dieu-Brichart, Ottignies-Louvain-la-Neuve, S. 261-268 |
| (8) | In diesem Anhang Kapitel C.36 Reproduktionstest mit Raubmilben (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) in Bodenproben |
| (9) | OECD (2006), Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. OECD series on testing and assessment Number 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD Paris |
| (10) | Scott-Fordsmand, J.J., und Krogh, P.H .(2005) Background report on prevalidation of an OECD springtail test guideline. Environmental Project Nr. 986. Miljøstyrelsen, 61 S., Danish Ministry for the Environment. |
| (11) | Krogh, P.H., 2009. ⁴⁵⁸²Toxicity testing with the collembolans Folsomia fimetaria and Folsomia candida and the results of a ringtest. ⁴⁵⁸³Danish Environmental Protection Agency, Environmental Project No. 1256, S. 66. |
| (12) | Krogh, P.H., Johansen, K., und Holmstrup, M. ⁴⁵⁸⁴(1998) Automatic counting of collembolans for laboratory experiments. Appl. ⁴⁵⁸⁵Soil Ecol. 7, 201-205 |
| (13) | Fjellberg, A. ⁴⁵⁸⁶(1980) Identification keys to Norwegian collembolans. ⁴⁵⁸⁷Norsk Entomologisk Forening. |
| (14) | Edwards, C.A. (1955) Simple techniques for rearing Collembola, Symphyla and other small soil inhabiting arthropods. In Soil Zoology (Kevan D.K. McE., Ed). Butterworths, London, S. 412-416 |
| (15) | Goto, H.E. (1960) Simple techniques for the rearing of Collembola and a not on the use of a fungistatic substance in the cultures. Entomologists' Monthly Magazine 96:138-140. |
Anlage 1Begriffsbestimmungen
Die folgenden Begriffsbestimmungen beziehen sich auf diese Prüfmethode. (Bei dieser Prüfung werden die Wirkungskonzentrationen als Masse der Prüfchemikalie bezogen auf die Trockenmasse des Testbodens ausgedrückt.)
Chemikalie: ein Stoff oder ein Gemisch.
NOEC (höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung): die Konzentration der Prüfchemikalie, bei der keine Wirkung beobachtet wird; bei dieser Prüfung hat die der NOEC entsprechende Konzentration innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle keine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05).
LOEC (niedrigste geprüfte Konzentration, bei der noch schädliche Wirkungen beobachtet werden): niedrigste Konzentration der Prüfchemikalie innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer mit statistisch signifikanter Wirkung (p < 0,05) im Vergleich zur Kontrolle.
ECx (Konzentration mit einer Wirkung von x %): Konzentration, bei der innerhalb einer bestimmten Expositionsdauer im Vergleich zur Kontrolle eine Wirkung von x % auf die Testorganismen zu verzeichnen ist; der EC50-Wert beispielsweise ist die Konzentration, bei der während einer bestimmten Expositionsdauer bei 50 % einer exponierten Population eine Wirkung auf einen Endpunkt der Prüfung erwartet wird.
Prüfchemikalie: ein beliebiger Stoff oder ein beliebiges Gemisch, der/das nach dieser Methode geprüft wird.
Anlage 2
Wesentliche Schritte und Verlauf eines Colembolen-Tests
Die einzelnen Schritte des Tests lassen sich wie folgt zusammenfassen:
| Zeitpunkt (Tag) | Schritt | | – 23 bis – 26 | Herstellen einer synchronen F.-fimetaria-Kultur | | – 14 | Herstellen des künstlichen Bodens (Mischen trockener Bestandteile)Prüfung des pH-Werts des künstlichen Bodens und entsprechende Einstellung
Messung der maximalen Wasserrückhaltefähigkeit des Bodens
| | – 9 bis – 12 | Herstellen einer synchronen F.-candida-Kultur | | – 2 bis – 7 | Vortränken des Bodens | | – 1 | Aufteilung der juvenilen Tiere in ChargenHerstellen der Stammlösungen und Applikation der Prüfchemikalie, wenn ein Lösungsmittel benötigt wird
| | 0 | Herstellen der Stammlösungen und Applikation der Prüfchemikalie, wenn eine feste Chemikalie oder eine Lösung in Wasser verwendet oder eine oberflächliche Applikation vorgenommen werden mussMessen des pH-Werts des Bodens und Wiegen der Behältnisse
Zugabe des Futters; Einsetzen der Collembolen
| | 14 | Vorversuch mit F. fimetaria: Beenden des Tests, Extrahieren der Tiere, Messen des pH-Werts des Bodens und des Wasserverlusts (Gewicht)Definitive Tests: Messen des Feuchtegehalts Auffüllen mit Wasser und Zugabe von 2-10 mg Hefe
| | 21 | Definitiver Test mit F. fimetaria: Beenden des Tests, Extrahieren der Tiere, Messen des pH-Werts des Bodens und des Wasserverlusts (Gewicht)Vorversuch mit F. candida: Beenden des Tests, Extrahieren der Tiere, Messen des pH-Werts des Bodens und des Wasserverlusts (Gewicht)
| | 28 | Definitiver Test mit F. candida: Beenden des Tests, Extrahieren der Tiere, Messen des pH-Werts des Bodens und des Wasserverlusts (Gewicht) |
Anlage 3Leitlinien zur Zucht und zur Synchronisierung von F. fimetaria und F. candida
Die Angaben in diesen Leitlinien zu Zeitpunkten und Dauer der einzelnen Schritte sind für jeden einzelnen Collembolen-Stamm gesondert zu prüfen, um sicherzustellen, dass der Zeitrahmen eine hinreichende Synchronisierung der juvenilen Tiere ermöglicht. Der Tag für die Entnahme der Eier und der synchronen juvenilen Tiere richtet sich nach dem Zeitpunkt der Eiablage nach Einsetzen der adulten Tiere in ein frisches Substrat und nach dem Zeitpunkt des Schlüpfens.
⁴⁵⁹⁸Es wird eine Dauerkultur bestehend aus z. B. 50 Behältnissen/Petrischalen empfohlen. ⁴⁵⁹⁹Die Stammkultur ist wöchentlich mit ausreichend Futter und Wasser zu versorgen; Futterreste und tote Tiere werden entfernt. ⁴⁶⁰⁰Wenn sich zu wenige Collembolen auf dem Substrat befinden, kann es zu einer Inhibition durch verstärktes Wachstum von Pilzen kommen. ⁴⁶⁰¹Wird die Stammkultur zu häufig zur Gewinnung von Eiern genutzt, kann die Kultur ermüden. ⁴⁶⁰²Anzeichen einer Erschöpfung sind tote adulte Tiere und Schimmel auf dem Substrat. ⁴⁶⁰³Die nach der Erzeugung synchroner Tiere verbliebenen Eier können zur Verjüngung der Kultur genutzt werden.
In einer synchronen F. fimetaria-Kultur sind die männlichen Tiere hauptsächlich aufgrund ihrer Größe von weiblichen Tieren zu unterscheiden. ⁴⁶⁰⁵Die männlichen Tiere sind deutlich kleiner als die weiblichen Tiere und bewegen sich rascher als die weiblichen Tiere. ⁴⁶⁰⁶Trotzdem erfordert die zuverlässige Erkennung der Geschlechter ein wenig Übung; eine Bestätigung kann durch eine mikroskopische Kontrolle des Genitalbereichs erfolgen (13).
1. Aufzucht
1.a. Herstellen des Kultursubstrats
Als Kultursubstrat wird Gips (Calciumsulfat) mit Aktivkohle verwendet. ⁴⁶⁰⁸In diesem feuchten Substrat absorbiert die Aktivkohle freigesetzte Gase und Exkremente (14) (15). ⁴⁶⁰⁹Um die Beobachtung der Collembolen zu erleichtern, können verschiedene Formen von Holzkohle verwendet werden. Für F. candida und F. fimetaria beispielsweise wird Holzkohlepulver verwendet. (Entsprechend entsteht ein schwarz-grauer Gips.)
Bestandteile des Substrats:
- —
- 20 ml Aktivkohle
- —
- 200 ml destilliertes Wasser
- —
- 200 ml Gips
oder- —
- 50 g Aktivkohlepulver
- —
- 260-300 ml destilliertes Wasser
- —
- 400 g Gips.
Die Substratmischung muss sich vor der Verwendung absetzen können.1. b. Bebrütung
Collembolen werden z. B. in Petrischalen (90 mm × 13 mm) gehalten, deren Boden mit einem 0,5 cm starken Gipssubstrat bzw. Holzkohlesubstrat bedeckt ist. ⁴⁶¹³Bei einer Temperatur von 20 ± 1 °C wird eine Photoperiode mit 12 h Licht und 12 h Dunkelheit (bei 400-800 lx) eingerichtet. ⁴⁶¹⁴Die Behältnisse sind ständig feucht zu halten, damit eine relative Luftfeuchte in den Behältnissen von 100 % gewährleistet ist. ⁴⁶¹⁵Dies kann durch freies Wasser im porösen Gips gewährleistet werden; allerdings ist die Entstehung eines Wasserfilms auf der Gipsoberfläche zu vermeiden. ⁴⁶¹⁶Wasserverluste können durch Zufuhr feuchter Umgebungsluft verhindert werden. ⁴⁶¹⁷Tote Tiere sind aus den Behältnissen zu entfernen, da sie die Schimmelbildung fördern könnten. ⁴⁶¹⁸Um die Eiablage anzuregen, müssen die adulten Tiere in Petrischalen mit frisch angesetztem Gips-/Aktivkohle-Substrat gesetzt werden.
1.c. Futter
Als einziges Futter wird sowohl für F. candida als auch für F fimetaria Trockenhefe verwendet. ⁴⁶²⁰Um Schimmelbildung vorzubeugen, wird frisches Futter ein- oder zweimal wöchentlich bereitgestellt. ⁴⁶²¹Das Futter wird in einem kleinen Haufen unmittelbar auf den Gips gegeben. ⁴⁶²²Die Menge an bereitgestellter Backhefe ist der Größe der Collembolen-Population anzupassen, im Allgemeinen sind jedoch 2-15 mg ausreichend.
2. Synchronisierung
Der Test wird mit synchronisierten Tieren durchgeführt, um hinsichtlich des Larvenstadiums und der Größe der Tiere eine homogene Struktur zu gewährleisten. Außerdem ermöglicht die Synchronisierung bei F. fimetaria die Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Tieren ab einem Alter von 3 Wochen aufgrund des Geschlechtsdimorphismus (d. h. des Größenunterschieds). Im Folgenden wird ein Verfahren zur Gewinnung synchronisierter Tiere vorgeschlagen. (In der Praxis können sich einzelne Schritte unterscheiden.)
2.a. Synchronisierung
- —
- Die vorgesehenen Behältnisse werden mit einer 0,5 cm hohen Schicht Gips-/Aktivkohle-Substrat gefüllt.
- —
- Zur Eiablage werden 150-200 adulte Exemplare von F. fimetaria und 50-100 Exemplare von F. candida aus den 15-20 besten Stammkultur-Behältnissen mit dem 4-8 Wochen alten Substrat in die Behältnisse gesetzt und mit 15 mg Backhefe gefüttert. Die juvenilen Tiere dürfen nicht mit adulten Tieren zusammengebracht werden, da die Anwesenheit juveniler Tiere die Eiproduktion hemmen könnte.
- —
- ⁴⁶²⁸Die Kultur wird bei 20 ± 1 °C (durchschnittlich 20 °C) und einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12:12 Stunden (400-800 lx) gehalten. ⁴⁶²⁹Es ist sicherzustellen, dass frisches Futter verfügbar ist und dass die Luft mit Wasser gesättigt ist. Futtermangel kann dazu führen, dass die Tiere auf die Eier koten und dass sich Pilze auf den Eiern bilden; bei F. candida kann es zudem vorkommen, dass die Tiere die eigenen Eier fressen. ⁴⁶³¹Nach 10 Tagen werden die Eier mit einer Nadel und einem Spatel vorsichtig entnommen und auf ‚Eier-Papier‘ (kleine Stückchen Filterpapier, das in Gips-/Holzkohle-Schlamm getaucht wurde) gebracht. ⁴⁶³²Dieses wird in ein Behältnis mit frischem Gips-/Holzkohle-Substrat gelegt. ⁴⁶³³Danach werden einige Körner Hefe zum Substrat hinzugeben, um die juvenilen Tiere anzulocken und sie dazu zu bringen, das ‚Eier-Papier‘ zu verlassen. ⁴⁶³⁴Wichtig ist, dass das Eier-Papier und das Substrat feucht sind, da sonst die Eier austrocknen. ⁴⁶³⁵Alternativ können adulte Tiere 2-3 Tage nach Beginn der Eiablage aus den Synchronisierungsbehältnissen entnommen werden.
- —
- Nach drei Tagen sind aus den meisten Eiern auf dem Eier-Papier Tiere geschlüpft; auch unter dem Papier können sich einige juvenile Tiere befinden.
- —
- ⁴⁶³⁷Damit die juvenilen Tiere eine einheitliche Altersstruktur haben, wird das Eier-Papier (mit den Eiern, aus denen noch keine Tiere geschlüpft sind) mit einer Pinzette aus der Petrischale genommen. ⁴⁶³⁸Die juvenilen Tiere (inzwischen im Alter von 0-3 Tagen) verbleiben auf der Schale und werden mit Backhefe gefüttert. ⁴⁶³⁹Eier, aus denen keine Tiere geschlüpft sind, werden verworfen.
- —
- Eier und geschlüpfte juvenile Tiere werden auf die gleiche Weise gehalten wie die adulten Tiere. Bei F. fimetaria sind folgende Maßnahmen zu treffen: Es muss hinreichend frisches Futter bereitgestellt werden; altes schimmelndes Futter ist zu entfernen; nach einer Woche werden die juvenilen Tiere auf neue Petrischalen verteilt, wenn eine Populationsdichte von über 200 Tieren erreicht wurde.
2. b. Behandlung der Collembolen zu Beginn des Tests- —
- 9-12 Tage alte F. candida bzw. 23-26 Tage alte F. fimetaria werden entnommen (z. B. durch Absaugung) und in ein kleines Behältnis mit einem feuchten Gips-/Holzkohle-Substrat gesetzt; der physische Zustand der Tiere wird unter einem binokularen Mikroskop geprüft. (Verletzte oder beschädigte Tiere werden verworfen.) Bei allen Behandlungsschritten müssen sich die Collembolen in einer feuchten Atmosphäre befinden, damit die Tiere nicht durch Austrocknung belastet werden; dazu können beispielsweise Oberflächen befeuchtet werden.
- —
- ⁴⁶⁴⁴Das Behältnis wird umgedreht; durch Klopfen wird bewirkt, dass die Collembolen auf das Bodensubstrat fallen. ⁴⁶⁴⁵Elektrostatische Aufladungen sind zu vermeiden; ansonsten könnten die Tiere nach oben oder an die Seitenwände der Prüfgefäße gezogen werden und austrocknen. ⁴⁶⁴⁶Die Neutralisierung kann mit einem Ionisierer erfolgen oder indem ein feuchtes Tuch unter die Behältnisse gelegt wird.
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- Das Futter ist nicht an einer einzigen Stelle auszulegen, sondern über die gesamte Bodenfläche zu verteilen.
- —
- Beim Einsetzen der Tiere und während des Tests sollte nicht an die Testbehältnisse geklopft oder anderweitig physisch auf die Testbehältnisse eingewirkt werden, damit der Boden nicht verdichtet wird und die Collembolen nicht gestört werden.
3. Alternative Collembolen-ArtenFür eine Untersuchung mit dieser Prüfmethode können auch andere Collembolen-Arten verwendet werden (beispielsweise Proisotoma minuta, Isotoma viridis, Isotoma anglicana, Orchesella cincta, Sinella curviseta, Paronychiurus kimi, Orthonychiurus folsomi oder Mesaphorura macrochaeta). Damit eine andere Art ausgewählt werden kann, müssen jedoch verschiedene Anforderungen erfüllt sein:
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- Die Art muss eindeutig identifiziert worden sein;
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- die Auswahl der jeweiligen Art ist zu begründen;
- —
- die Reproduktionsbiologie muss in der Testphase so berücksichtigt werden, dass eine potenzielle Wirkung auch diesbezüglich festgestellt werden könnte;
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- der Lebenszyklus der Art muss bekannt sein: Alter bei Erreichen der Geschlechtsreife, Dauer von der Eiablage bis zum Schlüpfen und exponierte Larvenstadien;
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- das Testsubstrat und das bereitgestellte Futter müssen optimale Bedingungen für Wachstum und Reproduktion der Tiere bieten;
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- die Variabilität muss so gering sein, dass die Toxizität präzise und genau abgeschätzt werden kann.
Anlage 4Extraktion und Zählen der Tiere
1. Zwei Extraktionsmethoden kommen in Betracht:
| 1.a. | Erste Methode: Es kann ein auf den Grundsätzen von MacFadyen (1) beruhendes Extraktionsgerät mit kontrolliertem Temperaturgefälle verwendet werden. ⁴⁶⁵¹Die Wärme strömt (geregelt durch einen Thermistor auf der Oberfläche der Bodenprobe) aus einem Heizelement oben im Extraktionsbehälter. ⁴⁶⁵²Die Temperatur in der gekühlten Flüssigkeit um das Aufnahmegefäß wird ebenfalls durch einen Thermistor auf der Oberfläche des (unter dem Boden befindlichen) Aufnahmegefäßes geregelt. ⁴⁶⁵³Die Thermistoren sind an eine programmierbare Steuerung angeschlossen, die die Temperatur nach einem voreingestellten Programm regelt. ⁴⁶⁵⁴Die Tiere fallen in das gekühlte Aufnahmegefäß (2 °C), dessen Boden mit Gips/Holzkohle bedeckt ist. ⁴⁶⁵⁵Die Extraktion beginnt bei 25 °C; über insgesamt 48 Stunden wird die Temperatur alle 12 h automatisch um 5 °C erhöht. ⁴⁶⁵⁶Nach 12 h bei einer Temperatur von 40 °C ist die Extraktion beendet. |
| 1.b. | Zweite Methode: Nach der Inkubationsdauer des Versuchs wird die Anzahl der juvenilen Collembolen durch Flotation ermittelt. ⁴⁶⁵⁸Zu diesem Zweck wird der Test in Gefäßen mit einem Volumen von etwa 250 ml durchgeführt. ⁴⁶⁵⁹Am Ende des Tests werden ca. ⁴⁶⁶⁰200 ml destilliertes Wasser hinzugegeben. ⁴⁶⁶¹Der Boden wird mit einem feinen Pinsel vorsichtig umgerührt, damit die Collembolen auf der Wasseroberfläche aufschwimmen können. ⁴⁶⁶²Zum Wasser kann ein geringer Anteil (etwa 0,5 ml) schwarze Fotofarbe von Kentmere hinzugegeben werden, um durch Verstärken des Kontrasts zwischen dem Wasser und den weißen Collembolen die Zählung zu erleichtern. ⁴⁶⁶³Die Farbe ist für Collembolen nicht giftig. |
2. Zählen:Die Anzahl der Tiere kann mit bloßem Auge oder unter einem Lichtmikroskop mit einem Trägernetz über dem Flotationsgefäß oder durch Fotografieren der Oberfläche der einzelnen Gefäße und anschließendes Zählen der Collembolen auf Vergrößerungen oder projizierten Bildern ermittelt werden. ⁴⁶⁶⁵Außerdem können Verfahren der digitalen Bildverarbeitung zum Zählen genutzt werden (12). ⁴⁶⁶⁶Alle Verfahren müssen validiert werden.
Anlage 5
Ermittlung der maximalen Wasserrückhaltefähigkeit des Bodens
Die folgende Methode hat sich zur Bestimmung der maximalen Wasserrückhaltefähigkeit des Bodens bewährt. Sie wird in Anhang C von ISO DIS 11268-2 (Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwürmer (Eisenia fetida), Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die Reproduktionsleistung) erläutert.
⁴⁶⁶⁸Mit einer geeigneten Vorrichtung zur Probenahme (etwa einem Schneckenrohr) wird eine bestimmte Menge (z. B. 5 g) des Testsubstrats entnommen. ⁴⁶⁶⁹Der Boden des Rohres wird mit einem Stück feuchtem Filterpapier bedeckt; anschließend wird das Rohr in einem Wasserbad auf ein Gestell gesetzt. ⁴⁶⁷⁰Das Rohr wird allmählich eingetaucht, bis das Wasser oberhalb des Bodens steht. ⁴⁶⁷¹Das Rohr wird etwa drei Stunden im Wasser belassen. ⁴⁶⁷²Da das Wasser nicht vollständig von den Kapillaren des Bodensubstrats aufgenommen werden kann, wird das Rohr zur Entwässerung zwei Stunden in einem geschlossenen Gefäß (um ein Austrocknen zu verhindern) auf ein Bett aus sehr nassem, fein gemahlenem Quarzsand gesetzt. ⁴⁶⁷³Anschließend wird die Probe gewogen und bei 105 °C auf eine konstante Masse getrocknet. Die Wasserrückhaltefähigkeit (WHC = Water Holding Capacity) wird wie folgt berechnet:
Dabei sind:
| S | = | mit Wasser gesättigtes Substrat + Masse des Rohrs + Masse des Filterpapiers | | T | = | Tara (Masse des Rohrs + Masse des Filterpapiers) | | D | = | Trockenmasse des Substrats |
Anlage 6pH-Bestimmung des Bodens
Die folgende Methode zur Ermittlung des pH-Werts eines Bodensubstrats beruht auf der Beschreibung in ISO DIS 10390: Bodenbeschaffenheit — Bestimmung des pH-Wertes.
⁴⁶⁷⁴Eine bestimmte Substratmenge wird mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Eine Bodensuspension (mindestens 5 g Boden) wird mit dem fünffachen Volumen einer 1-M-Lösung Kaliumchlorid (KCl) in Analysequalität oder einer 0,01-M-Calciumchlorid-Lösung (CaCl2) in Analysequalität hergestellt. ⁴⁶⁷⁵Die Suspension wird fünf Minuten sorgfältig geschüttelt und bleibt dann mindestens 2 und höchstens 24 Stunden zum Ausfällen stehen. ⁴⁶⁷⁶Der pH-Wert der flüssigen Phase wird mit einem pH-Messgerät gemessen, das vor jeder Messung mit einer geeigneten Reihe an Pufferlösungen (z. B. pH 4,0 und 7,0) kalibriert wurde.
C.40. LEBENSZYKLUS-TOXIZITÄTSTESTS BEI CHIRONOMIDEN IN SEDIMENT-WASSER-SYSTEMEN MIT DOTIERTEM SEDIMENT
EINLEITUNG
| 1. | ⁴⁶⁷⁷Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 233 (2010). Sie dient der Bewertung der Wirkung einer lebenslangen Chemikalienexposition sedimentbewohnender Larven von Chironomus sp.⁴⁶⁷⁸, einem in Süßwasser lebenden Zweiflügler, unter vollständiger Berücksichtigung der 1. ⁴⁶⁷⁹Generation (Generation P) und eines frühen Stadiums der 2. ⁴⁶⁸⁰Generation (Generation F1). ⁴⁶⁸¹Die Methode ist eine Erweiterung der bestehenden Prüfmethoden C.28 (1) bzw. C.27 (15), bei der die Exposition über dotiertes Wasser bzw. über ein dotiertes Sediment erfolgt. Dabei werden bestehende Protokolle für Toxizitätstests mit Chironomus riparius und Chironomus dilutus (früher auch als C. tentans bezeichnet (2)) berücksichtigt, die in Europa und in Nordamerika entwickelt (3)(4)(5)(6)(7)(8)(9) und anschließend in Ringtests geprüft wurden (1)(7)(10)(11)(12). Auch andere gut dokumentierte Chironomiden-Arten wie Chironomus yoshimatsui (13)(14) sind geeignet. Die Exposition erfolgt insgesamt über eine Dauer von etwa 44 Tagen (C. riparius und C. yoshimatsui) bzw. ca. 100 Tagen (C. dilutus). |
| 2. | ⁴⁶⁸³Für diese Prüfmethode wird sowohl die Wasser- als auch Sedimentexposition beschrieben. ⁴⁶⁸⁴Die Wahl des Szenarios hängt von der intendierten Anwendung ab. ⁴⁶⁸⁵Die Exposition über Wasser durch Dotieren der Wassersäule soll Sprühverluste beim Aufbringen von Pestiziden simulieren. ⁴⁶⁸⁶Dieses Szenario erfasst die Ausgangsspitzen der Konzentration im Oberflächenwasser. ⁴⁶⁸⁷Die Dotierung des Wassers ist auch zur Simulation anderer Expositionstypen geeignet (einschließlich Austritt von Chemikalien). ⁴⁶⁸⁸Für Anreicherungsprozesse in Sedimenten über Zeiträume, die die Testdauer überschreiten, ist diese Prüfmethode hingegen nicht geeignet. ⁴⁶⁸⁹In diesem Fall sowie wenn die Pestizide vorwiegend durch Ablauf in Wasserkörper gelangen, kann ein Prüfprotokoll mit einem dotierten Sediment eher angemessen sein. ⁴⁶⁹⁰Sind andere Expositionsszenarien von Interesse, kann das Prüfprotokoll leicht entsprechend angepasst werden. ⁴⁶⁹¹Wenn die Verteilung der Prüfchemikalie zwischen der Wasserphase und der Sedimentschicht nicht von Belang ist und die Adsorption in das Sediment minimiert werden muss, kann die Verwendung eines künstlichen Sedimentsurrogats (z. B. Quarzsand) in Erwägung gezogen werden. |
| 3. | ⁴⁶⁹²An sedimentbewohnenden Organismen zu testende Chemikalien können in Sedimenten eine lange Persistenz haben. ⁴⁶⁹³Bei sedimentbewohnenden Organismen kommen mehrere Expositionspfade in Betracht. ⁴⁶⁹⁴Die relative Bedeutung der einzelnen Expositionspfade und die Geschwindigkeit, mit der diese jeweils zu den gesamten toxischen Wirkungen beitragen, hängen von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der betreffenden Chemikalie ab. ⁴⁶⁹⁵Bei stark absorbierenden Chemikalien und bei kovalent an das Sediment gebundenen Chemikalien kann die Aufnahme von Schadstoffen über die Nahrung einen wichtigen Expositionspfad darstellen. ⁴⁶⁹⁶Die Toxizität hoch lipophiler Chemikalien sollte nicht unterschätzt werden, weshalb gegebenenfalls vor Applikation der Prüfchemikalie dem Sediment Futter hinzugegeben werden sollte (siehe Nummer 31). ⁴⁶⁹⁷Daher können alle Expositionspfade und alle Lebensstadien berücksichtigt werden. |
| 4. | ⁴⁶⁹⁸Zu messende Endpunkte sind die Gesamtzahl der geschlüpften Imagines (1. und 2. ⁴⁶⁹⁹Generation), die Entwicklungsrate (1. und 2. ⁴⁷⁰⁰Generation), das Geschlechterverhältnis vollständig entwickelter und lebendiger adulter Tiere (1. und 2. ⁴⁷⁰¹Generation), die Anzahl der Eigelege pro weibliches Tier (nur 1. ⁴⁷⁰²Generation) und die Fertilität der Eigelege (1. ⁴⁷⁰³Generation). |
| 5. | Es wird nachdrücklich empfohlen, formuliertes Sediment zu verwenden, da es gegenüber natürlichen Sedimenten mehrere Vorteile hat:- —
- Die Variabilität zwischen den Versuchen ist weniger groß, da formuliertes Sediment eine reproduzierbare ‚standardisierte Matrix‘ ergibt und es nicht erforderlich ist, Quellen unkontaminierter, sauberer Sedimente ausfindig zu machen;
- —
- es kann jederzeit mit den Versuchen begonnen werden, ohne durch jahreszeitliche Schwankungen gestört zu werden und ohne dass eine Vorbehandlung zur Defaunierung des Sediments erforderlich wäre;
- —
- die Verwendung von formulierten Sedimenten reduziert die Kosten, die bei Feldprobenahmen ausreichender Sedimentmengen für Routineprüfungen anfallen;
- —
- die Verwendung formulierter Sedimente ermöglicht Toxizitätsvergleiche und die entsprechende Einstufung der Chemikalien (3).
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| 6. | Definitionen der verwendeten Begriffe sind Anlage 1 zu entnehmen. |
PRINZIP DER PRÜFUNG | 7. | ⁴⁷⁰⁶Chironomiden-Larven im ersten Larvenstadium (L1-Larven) werden einem bestimmten Konzentrationsbereich der Prüfchemikalie im Sediment-Wasser-System ausgesetzt. ⁴⁷⁰⁷Zu Beginn des Tests werden die L1-Larven (1. ⁴⁷⁰⁸Generation) in die Prüfgefäße mit dem dotierten Sediment gesetzt; alternativ kann die Prüfchemikalie auch erst nach dem Einsetzen der Larven zum Wasser hinzugegeben werden. ⁴⁷⁰⁹Die Schlupfrate, der Zeitraum bis zum Schlüpfen und das Geschlechterverhältnis der vollständig entwickelten und lebenden Mücken werden bestimmt. ⁴⁷¹⁰Die geschlüpften Imagines werden in Zuchtkäfige umgesetzt, um die Schwarmbildung, die Paarung und die Eiablage zu fördern. ⁴⁷¹¹Die Anzahl der entstandenen Eigelege und die Fertilität der Eigelege werden ermittelt. ⁴⁷¹²Aus diesen Eigelegen werden L1-Larven der 2. ⁴⁷¹³Generation im ersten Entwicklungsstadium entnommen. ⁴⁷¹⁴Die Larven werden in frisch vorbereitete Prüfgefäße gesetzt (Dotierung wie bei der 1. ⁴⁷¹⁵Generation), um die Lebensfähigkeit der 2. ⁴⁷¹⁶Generation anhand der Schlupfrate, des Zeitraums bis zur Emergenz und des Geschlechterverhältnisses der vollständig entwickelten und lebenden Mücken zu bestimmen. ⁴⁷¹⁷(Anlage 5 enthält Abbildungen zur Veranschaulichung des Lebenszyklustests.) Alle Daten werden entweder mit einem Regressionsmodell analysiert, um die Konzentration zu ermitteln, bei der sich für den relevanten Endpunkt eine Reduzierung um X % ergibt, oder einer Hypothesenprüfung zur Bestimmung der NOEC (höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung) unterzogen. ⁴⁷¹⁸Hierzu sind die Reaktionen der Prüfchemikalien anhand statistischer Tests mit der Reaktion der Kontrollen zu vergleichen. ⁴⁷¹⁹Bei der Prüfung mit dotiertem Wasser sind im Falle sich rasch abbauender Chemikalien die späteren Entwicklungsstadien der einzelnen Generationen (z. B. das Puppenstadium) unter Umständen erheblich niedrigeren Konzentrationen im Überstandswasser ausgesetzt als die Larven im ersten Entwicklungsstadium. Wenn dies als problematisch betrachtet und ein für alle Stadien vergleichbares Expositionsniveau benötigt wird, sind die folgenden Änderungen der Prüfmethode in Erwägung zu ziehen:- —
- parallele Versuche mit Dotierungen in unterschiedlichen Stadien oder
- —
- wiederholtes Dotieren (oder Erneuern des Überstandswassers) im Prüfsystem in beiden Testphasen (1. und 2. Generation); die Dotierungsintervalle (Erneuerungsintervalle) sind entsprechend der Beständigkeit der Prüfchemikalie anzupassen.
Die entsprechenden Änderungen können nur bei dem Verfahren mit dotiertem Wasser, nicht aber bei der Prüfung mit einem dotierten Sediment vorgenommen werden. |
INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 8. | ⁴⁷²²Wasserlöslichkeit und Dampfdruck der Prüfchemikalie und der log-Kow-Wert, die gemessene oder berechnete Verteilung der Prüfchemikalie im Sediment sowie ihre Stabilität im Wasser und im Sediment sollten bekannt sein. ⁴⁷²³Ein zuverlässiges analytisches Verfahren für die Quantifizierung der Prüfchemikalie im Überstandswasser, Porenwasser und Sediment mit bekannter und dokumentierter Genauigkeit und Nachweisgrenze sollte vorhanden sein. ⁴⁷²⁴Weitere nützliche Informationen sind z. B. die Strukturformel und der Reinheitsgrad der Prüfchemikalie. ⁴⁷²⁵Informationen über die Persistenz und das Verhalten der Prüfchemikalie in der Umwelt (zu beurteilen u. a. anhand der Verlustrate sowie des abiotischen und biotischen Abbaus). ⁴⁷²⁶Hinweise zu Prüfchemikalien mit physikalisch-chemischen Merkmalen, welche die Durchführung des Tests erschweren, sind Quelle (16) zu entnehmen. |
REFERENZCHEMIKALIEN | 9. | ⁴⁷²⁷Durch regelmäßige Tests mit Referenzchemikalien kann sichergestellt werden, dass sich die Empfindlichkeit der Laborpopulation nicht geändert hat. ⁴⁷²⁸Ebenso wie bei Daphnien ist ein akuter Test über eine Dauer von 48 h ausreichend (nach 17). ⁴⁷²⁹Solange noch keine validierte Leitlinie für einen Test zur akuten Toxizität verfügbar ist, kann auch ein Test zur Ermittlung der chronischen Toxizität (siehe in diesem Anhang Kapitel C.28) durchgeführt werden. ⁴⁷³⁰Die folgenden Referenzstoffe beispielsweise wurden erfolgreich in Ringtests und Validierungsstudien verwendet: Lindan, Trifluralin, Pentachlorphenol, Cadmiumchlorid und Kaliumchlorid (1)(3)(6)(7)(18). |
VALIDITÄT DES TESTS | 10. | Der Test ist gültig, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind:- —
- Die mittlere Schlupfrate in der Kontrolle muss am Ende der Expositionsdauer für beide Generationen mindestens 70 % betragen (1)(7);
- —
- bei C. riparius und C. yoshimatsui sollten mindestens 85 % aller Imagines der Kontrolle in beiden Generationen 12-23 Tage nach dem Einsetzen der L1-Larven in die Gefäße geschlüpft sein; bei C. dilutus sind 20-65 Tage annehmbar;
- —
- das mittlere Geschlechterverhältnis vollständig entwickelter und lebender Imagines (weiblicher bzw. männlicher Anteil) der Kontrolle muss bei beiden Generationen mindestens 0,4 betragen und sollte nicht über 0,6 liegen;
- —
- in jedem Zuchtkäfig muss die Anzahl der Eigelege in den Kontrollen der 1. Generation mindestens 0,6 für jedes in den Zuchtkräfig eingesetzte weibliche Tier betragen;
- —
- der Anteil der befruchteten Eigelege in jedem Zuchtkäfig der Kontrollen der 1. Generation muss mindestens bei 0,6 liegen;
- —
- am Ende der Expositionsdauer für beide Generationen sind in jedem Gefäß der pH-Wert und die Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu messen. Der Sauerstoffgehalt sollte mindestens 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswertes betragen, und der pH-Wert des Überstandswassers sollte in allen Prüfgefäßen zwischen 6 und 9 liegen;
- —
- die Wassertemperatur sollte um nicht mehr als ± 1,0 °C schwanken.
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BESCHREIBUNG DER METHODEPrüfgefäße und Zuchtkäfige
| 11. | ⁴⁷³³Die Larven werden der Prüfchemikalie in 600-ml-Glasbechergläsern mit einem Durchmesser von 8,5 cm ausgesetzt (siehe Anlage 5). ⁴⁷³⁴Andere Gefäße sind ebenfalls geeignet, sofern sie Überstandswasser und Sediment in entsprechender Höhe aufnehmen können. Die Sedimentoberfläche muss so bemessen sein, dass auf jede Larve 2-3 cm2 kommen. ⁴⁷³⁵Das Verhältnis zwischen Sedimentschicht und Überstandswasser beträgt 1:4. ⁴⁷³⁶Die Zuchtkäfige (B × H × T jeweils mindestens 30 cm) werden oben und mindestens auf einer Seite mit einer Gaze (Maschenweite ca. ⁴⁷³⁷1 mm) verschlossen (siehe Anlage 5). ⁴⁷³⁸In jeden Käfig wird eine 2-l-Kristallisierungsschale mit Testwasser und dem Sediment zur Eiablage gestellt. ⁴⁷³⁹Auch bei der Kristallisierungsschale muss das Verhältnis zwischen Sedimentschicht und Überstandswasser etwa 1:4 betragen. ⁴⁷⁴⁰Nachdem die Eigelege aus der Kristallisierungsschale entnommen wurden, werden sie in eine 12-Well Mikrotiterplatte gegeben (jeweils ein Eigelege pro Vertiefung mit jeweils mindestens 2,5 ml Wasser aus der dotierten Kristallisierungsschale); anschließend werden die Platten mit einem Deckel verschlossen, um signifikante Verdunstungsverluste auszuschließen. ⁴⁷⁴¹Alternativ können auch andere zur Aufnahme der Eigelege geeignete Gefäße verwendet werden. ⁴⁷⁴²Mit Ausnahme der Mikrotiterplatten müssen alle Prüfgefäße und sonstigen Geräte, die mit dem Prüfsystem in Kontakt kommen, vollständig aus Glas oder einem anderen chemisch inerten Material (z. B. Polytetrafluorethylen) bestehen. |
Auswahl der Prüfspezies | 12. | ⁴⁷⁴³Als Prüfspezies sollte bevorzugt Chironomus riparius eingesetzt werden. Alternativ kann auch C. yoshimatsui verwendet werden. C. dilutus ist ebenfalls geeignet, aber schwieriger zu handhaben und erfordert eine längere Prüfdauer. Einzelheiten zu den Anzuchtverfahren für C. riparius sind Anlage 2 zu entnehmen. Informationen zu Kulturbedingungen sind auch für C. dilutus (5) und C. yoshimatsui (14) verfügbar. ⁴⁷⁴⁸Die Identität der Spezies ist vor der Prüfung zu bestätigen, allerdings ist dies nicht vor jedem Test erforderlich, wenn die Organismen aus laboreigener Zucht stammen. |
Sediment | 13. | ⁴⁷⁴⁹Vorzugsweise ist formuliertes Sedimentmaterial (so genanntes rekonstituiertes, künstliches oder synthetisches Sediment) zu verwenden. ⁴⁷⁵⁰Wenn jedoch natürliches Sediment verwendet wird, so ist es zu charakterisieren (zumindest pH-Wert und Gehalt an organischem Kohlenstoff; die Bestimmung sonstiger Parameter wie C/N-Verhältnis und Granulometrie wird ebenfalls empfohlen). ⁴⁷⁵¹Das Sediment muss frei von Verunreinigungen sowie von Konkurrenten und Fressfeinden der Chironomidlarven sein. ⁴⁷⁵²Außerdem wird empfohlen, die Sedimente vor dem Versuch sieben Tage unter Testbedingungen zu akklimatisiern. Für den Versuch wird das folgende formulierte Sediment (siehe (1)) empfohlen (1)(20)(21):- a.
- 4-5 % (bezogen auf die Trockenmasse) Torf: so nahe wie möglich bei pH 5,5-6,0; wichtig: Torf in Pulverform, feingemahlen (Partikelgröße ≤ 1 mm) und nur luftgetrocknet, verwenden;
- b.
- 20 % (bezogen auf die Trockenmasse) Kaolin-Ton (Kaolingehalt vorzugsweise über 30 %);
- c.
- 75-76 % (bezogen auf die Trockenmasse) Quarzsand (hauptsächlich Feinsand, der zu mehr als 50 % eine Korngröße von 50-200 μm aufweist);
- d.
- der Feuchtegehalt der fertigen Mischung wird durch die Zugabe von entionisiertem Wasser auf einen Wert 30–50 % eingestellt;
- e.
- durch Zugabe von chemisch reinem Calciumcarbonat (CaCO3) wird die fertige Mischung des Sediments auf einen pH-Wert von 7,0 ± 0,5 eingestellt;
- f.
- der Gehalt der fertigen Mischung an organischem Kohlenstoff muss bei 2 % (± 0,5 %) liegen und ist durch Zugabe geeigneter Mengen Torf und Sand (siehe Buchstaben a und c) zu gewährleisten.
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| 14. | ⁴⁷⁵³Die Herkunft von Torf, Kaolin-Ton und Sand muss bekannt sein. ⁴⁷⁵⁴Die Bestandteile des Sediments sind auf chemische Verunreinigungen (z. B. durch Schwermetalle, chlororganische Verbindungen, phosphororganische Verbindungen) zu prüfen. ⁴⁷⁵⁵Ein Beispiel für die Herstellung des formulierten Sediments ist in Anlage 3 beschrieben. ⁴⁷⁵⁶Die Bestandteile können auch in trockenem Zustand gemischt werden, sofern nachgewiesen ist, dass es nach Zugabe des Überstandswassers nicht zu einer Auftrennung der Sedimentbestandteile kommt (z. B. mit aufschwimmenden Torfpartikeln) und dass der Torf bzw. das Sediment ausreichend konditioniert ist. |
Wasser | 15. | ⁴⁷⁵⁷Alle Wassersorten, die den chemischen Eigenschaften von zugelassenem Verdünnungswasser gemäß den Anlagen 2 und 4 entsprechen, sind als Testwasser geeignet. ⁴⁷⁵⁸Natürliches Wasser (Oberflächen- oder Grundwasser), rekonstituiertes Wasser (siehe Anlage 2) oder entchlortes Leitungswasser sind als Hälterungs- und Verdünnungswasser zulässig, wenn die Chironomiden hierin während der Zucht- und Testphase ohne Stressanzeichen überleben. Bei Testbeginn muss der pH-Wert des Testwassers zwischen 6 und 9 liegen, und die Gesamthärte des Wassers darf nicht mehr als 400 mg/l (in CaCO3) betragen. ⁴⁷⁵⁹Wird jedoch ein Ionenaustausch zwischen den Härteionen und der Prüfchemikalie vermutet, ist Wasser geringerer Härte zu verwenden (und somit in diesem Fall das Elendt-Medium M4 zu vermeiden). ⁴⁷⁶⁰Das Wasser muss über die gesamte Testdauer von gleichbleibender Qualität sein. ⁴⁷⁶¹Die Qualitätsparameter des Wassers gemäß Anlage 4 sind mindestens zweimal jährlich bzw. immer dann zu messen, wenn der Verdacht besteht, dass sie sich erheblich verändert haben. |
Stammlösungen — dotiertes Wasser | 16. a. | Die Prüfkonzentrationen werden auf der Grundlage der Konzentrationen in der Wassersäule, d. h. im Überstandswasser, berechnet. ⁴⁷⁶³Die Prüflösungen werden in der Regel durch Verdünnung einer Stammlösung in den gewünschten Konzentrationen zubereitet. ⁴⁷⁶⁴Stammlösungen sollten möglichst durch Auflösung der Prüfchemikalie im Testwasser hergestellt werden. ⁴⁷⁶⁵In einigen Fällen kann der Einsatz von Lösungs- oder Dispersionsmitteln erforderlich sein, um eine Stammlösung von geeigneter Konzentration zu erzielen. ⁴⁷⁶⁶Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Aceton, Ethylenglykol-Monoethylether, Ethylenglykol-Dimethylether, Dimethylformamid und Triethylenglykol. ⁴⁷⁶⁷Geeignete Dispersionsmittel sind etwa Cremophor RH40, Tween 80, Methylzellulose 0,01 % und HCO-40. ⁴⁷⁶⁸Die Konzentration des Lösungsvermittlers in dem endgültigen Prüfmedium sollte auf ein Mindestmaß (d. h. ≤ 0,1 ml/l) beschränkt und bei allen Behandlungen gleich sein. ⁴⁷⁶⁹Wird ein Lösungsvermittler verwendet, darf er keine signifikanten Wirkungen auf die Überlebensquote haben, was anhand einer Lösungsmittelkontrolle im Vergleich mit einer negativen (Wasser-)Kontrolle nachzuweisen ist. ⁴⁷⁷⁰Es sollten jedoch alle Anstrengungen unternommen werden, um den Einsatz derartiger Stoffe zu vermeiden. |
Stammlösungen — dotiertes Sediment | 16. b. | Die dotierten Sedimente der gewünschten Konzentration werden in der Regel zubereitet, indem eine Lösung der Prüfchemikalie direkt dem Sediment hinzugegeben wird. ⁴⁷⁷²Eine Stammlösung der in entionisiertem Wasser gelösten Prüfchemikalie wird mithilfe eines Walzwerks oder Futtermischers oder per Hand mit dem formulierten Sediment gemischt. ⁴⁷⁷³Wenn die Prüfchemikalie im Wasser schwer löslich ist, kann sie in dem kleinstmöglichen Volumen eines geeigneten organischen Lösungsmittels (z. B. Hexan, Aceton oder Chloroform) gelöst werden. ⁴⁷⁷⁴Diese Lösung wird anschließend mit 10 g feinem Quarzsand je Prüfgefäß gemischt. ⁴⁷⁷⁵Es wird abgewartet, bis das Lösungsmittel vollständig aus dem Sand verdunstet ist; danach wird der Sand mit einer geeigneten Menge des Sediments gemischt. ⁴⁷⁷⁶Um die Prüfchemikalie zu lösen, zu dispergieren oder zu emulgieren, dürfen nur sich leicht verflüchtigende Lösungsmittel verwendet werden. ⁴⁷⁷⁷Bei der Zubereitung des Sediments ist die in der Mischung von Prüfchemikalie und Sand enthaltene Sandmenge zu berücksichtigen (d. h. das Sediment sollte mit weniger Sand zubereitet werden). ⁴⁷⁷⁸Es ist darauf zu achten, dass die Prüfchemikalie mit dem Sediment gut durchmischt wird, damit sie in dem Sediment homogen verteilt ist. ⁴⁷⁷⁹Gegebenenfalls können Teilproben analysiert werden, um den Homogenitätsgrad zu bestimmen. |
VERSUCHSAUFBAU | 17. | Der Versuchsaufbau bezieht sich auf die gewählte Anzahl und den Abstand der Prüfkonzentrationen, die Anzahl der Prüfgefäße je Konzentration und die Anzahl der Larven je Gefäß sowie die Anzahl der Kristallisierungsschalen und der Zuchtkäfige. Im Folgenden wird der Versuchsaufbau für die Ermittlung der ECx und der NOEC sowie ein Limit-Test beschrieben. |
Versuchsaufbau für die Analyse durch Regression | 18. | ⁴⁷⁸¹Die Konzentration mit beobachteter Wirkung (ECx) und der für die Wirkung der betreffenden Prüfchemikalie relevante Konzentrationsbereich sind durch den Versuch abzudecken, damit der Endpunkt nicht über die erzeugten Daten hinaus extrapoliert werden muss. ⁴⁷⁸²Extrapolationen weit unter der niedrigsten oder über der höchsten Konzentration müssen vermeiden werden. ⁴⁷⁸³Ein Vorversuch nach den Prüfmethoden C.27 oder C.28 kann für die Auswahl eines geeigneten Konzentrationsbereichs hilfreich sein. |
| 19. | ⁴⁷⁸⁴Für die Bestimmung von ECx werden mindestens fünf Konzentrationen und acht Replikate pro Konzentration benötigt. ⁴⁷⁸⁵Für jede Konzentration müssen zwei Zuchtkäfige (A und B) verwendet werden. ⁴⁷⁸⁶Die acht Replikate werden in zwei Gruppen von jeweils vier Replikaten für die beiden Zuchtkäfige aufgeteilt. ⁴⁷⁸⁷Diese Zusammenführung der Replikate ist aufgrund der Anzahl der Mücken erforderlich, die pro Käfig benötigt werden, um die Reproduktionsleistung zuverlässig bestimmen zu können. ⁴⁷⁸⁸Für die 2. ⁴⁷⁸⁹Generation werden wieder acht Replikate verwendet, die aus den der Prüfchemikalie ausgesetzten Populationen in den Zuchtkäfigen hervorgegangen sind. ⁴⁷⁹⁰Die Konzentrationen dürfen sich höchstens um den Faktor 2 unterscheiden (eine Ausnahme könnte gemacht werden im Fall einer schwachen Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve). ⁴⁷⁹¹Die Anzahl der Replikate pro Behandlung kann auf sechs (drei pro Zuchtkäfig) reduziert werden, wenn die Anzahl der Prüfkonzentrationen mit unterschiedlicher Wirkung erhöht wird. Eine höhere Anzahl an Replikaten oder eine Verkürzung der Intervalle zwischen den Prüfkonzentrationen führt tendenziell zu engeren Konfidenzintervallen um den ECx-Wert. |
Versuchsaufbau für die Bestimmung einer NOEC | 20. | ⁴⁷⁹²Zur Bestimmung einer NOEC sind fünf Prüfkonzentrationen mit mindestens acht Replikaten (jeweils 4 pro Zuchtkäfig (A und B)) zu verwenden; der Abstandsfaktor zwischen den einzelnen Konzentrationen darf nicht größer als 2 sein. Die Anzahl der Replikate muss ausreichen, um eine angemessene statistische Aussagekraft zu gewährleisten, mit der sich eine Differenz von 20 % zur Kontrollkonzentration bei einem Signifikanzniveau von 5 % (α = 0,05) nachweisen lässt. ⁴⁷⁹³Die Entwicklungsrate, Fekundität und Fertilität können gewöhnlich mit einer Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Dunnett-oder Williams-Test ermittelt werden (22-25). ⁴⁷⁹⁴Zur Bestimmung der Schlupfrate und des Geschlechterverhältnisses können der Cochran-Armitage-Test, der Exakte Test nach Fisher (mit Bonferroni-Korrektur) oder der Mantel-Haenszel-Test durchgeführt werden. |
Limit-Test | 21. | ⁴⁷⁹⁵Falls der fakultative Vorversuch bis zu einer bestimmten Höchstkonzentration keine Wirkungen zeigt, kann ein Limit-Test (mit einer Prüfkonzentration und einer oder mehreren Kontrollen) durchgeführt werden. ⁴⁷⁹⁶Mit dem Limit-Test lassen sich etwaige toxische Wirkungen der Prüfchemikalie bei Konzentrationen oberhalb der getesteten Grenzkonzentration feststellen. ⁴⁷⁹⁷Für Wasser werden 100 mg/l und für Sedimente 1 000 mg/kg (bezogen auf die Trockenmasse) empfohlen. ⁴⁷⁹⁸In der Regel sind jeweils mindestens acht Replikate pro Behandlung und Kontrolle erforderlich. Es ist nachzuweisen, dass die statistische Aussagekraft ausreicht, um bei einem Signifikanzniveau von 5 % (α = 0,05) eine Differenz von 20 % zur Kontrollkonzentration festzustellen. ⁴⁷⁹⁹Für metrische Effektdaten (z. B. Entwicklungsrate) ist der t-Test eine geeignete statistische Methode, sofern die Daten die Bedingungen für diesen Test (Normalverteilung, Varianzhomogenität) erfüllen. ⁴⁸⁰⁰Sind diese Bedingungen nicht erfüllt, so kann ein t-Test für ungleiche Varianzen oder ein nicht-parametrischer Test wie der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test verwendet werden. ⁴⁸⁰¹Zur Bestimmung der Schlupfrate eignet sich der Exakte Test nach Fisher. |
DURCHFÜHRUNGExpositionsbedingungen
Herstellung des Wasser-Sediment-Systems (Dotieren des Wassers)
| 22. a. | Ein formuliertes Sediment (siehe Nummern 13 und 14 und Anlage 3) wird in einer mindestens 1,5 cm und höchstens 3 cm starken Schicht in die einzelnen Prüfgefäße und Kristallisierungsschalen gegeben. ⁴⁸⁰³(Bei den Kristallisierungsschalen kann die Schicht etwas dünner sein.) Anschließend wird so viel Wasser (siehe Nummer 15) hinzugegeben, dass das Verhältnis der Tiefe der Sedimentschicht zur Wassertiefe maximal 1:4 beträgt. ⁴⁸⁰⁴Nach der Vorbereitung der Prüfgefäße wird das Sediment-Wasser-System etwa sieben Tage moderat belüftet, bevor die L1-Larven der 1. und 2. ⁴⁸⁰⁵Generation eingesetzt werden (siehe Nummer 14 und Anlage 3). ⁴⁸⁰⁶Das Sediment-Wasser-System der Kristallisierungsschalen wird während des Tests nicht belüftet, da die Larven nicht am Leben erhalten zu werden brauchen. ⁴⁸⁰⁷(Die Eigelege werden bereits vor dem Schlüpfen entnommen.) Um zu verhindern, dass es während der Zugabe von Prüfwasser in die Wassersäule zu einer Auftrennung der Sedimentbestandteile und einer Resuspension der feinen Partikel kommt, kann das Sediment beim Einfüllen des Wassers mit einer Plastikschale abgedeckt werden. ⁴⁸⁰⁸Die Schale wird anschließend sofort entfernt. ⁴⁸⁰⁹Andere Hilfsmittel sind ebenfalls geeignet. |
Herstellung des Wasser-Sediment-Systems mit dotiertem Wasser | 22. b. | Entsprechend der Beschreibung in Nummer 16b wird dotiertes Sediment in die Prüfgefäße und in die Kristallisierungsschalen gegeben und anschließend mit Wasser bis zu einem Sediment-Wasser-Verhältnis von 1:4 überschichtet. ⁴⁸¹¹Das Sediment muss eine Tiefe von 1,5-3 cm haben. ⁴⁸¹²(In der Kristallisierungsschale kann die Schicht etwas dünner sein.) Um zu verhindern, dass es während der Zugabe von Prüfwasser in die Wassersäule zu einer Auftrennung der Sedimentbestandteile und einer Resuspension der feinen Partikel kommt, kann das Sediment beim Einfüllen des Wassers mit einer Plastikschale abgedeckt werden, die anschließend sofort entfernt wird. ⁴⁸¹³Andere Hilfsmittel können ebenfalls geeignet sein. ⁴⁸¹⁴Nach Fertigstellung des dotierten Sediments mit dem überschichteten Wasser ist abzuwarten, bis die Prüfchemikalie aus dem Sediment in die wässrige Phase partitioniert ist (4)(5)(7)(18). ⁴⁸¹⁵Dies sollte möglichst unter denselben Temperatur- und Belüftungsbedingungen wie im Versuch erfolgen. ⁴⁸¹⁶Die erforderliche Zeit für die Einstellung des Gleichgewichts hängt vom Sediment und der Chemikalie ab. ⁴⁸¹⁷Manchmal reichen ein paar Stunden oder Tage, in seltenen Fällen können aber auch mehrere Wochen (bis zu fünf) erforderlich sein. ⁴⁸¹⁸Es sollte nicht abgewartet werden, bis das Gleichgewicht hergestellt ist, da es in dieser Zeit bei vielen Chemikalien zu Abbauprozessen kommen kann. ⁴⁸¹⁹Empfohlen wird eine Wartezeit von 48 Std. ⁴⁸²⁰Wenn jedoch bekannt ist, dass die im Sediment enthaltene Chemikalie eine lange Abbau-Halbwertszeit hat (siehe Nummer 8), kann mehr Zeit für den Ausgleich vorgesehen werden. ⁴⁸²¹Am Ende dieser Gleichgewichtseinstellungszeit wird die Konzentration der Prüfchemikalie im Überstandswasser, im Porenwasser und im Sediment gemessen — mindestens in der höchsten Konzentration und einer niedrigeren Konzentration (siehe Nummer 38). ⁴⁸²²Diese analytischen Bestimmungen der Prüfchemikalie ermöglichen es, eine Massenbilanz zu berechnen und die Ergebnisse auf der Grundlage der gemessenen Konzentrationen darzustellen. |
| 23. | ⁴⁸²³Die Prüfgefäße werden abgedeckt (z. B. mit Glasplatten). ⁴⁸²⁴Um etwaige Verdunstungsverluste auszugleichen, kann während des Versuchs Wasser bis zum Ausgangsvolumen nachgefüllt werden. ⁴⁸²⁵Dazu ist destilliertes oder entionisiertes Wasser zu verwenden, damit sich keine Salze bilden. ⁴⁸²⁶Die Kristallisierungsschalen in den Zuchtkäfigen werden nicht abgedeckt; Wasserverluste während des Tests können (müssen aber nicht) ausgeglichen werden; die Eigelege kommen nämlich nur etwa einen Tag mit dem Wasser in Berührung, und die Schalen werden während des Tests nur kurze Zeit verwendet. |
Einsetzen der Prüforganismen | 24. | ⁴⁸²⁷Vier bis fünf Tage vor dem Einsetzen der L1-Larven werden Eigelege aus den Kulturen entnommen und in kleinen Gefäßen in das Kulturmedium eingesetzt. ⁴⁸²⁸Es kann ‚altes‘ Medium aus den Stammkulturen oder frisch zubereitetes Medium verwendet werden. ⁴⁸²⁹In jedem Fall ist eine geringe Futtermenge (z. B. einige Tröpfchen Filtrat einer fein gemahlenen Suspension aus Fischfutterflocken) zum Kulturmedium hinzuzugeben (siehe Anlage 2). ⁴⁸³⁰Es sollten nur frische Eigelege verwendet werden. Normalerweise beginnen die Larven einige Tage nach dem Einsetzen der Eier zu schlüpfen (C. riparius: 2-3 Tage bei 20 °C, C. tentans und C. yoshimatsui: 1-4 Tage bei 23 °C bzw. 25 °C) und durchlaufen während ihres Wachstums vier Stadien von jeweils 4-8 Tagen. ⁴⁸³²Für den Versuch sollten Larven des ersten Larvenstadiums (L1) (maximal 48 h nach dem Schlüpfen) verwendet werden. ⁴⁸³³Das Larvenstadium kann unter Umständen anhand der Kopfkapselbreite bestimmt werden (7). |
| 25. | ⁴⁸³⁴Jeweils 20 L1-Larven der 1. ⁴⁸³⁵Generation werden nach dem Zufallsprinzip mit einer stumpfen Pipette in die einzelnen Prüfgefäße mit dem Sediment-Wasser-System eingesetzt. ⁴⁸³⁶Während des Einsetzens der Larven in das Prüfgefäß und der folgenden 24 Stunden wird die Belüftung des Wassers abgestellt (siehe Nummer 32). Je nach Versuchsaufbau (siehe Nummern 19 und 20) werden pro Konzentration für die Ermittlung der ECx-Werte mindestens 120 Larven (6 Replikate pro Konzentration) und zur Bestimmung der NOEC mindestens 160 Larven (8 Replikate pro Konzentration) verwendet. ⁴⁸³⁷Bei dem Versuchsaufbau mit dem dotierten Sediment beginnt die Exposition mit dem Einsetzen der Larven. |
Dotieren des Überstandswassers | 26. | ⁴⁸³⁸24 Stunden nach dem Einsetzen der L1-Larven der 1. ⁴⁸³⁹Generation wird die Prüfchemikalie in die überstehende Wassersäule dotiert und das System wird erneut schwach belüftet (zu möglichen Änderungen des Test Designs siehe Nummer 7). ⁴⁸⁴⁰Kleine Mengen der Stammlösungen mit der Prüfchemikalie werden unterhalb der Oberfläche der Wassersäule pipettiert. ⁴⁸⁴¹Anschließend wird das Überstandswasser vorsichtig gemischt, um das Sediment nicht aufzuwirbeln. ⁴⁸⁴²Beim Versuch mit dem dotierten Wasser beginnt die Exposition mit dem Dotieren des Wassers (d. ⁴⁸⁴³h einen Tag nach Einsetzen der Larven). |
Entnahme geschlüpfter Imagines | 27. | ⁴⁸⁴⁴Geschlüpfte Mücken der 1. ⁴⁸⁴⁵Generation werden mindestens einmal, vorzugsweise sogar zweimal täglich mit einem Sauggerät, einem Abzug oder einem ähnlichen Gerät aus den Prüfgefäßen abgesaugt (Paragraf 36) (siehe Anlage 5). ⁴⁸⁴⁶Dabei ist darauf zu achten, dass die Imagines nicht beschädigt werden. ⁴⁸⁴⁷Die abgesaugten Mücken aus vier Prüfgefäßen jeweils einer Konzentration werden in den Zuchtkäfig entlassen, dem sie bereits vorher zugeordnet waren. ⁴⁸⁴⁸Am Tag, an dem die ersten (männlichen) Imagines schlüpfen, werden die Kristallisierungsgefäße dotiert, indem eine kleine Menge der Stammlösung mit der Prüfchemikalie unter die Wasseroberfläche pipettiert wird (bei dem Versuchsaufbau mit dem dotierten Wasser). ⁴⁸⁴⁹Anschließend wird das Überstandswasser vorsichtig gemischt, um das Sediment nicht aufzuwirbeln. ⁴⁸⁵⁰Die nominelle Konzentration der Prüfchemikalie im Kristallisierungsgefäß stimmt mit der der Gefäße mit den Prüfkonzentrationen überein, die dem jeweiligen Zuchtkäfig zugeordnet sind. ⁴⁸⁵¹Bei dem Versuchsaufbau mit dem dotierten Sediment werden die Kristallisierungsschalen um Tag 11 nach Beginn der Exposition (d. h. nach Einsetzen der Larven der 1. ⁴⁸⁵²Generation) angesetzt, damit sie im Laufe von etwa 48 Stunden ein Gleichgewicht erreichen, bevor die ersten Eigelege abgelegt werden. |
| 28. | ⁴⁸⁵³Die Eigelege werden mit einer Pinzette oder einer stumpfen Pipette aus der Kristallisierungsschale im Zuchtkäfig entnommen. ⁴⁸⁵⁴Jedes Eigelege wird einzeln in ein Gefäß mit dem Kulturmedium aus der Kristallisierungsschale gebracht, aus der es auch entnommen wurde (z. B. eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 12 Vertiefungen mit mindestens 2,5 ml des Mediums). ⁴⁸⁵⁵Die Gefäße mit den Eigelegen werden mit einem Deckel verschlossen, um eine signifikante Verdunstung zu verhindern. ⁴⁸⁵⁶Die Eigelege werden mindestens sechs Tage nach der Ablage zur Beobachtung aufbewahrt, um sie als befruchtet oder unbefruchtes zu klassifizieren.⁴⁸⁵⁷Als Ausgangsmaterial für die 2. ⁴⁸⁵⁸Generation werden aus jedem Zuchtkäfig mindestens drei, vorzugsweise jedoch sechs befruchtete Eigelege entnommen; anschließend wird etwas Futter bereitgestellt und gewartet, bis die Mücken schlüpfen. ⁴⁸⁵⁹Die Eigelege sollten zum Höhepunkt der Eiablage entstanden sein; dieser liegt bei den Kontrollen gewöhnlich um Tag 19 des Tests. ⁴⁸⁶⁰Im Idealfall wird mit dem Aufbau der 2. ⁴⁸⁶¹Generation sämtlicher Konzentrationen der Prüfchemikalie am selben Tag begonnen; aufgrund chemischer Wirkungen auf die Entwicklung der Larven ist dies unter Umständen jedoch nicht immer möglich. ⁴⁸⁶²In diesen Fällen kann der Aufbau in den höheren Konzentrationen später begonnen werden als bei den niedrigeren Konzentrationen und bei der (Lösungsmittel-)Kontrolle.
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| 29. a. | Beim Versuch mit dem dotierten Wasser wird das Sediment-Wasser-System für die Larven der 2. ⁴⁸⁶⁴Generation hergestellt, indem etwa eine Stunde vor dem Einsetzen der L1-Larven in die Prüfgefäße die Prüfchemikalie in das Überstandswasser dotiert wird. ⁴⁸⁶⁵Kleine Mengen der Lösungen mit der Prüfchemikalie werden unterhalb der Oberfläche der Wassersäule pipettiert. ⁴⁸⁶⁶Anschließend wird das Überstandswasser vorsichtig gemischt, um das Sediment nicht aufzuwirbeln. ⁴⁸⁶⁷Nach dem Dotieren erfolgt eine schwache Belüftung. |
| 29. b. | Beim Versuch mit dem dotierten Sediment werden die Expositionsgefäße mit dem Sediment-Wasser-System für Larven der 2. ⁴⁸⁶⁹Generation auf die gleiche Weise vorbereitet wie für die Larven der 1. ⁴⁸⁷⁰Generation. |
| 30. | ⁴⁸⁷¹Jeweils 20 L1-Larven der 2. ⁴⁸⁷²Generation werden spätestens 48 h nach dem Schlüpfen nach dem Zufallsprinzip mit einer stumpfen Pipette in die einzelnen Prüfgefäße mit dem dotierten Sediment-Wasser-System eingesetzt. ⁴⁸⁷³Während des Einsetzens der L1-Larven in das Prüfgefäß und der folgenden 24 Std. ⁴⁸⁷⁴wird die Belüftung gestoppt. Je nach Prüfprotokoll (siehe Nummern 19 und 20) werden pro Konzentration für die Ermittlung der ECx-Werte mindestens 120 Larven (6 Replikate pro Konzentration) und zur Bestimmung der NOEC mindestens 160 Larven (8 Replikate pro Konzentration) verwendet. |
Futter | 31. | ⁴⁸⁷⁵Die Larven in den Prüfgefäßen müssen täglich, mindestens jedoch dreimal pro Woche gefüttert werden. Pro juvenile Larve und Tag sind in den ersten 10 Tagen ihres Lebenszyklus 0,25-0,5 mg (bzw. 0,35-0,5 mg bei C. yoshimatsui) Fischfutter (suspendiert in Wasser oder fein gemahlenen, z. B. Tetra-Min oder Tetra-Phyll; siehe Anlage 2) angemessen. ⁴⁸⁷⁷Ältere Larven benötigen etwas mehr Nahrung. ⁴⁸⁷⁸Für den Rest des Versuchs dürften 0,5-1,0 mg Futter pro Larve und Tag ausreichen. ⁴⁸⁷⁹Bei Pilzbesatz oder Absterben von Kontrollorganismen wird die Futterration für alle behandelten Organismen und Kontrollorganismen reduziert. ⁴⁸⁸⁰Lässt sich die Pilzentwicklung nicht stoppen, muss der Versuch wiederholt werden.⁴⁸⁸¹Die toxikologische Relevanz der Exposition durch Aufnahme mit dem Futter ist im Allgemeinen höher bei Chemikalien mit hoher Affinität für organischen Kohlenstoff und bei Chemikalien mit kovalenter Bindung an das Sediment. ⁴⁸⁸²Wenn Chemikalien mit diesen Eigenschaften getestet werden, kann die Menge an Futter, die zur Gewährleistung des Überlebens und einer natürlichen Wachstumsentwicklung der Larven benötigt wird, je nach regulatorischen Anforderungen vor der Stabilisierungsphase zum formulierten Sediment hinzugegeben werden. Um eine Beeinträchtigung der Wasserqualität zu verhindern, wird das Fischfutter durch pflanzliches Material ersetzt, z. B. durch Zugabe von 0,5 % (Trockenmasse) feingeriebenen Blättern z. B. von Brennnessel (Urtica dioeca), Maulbeere (Morus alba), Weißklee (Trifolium repens) oder Spinat (Spinacia oleracea) oder von sonstigem pflanzlichen Material (Cerophyl oder Alphacellulose). ⁴⁸⁸³Die Zugabe der gesamten Menge eines organischen Futters zum Sediment noch vor dem Dotieren ist für die Wasserqualität und die biologischen Parameter (21) nicht unerheblich und stellt auch keine standardisierte Methode dar. ⁴⁸⁸⁴Neuere Studien lassen jedoch darauf schließen, dass diese Methode funktioniert (19)(26). ⁴⁸⁸⁵Imagines im Zuchtkäfig brauchen normalerweise kein Futter; die Fekundität und die Fertilität verbessern sich jedoch, wenn ein in gesättigter Saccharoselösung getränktes Wattepad als Futterquelle für die adulten Mücken bereitgestellt wird (34).
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Inkubationsbedingungen | 32. | ⁴⁸⁸⁶Das Überstandswasser in den Prüfgefäßen wird 24 Stunden nach dem Einsetzen der L1-Larven beider Generationen über den gesamten Versuchszeitraum moderat belüftet. ⁴⁸⁸⁷(Es ist darauf zu achten, dass die Konzentration an gelöstem Sauerstoff nicht unter 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswertes fällt.) Die Belüftung erfolgt mit einigen Blasen pro Sekunde durch eine gläserne Pasteur-Pipette, deren Öffnung 2-3 cm über der Sedimentschicht angesetzt wird. ⁴⁸⁸⁸Wenn flüchtige Chemikalien getestet werden, ist darauf zu achten, dass das Sediment-Wasser-System nicht belüftet wird; trotzdem muss allerdings das Validitätskriterium eines Luftsauerstoff-Sättigungswerts von mindestens 60 % (Nummer 10) erfüllt sein. ⁴⁸⁸⁹Weitere Informationen sind Quelle (16) zu entnehmen. |
| 33. | Der Test mit C. riparius wird bei einer konstanten Raumtemperatur von 20 ± 2 °C durchgeführt. Für C. dilutus und C. yoshimatsui wird eine Temperatur von 23 bzw. 25 ± 2 °C) empfohlen. ⁴⁸⁹²Die Photoperiode beträgt 16 Std. ⁴⁸⁹³und die Beleuchtungsstärke 500-1 000 lux. ⁴⁸⁹⁴Für die Zuchtkäfige kann jeweils morgens und abends eine einstündige Dämmerungsphase eingerichtet werden. |
Expositionsdauer | 34. | ⁴⁸⁹⁵Versuch mit dotiertem Wasser: Die Expositionsdauer für die 1. ⁴⁸⁹⁶Generation beginnt, wenn die Prüfchemikalie in das Überstandswasser der Prüfgefäße dotiert wird (d. h. einen Tag nach Einsetzen der Larven; zu möglichen Änderungen des Expositionsaufbaus siehe Nummer 7). ⁴⁸⁹⁷Die Exposition der 2. ⁴⁸⁹⁸Generation beginnt sofort, da diese Larven in ein bereits dotiertes Sediment-Wasser-System eingesetzt werden. Bei C. riparius und C. yoshimatsui beträgt die maximale Expositionsdauer für die 1. ⁴⁹⁰⁰Generation 27 Tage und für die 2. ⁴⁹⁰¹Generation 28 Tage. ⁴⁹⁰²(Die Larven der 1. ⁴⁹⁰³Generation verbringen einen Tag ohne Exposition in den Gefäßen). ⁴⁹⁰⁴Aufgrund der Überschneidung ergibt sich eine Testdauer von insgesamt etwa 44 Tagen. Bei C. dilutus dauert die Exposition höchstens 64 bzw. 65 Tage (1. ⁴⁹⁰⁶bzw. 2. Generation). ⁴⁹⁰⁷Die Gesamtdauer beträgt etwa 100 Tage.Versuch mit dotiertem Sediment: Die Exposition beginnt mit dem Einsetzen der Larven und dauert bei C. riparius und C. yoshimatsui bei beiden Generationen höchstens 28 Tage und bei C. dilutus, ebenfalls beide Generationen, höchstens 65 Tage.
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BeobachtungenSchlupf
| 35. | ⁴⁹⁰⁹Es werden die Entwicklungsdauer und die Anzahl der vollständig geschlüpften lebenden männlichen und weiblichen Mücken in beiden Generationen bestimmt. ⁴⁹¹⁰Männchen sind leicht an den gefiederten Antennen und an ihrem schlanken Körper zu erkennen. |
| 36. | ⁴⁹¹¹Die Prüfgefäße sind bei beiden Generationen dreimal wöchentlich visuell auf Verhaltensänderungen der Larven (z. B. Verlassen des Sediments, ungewöhnliches Schwimmverhalten) gegenüber den Kontrollgefäßen zu prüfen. Während der Emergenzphase, die bei C. riparius und C. yoshimatsui etwa 12 Tage und bei C. dilutus etwa 20 Tage nach dem Einsetzen der Larven beginnt, werden die Imagines gezählt und mindestens einmal, vorzugsweise aber zweimal täglich (am frühen Morgen und am späten Nachmittag) nach Geschlechtern unterschieden. ⁴⁹¹³Nach der Unterscheidung werden die Mücken der 1. ⁴⁹¹⁴Generation sorgfältig aus den Gefäßen entnommen und in einen Zuchtkäfig gebracht. ⁴⁹¹⁵Mücken der 2. ⁴⁹¹⁶Generation werden entnommen und nach der Identifizierung getötet. ⁴⁹¹⁷In den Prüfgefäßen gelegte Eigelege der 1. ⁴⁹¹⁸Generation werden einzeln abgelesen und mit mindestens 2,5 ml nativem Wasser in Mikrotiterplatten mit 12 Vertiefungen (oder sonstige geeignete Gefäße) gelegt; diese werden anschließend mit einem Deckel verschlossen, um wesentliche Verdunstungsverluste zu vermeiden. ⁴⁹¹⁹Die Anzahl der toten Larven und der sichtbaren Puppen, die nicht geschlüpft sind, wird ebenfalls protokolliert. ⁴⁹²⁰Beispiele für Zuchtkäfige, Prüfgefäße und Absaugvorrichtungen werden in Anlage 5 beschrieben. |
Reproduktion | 37. | ⁴⁹²¹Die Wirkung auf die Reproduktion wird anhand der Anzahl der von Mücken der 1. ⁴⁹²²Generation gelegten Eigelege und der Fertilität dieser Eigelege beurteilt. ⁴⁹²³Einmal täglich werden die Eigelege von der in den Zuchtbehältnissen befindlichen Kristallisierungsschale abgelesen. ⁴⁹²⁴Die Eigelege werden entnommen und mit mindestens 2,5 ml nativem Wasser in eine Mikrotiterplatte mit 12 Vertiefungen (jeweils ein Eigelege pro Vertiefung) oder in sonstige geeignete Gefäße gesetzt; diese werden mit einem Deckel verschlossen, um signifikante Verdunstungsverluste zu vermeiden. ⁴⁹²⁵Für jedes Eigelege werden folgende Merkmale dokumentiert: Tag der Entstehung, Größe (normal, d. h. 1,0 ± 0,3 cm oder kurz; in der Regel ≤ 0,5 cm) und Struktur (normal = bananenförmig mit spiraligem Eigelege oder anomal z. B. nicht mit spiraligem Eigelege) sowie Fertilität (befruchtet oder unbefruchtet). ⁴⁹²⁶Im Laufe von sechs Tagen nach der Ablage wird geprüft, ob die Eigelege befruchtet sind. ⁴⁹²⁷Ein Eigelege wird dann als befruchtet betrachtet, wenn aus mindestens einem Drittel aller Eier Mücken schlüpfen. ⁴⁹²⁸Aufgrund der Gesamtzahl der in den Zuchtkäfig eingesetzten Weibchen werden die Anzahl der Eigelege pro Weibchen und die Anzahl der befruchteten Eigelege pro Weibchen berechnet. ⁴⁹²⁹Erforderlichenfalls kann die Anzahl der Eier eines Eigeleges mit der Ringzählmethode zerstörungsfrei geschätzt werden (siehe Beschreibung in den Nummern 32 und 33). |
AnalysemessungenKonzentration der Prüfchemikalie
| 38. | ⁴⁹³⁰Als minimale Anforderung müssen zu Beginn der Exposition (bei dotiertem Wasser vorzugsweise eine Stunde nach Applikation der Prüfchemikalie) und am Ende des Versuchs Proben des Überstandswassers, des Porenwassers und des Sediments mindestens in der höchsten Konzentration und in einer niedrigeren Konzentration analysiert werden. ⁴⁹³¹Dies gilt für Gefäße beider Generationen. ⁴⁹³²Aus den Kristallisierungsschalen im Zuchtkäfig wird nur das Überstandswasser analysiert, da die Eigelege nur mit diesem Wasser in Berührung kommen. ⁴⁹³³(Bei dem Versuch mit dotiertem Sediment kann eine analytische Bestätigung der Sedimentkonzentration vorgenommen werden.) Wenn erforderlich, können während des Versuchs weitere Messungen des Sediments, des Porenwassers oder des Überstandswassers vorgenommen werden. ⁴⁹³⁴Diese Bestimmung der Konzentration der Prüfchemikalie gibt Aufschluss über das Verhalten/die Verteilung der Prüfchemikalie im Wasser-Sediment-System. ⁴⁹³⁵Wenn zu Beginn und während des Versuchs (siehe Nummer 39) Proben aus dem Sediment und aus dem Porenwasser entnommen und analysiert werden sollen, müssen zusätzliche Prüfgefäße verfügbar sein. ⁴⁹³⁶Messungen des Sediments bei dem Versuchsaufbau mit dem dotierten Wasser sind möglicherweise nicht erforderlich, wenn die Verteilung der Prüfchemikalie zwischen Wasser und Sediment in einer Wasser-/Sediment-Untersuchung unter vergleichbaren Bedingungen eindeutig bestimmt wurde (z. B. Verhältnis Sediment/Wasser, Applikationsform, Gehalt des Sediments an organischem Kohlenstoff) oder wenn die gemessenen Konzentrationen im Überstandswasser ständig im Bereich von 80-120 % der nominellen Konzentration oder der gemessenen Ausgangskonzentration liegen. |
| 39. | ⁴⁹³⁷Falls Zwischenmessungen (z. B. am 7. ⁴⁹³⁸und/oder am 14. Tag) vorgenommen werden und für die Analyse größere Proben erforderlich sind, die nicht aus den Prüfgefäßen entnommen werden können, ohne das Prüfsystem zu beeinflussen, sollten die Analysemessungen an Proben aus zusätzlichen Prüfgefäßen vorgenommen werden, die derselben Behandlung (einschließlich Präsenz von Testorganismen) unterzogen, aber nicht für biologische Beobachtungen verwendet wurden. |
| 40. | ⁴⁹³⁹Eine 30-minütige Zentrifugation bei z. B. 10 000 g und 4 °C wird empfohlen, um das Interstitialwasser (= Porenwasser) abzutrennen. ⁴⁹⁴⁰Prüfchemikalien, die sich nachweislich nicht an Filtern anlagern, können aber auch filtriert werden. ⁴⁹⁴¹Bei zu kleinen Proben kann es passieren, dass sich die Konzentrationen im Porenwasser nicht analysieren lassen. |
Physikalisch-chemische Parameter | 41. | ⁴⁹⁴²pH-Wert, gelöster Sauerstoff im Testwasser und Temperatur des Wassers in den Prüfgefäßen und in den Kristallisierungsschalen sind auf geeignete Weise zu messen (siehe Nummer 10). ⁴⁹⁴³Zu Beginn und am Ende des Versuchs sind Härte und Ammonium-Gehalt bei der höchsten Konzentration und in den Kontrollgefäßen in einem Prüfgefäß und einer Kristallisierungsschale zu bestimmen. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 42. | ⁴⁹⁴⁴Mit diesem Lebenszyklustest sollen die Wirkung der Prüfchemikalie auf die Reproduktion sowie — für zwei Generationen — die Entwicklungsrate und die Gesamtzahl der vollständig geschlüpften lebenden männlichen und weiblichen Mücken ermittelt werden. ⁴⁹⁴⁵Zur Ermittlung der Schlupfrate werden die Daten männlicher und weiblicher Imagines zusammengefasst. ⁴⁹⁴⁶Wenn keine statistisch signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Empfindlichkeiten der Entwicklungsraten der beiden Geschlechter bestehen, können die Ergebnisse für männliche und weibliche Mücken in der statistischen Analyse zusammengefasst werden. |
| 43. | ⁴⁹⁴⁷Die Effektkonzentrationen werden ausgedrückt als Konzentrationen im Überstandswasser (bei dotiertem Wasser) bzw. im Sediment (bei dotiertem Sediment) und gewöhnlich ausgehend von den zu Beginn der Exposition gemessenen Konzentrationen (siehe Nummer 38) berechnet. ⁴⁹⁴⁸Daher werden die für dotiertes Wasser gewöhnlich zu Beginn der Exposition bei beiden Generationen im Überstandswasser der Gefäße gemessenen Konzentrationen und die Konzentrationen der Kristallisierungsschalen für jede Konzentrationsstufe gemittelt. ⁴⁹⁴⁹Die Konzentrationen für dotierte Sedimente werden gewöhnlich zu Beginn der Exposition bei beiden Generationen in den Gefäßen (sowie optional in den Kristallisierungsschalen) gemessen und für jede Behandlung gemittelt. |
| 44. | ⁴⁹⁵⁰Für eine Punktschätzung (d. h. zur Ermittlung einer ECx-Konzentration) können die für die einzelnen Gefäße und Zuchtkäfige erstellten Statistiken als echte Replikate dienen. ⁴⁹⁵¹Bei der Berechnung eines Konfidenzintervalls für einen beliebigen ECx-Wert ist die Variabilität zwischen den Gefäßen zu berücksichtigen oder nachzuweisen, dass diese Variabilität so klein ist, dass sie übergangen werden kann. ⁴⁹⁵²Wird das Modell nach der Methode der geringsten Abweichungsquadrate angepasst, sollten die pro Gefäß erstellten Statistiken transformiert werden, um die Varianzhomogenität zu verbessern. Allerdings werden die ECx-Werte berechnet, nachdem die Ergebnisse auf den ursprünglichen Wert rücktransformiert wurden (11). |
| 45. | ⁴⁹⁵³Wenn die statistische Analyse darauf abzielt, die NOEC anhand von Hypothesenprüfungen zu bestimmen, ist die Variabilität zwischen den Prüfgefäßen zu berücksichtigen, z. B. mit ANOVA-Methoden (etwa dem Williams- oder dem Dunnett-Test). ⁴⁹⁵⁴Der Williams-Test ist dann geeignet, wenn theoretisch eine monotone Dosis-Wirkungs-Beziehung zu erwarten wäre; der Dunnett-Test wird durchgeführt, wenn sich die Hypothese der Monotonie nicht bestätigt. ⁴⁹⁵⁵Alternativ können in den Fällen, in denen von den herkömmlichen ANOVA-Annahmen abgewichen wird, robustere Tests (27) angewendet werden (31). |
Schlupfrate | 46. | ⁴⁹⁵⁶Schlupfraten sind quantale Daten und können anhand des Cochran-Armitage-Tests im Step-Down-Verfahren analysiert werden, wenn eine monotone Dosis-Antwort erwartet wird und die Schlupfdaten dieser Erwartung entsprechen. ⁴⁹⁵⁷Andernfalls können ein Exakter Test nach Fisher oder ein Mantel-Haenszel-Test mit Bonferroni-Holm-angepassten p-Werten durchgeführt werden. ⁴⁹⁵⁸Ist die Varianz zwischen den Replikaten mit derselben Konzentration nachweislich größer als bei einer Binomialverteilung zu erwarten (häufig als ‚extra-binomiale‘ Variation bezeichnet), sollte ein robusterer Test (Cochran-Armitage-Test oder Exakter Test nach Fisher), wie in (27) vorgeschlagen, vorgenommen werden.Die Summe geschlüpfter lebender männlicher und weiblicher Mücken (ne) je Prüfgefäß wird bestimmt und durch die Anzahl der eingesetzten Larven (na) dividiert:
Dabei sind:
| ER | = | Schlupfrate | | ne | = | Anzahl der geschlüpften lebenden Mücken je Prüfgefäß | | na | = | Anzahl der eingesetzten Larven je Prüfgefäß (normalerweise 20) |
Wenn ne größer als na ist (d. h., wenn versehentlich mehr als die vorgesehene Anzahl an Larven eingesetzt wurde), muss na an ne angepasst werden. |
| 47. | ⁴⁹⁶⁰Ein alternativer Ansatz, der sich insbesondere für große Proben mit erweiterter Binomialvarianz empfiehlt, ist die Behandlung der Schlupfrate als kontinuierliche Reaktion und die Verwendung entsprechender Verfahren. ⁴⁹⁶¹Als große Probe gilt hier eine Probe, bei der die Anzahl der geschlüpften Mücken und die Anzahl der nicht geschlüpften Mücken jeweils mehr als fünf pro Replikat(gefäß) beträgt. |
| 48. | ⁴⁹⁶²Für die Anwendung von ANOVA-Methoden sollten die ER-Werte zunächst einer Arcus-Sinus-Transformation oder einer Freeman-Tukey-Transformation unterzogen werden, um annähernd eine Normalverteilung und Varianzhomogenität zu erreichen. ⁴⁹⁶³Bei der Verwendung von absoluten Frequenzen können auch der Cochran-Armitage-, der Exakte Test nach Fisher (mit Bonferroni-Korrektur) oder der Mantel-Haenszel-Test angewendet werden. Bei der Arcus-Sinus-Transformation wird die Umkehrfunktion des Sinus (sin– 1) der Wurzel von ER berechnet. |
| 49. | ⁴⁹⁶⁴Für die Schlupfraten werden die ECx-Werte durch Regressionsanalysen bestimmt (z. B. Probit-, Logit- oder Weibull-Modell (28)). ⁴⁹⁶⁵Versagt die Regressionsanalyse (z. B. bei weniger als zwei Teilantworten), können andere nicht-parametrische Methoden wie die Berechnung des gleitenden Durchschnitts oder eine einfache Interpolation angewendet werden. |
Entwicklungsrate | 50. | ⁴⁹⁶⁶Die mittlere Entwicklungszeit ist die mittlere Zeitspanne zwischen dem Einsetzen der Larven (Tag 0 des Tests) und dem Schlüpfen der Mückenkohorte. ⁴⁹⁶⁷(Zur Berechnung der tatsächlichen Entwicklungszeit ist das Alter der Larven zum Zeitpunkt des Einsetzens zu berücksichtigen.) Die Entwicklungsrate ist der Reziprokwert der Entwicklungszeit (Einheit: 1/Tag) und bezeichnet den Anteil der täglich entstehenden Larven. ⁴⁹⁶⁸Für die Bewertung der Sedimenttoxizität ist die Entwicklungsrate zu bevorzugen, da sie gegenüber der Entwicklungszeit eine geringere Varianz aufweist und ihre Werte homogener sind und näher an der Normalverteilung liegen. ⁴⁹⁶⁹Aus diesem Grund eignen sich leistungsfähigere parametrische Verfahren mit großer Teststärke eher für die Entwicklungsrate als für die Entwicklungszeit. Wird die Entwicklungsrate als kontinuierliche Antwort behandelt, können die ECx-Werte mittels Regressionsanalyse geschätzt werden (z. B. (29)(30)). ⁴⁹⁷⁰Eine NOEC für die mittlere Entwicklungsrate kann mit einer ANOVA (z. B. mit einem Williams- oder einem Dunnett-Test) ermittelt werden. ⁴⁹⁷¹Da männliche Imagines früher schlüpfen als weibliche und da sich entsprechend für Männchen eine höhere Entwicklungsrate ergibt, ist es sinnvoll, die Entwicklungsraten nicht nur für die Imagines insgesamt, sondern auch getrennt nach Geschlechtern zu ermitteln. |
| 51. | Für statistische Tests gilt die Anzahl der am Kontrolltag x beobachteten Mücken als die Anzahl der Mücken, die in der Mitte des Zeitintervalls zwischen dem Tag x und dem Tag x – l geschlüpft sind (l = Länge des Kontrollintervalls, gewöhnlich 1 Tag). Die mittlere Entwicklungsrate je Prüfgefäß ( ) wird wie folgt berechnet:
Dabei sind:
| : | mittlere Entwicklungsrate je Prüfgefäß | | i | : | Index des Kontrollintervalls | | m | : | maximale Anzahl der Kontrollintervalle | | fi | : | Anzahl der Mücken, die im Kontrollintervall i geschlüpft sind | | ne | : | Gesamtzahl der geschlüpften Mücken bei Versuchsende (=Σfi) | | xi | : | Entwicklungsrate der geschlüpften Mücken im Intervall i |
 Dabei sind:
| Tagi | : | Tag der Inspektion (Tage seit Einsetzen der Larven) | | li | : | Länge des Kontrollintervalls i (Tage, in der Regel 1 Tag) |
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Geschlechterverhältnis | 52. | ⁴⁹⁷³Die Geschlechterverhältnisse sind quantale Daten und daher durch einen Exakten Test nach Fisher oder durch sonstige geeignete Methoden zu bestimmen. Das natürliche Geschlechterverhältnis ist bei C. riparius gleich 1, d. h. männliche und weibliche Mücken sind gleich häufig. ⁴⁹⁷⁵Bei beiden Generationen sind die Daten zum Geschlechterverhältnis gleich zu behandeln. ⁴⁹⁷⁶Da die maximale Anzahl der Mücken pro Gefäß (d. h. 20) für eine aussagekräftige statistische Analyse zu gering ist, wird die Gesamtzahl der vollständig geschlüpften und lebenden Mücken für beide Geschlechter in allen Gefäßen mit jeweils einer Prüfkonzentration summiert. ⁴⁹⁷⁷Diese nicht transformierten Daten werden dann in einer Häufigkeitstabelle (2 × 2) bezogen auf die (Lösungsmittel-)Kontrolle oder auf die gepoolten Daten der Kontrollen erneut geprüft. |
Reproduktion | 53. | ⁴⁹⁷⁸Die Reproduktion (gemessen als Fekundität) wird an der Anzahl der Eigelege pro Weibchen gemessen. ⁴⁹⁷⁹Die Gesamtzahl der in einem Zuchtkäfig gelegten Eigelege wird durch die Gesamtzahl der lebenden und unbeschädigten Weibchen geteilt, die in diesen Käfig einsetzt wurden. ⁴⁹⁸⁰Eine NOEC für die Fekundität kann mit einer ANOVA (z. B. mit einem Williams- oder einem Dunnett-Test) ermittelt werden. |
| 54. | ⁴⁹⁸¹Die Fertilität der Eigelege dient als Maßstab zur Ermittlung der Anzahl der befruchteten Eigelege pro Weibchen. ⁴⁹⁸²Die Gesamtzahl der in einem Zuchtkäfig gelegten befruchteten Eigelege wird durch die Gesamtzahl der lebenden und unbeschädigten Weibchen geteilt, die in diesen Käfig eingesetzt wurden. ⁴⁹⁸³Eine NOEC für die Fertilität kann mit einer ANOVA (z. B. mit einem Williams- oder einem Dunnett-Test) ermittelt werden. |
Prüfbericht | 55. | Der Prüfbericht enthält die folgenden Informationen: | Prüfchemikalie:- —
- physikalischer Zustand und physikalisch-chemische Eigenschaften (Wasserlöslichkeit, Dampfdruck, Verteilungskoeffizient im Boden (oder — falls verfügbar — im Sediment), Stabilität im Wasser und im Sediment usw.);
- —
- chemische Kenndaten (gebräuchliche Bezeichnung, chemische Bezeichnung, Strukturformel, CAS-Nummer usw.) einschließlich Reinheitsgrad und Analyseverfahren zur Quantifizierung der Chemikalie.
|
| Testspezies:- —
- Verwendete Testorganismen: Art, wissenschaftlicher Name, Bezugsquelle der Testorganismen und Zuchtbedingungen;
- —
- Angaben zur Handhabung der Gelege und der Larven;
- —
- Informationen zur Extraktion der Imagines der 1. Generation z. B. mit einer Absaugvorrichtung (siehe Anlage 5).
- —
- ⁴⁹⁸⁷Alter der Testorganismen beim Einsetzen in die Prüfgefäße (1. und 2. ⁴⁹⁸⁸Generation).
|
| Prüfbedingungen:- —
- verwendetes Sediment, d. h. natürliches oder formuliertes (künstliches) Sediment;
- —
- natürliches Sediment: Standort und Beschreibung der Entnahmestelle möglichst einschließlich Informationen über frühere Verunreinigungen, Merkmale des Sediments: pH-Wert, Gehalt an organischem Kohlenstoff, C/N-Verhältnis und gegebenenfalls Granulometrie;
- —
- formuliertes Sediment: Herstellung, Bestandteile und Merkmale (Gehalt an organischem Kohlenstoff, pH-Wert, Feuchte usw. (Messwerte bei Beginn des Versuchs));
- —
- Herstellung des Prüfwassers (falls rekonstituiertes Wasser verwendet wird) und Merkmale des Wassers (Sauerstoffgehalt, pH-Wert, Härte usw. (bei Beginn des Tests gemessen));
- —
- Tiefe des Sediments und des Überstandswassers in den Prüfgefäßen und in den Kristallisierungsschalen;
- —
- Volumen des Überstandswassers und des Porenwassers; Gewicht des feuchten Sediments in den Prüfgefäßen und in den Kristallisierungsschalen mit und ohne Porenwasser;
- —
- Prüfgefäße (Material und Größe);
- —
- Kristallisierungsschalen (Material und Größe);
- —
- Zuchtkäfige (Material und Größe);
- —
- Methode für die Herstellung der Stammlösungen und Prüfkonzentrationen (Prüfgefäße und Kristallisierungsschalen);
- —
- Applikation der Prüfchemikalie in die Prüfgefäße und in die Kristallisierungsschalen: Prüfkonzentrationen, Anzahl der Replikate und Lösungsmittel (wenn benötigt);
- —
- Inkubationsbedingungen der Prüfgefäße; Temperatur, Photoperiode und Lichtintensität, Belüftung (Blasen pro Sekunde);
- —
- Inkubationsbedingungen für die Zuchtkäfige und die Kristallisierungsschalen: Temperatur, Photoperiode und Lichtintensität;
- —
- Inkubationsbedingungen für die Eigelege in den Mikrotiterplatten (oder in sonstigen Gefäßen); Temperatur, Photoperiode und Lichtintensität;
- —
- genaue Angaben zur Fütterung, einschließlich Art des Futters, Präparation des Futters, Futtermenge und Fütterungssystem.
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| Ergebnisse:- —
- nominelle Prüfkonzentrationen, gemessene Prüfkonzentrationen und Ergebnisse sämtlicher Analysen zur Bestimmung der Konzentration der Prüfchemikalie in den Prüfgefäßen und in den Kristallisierungsschalen;
- —
- Qualität des Wassers in den Prüfgefäßen und in den Kristallisierungsschalen, d. h. pH-Wert, Temperatur, Gehalt an gelöstem Kohlenstoff, Härte und Ammoniakgehalt;
- —
- gegebenenfalls Ausgleich von Verdunstungsverlusten in den Prüfgefäßen;
- —
- Anzahl der geschlüpften männlichen und weiblichen Mücken pro Gefäß und pro Tag (1. und 2. Generation);
- —
- Geschlechterverhältnis der vollständig geschlüpften und lebenden Mücken pro Prüfkonzentration (1. und 2. Generation);
- —
- Anzahl der Larven pro Gefäß, die sich nicht zu Mücken entwickelt haben (1. und 2. Generation);
- —
- Prozentanteil/Anteil Schlupf pro Replikat und Prüfkonzentration (männliche und weibliche Mücken gepoolt; 1. und 2. Generation);
- —
- mittlere Entwicklungsrate von voll entwickelten und lebenden Mücken pro Replikat und Prüfkonzentration (männliche und weibliche Mücken getrennt und gepoolt; 1. und 2. Generation);
- —
- Anzahl der in den Kristallisierungsschalen gelegten Eigelege pro Zuchtkäfig und Tag;
- —
- Merkmale der einzelnen Eigelege (Größe, Form und Fertilität);
- —
- Fekundität — Gesamtzahl der Eigelege pro Gesamtzahl der in den Zuchtkäfig eingesetzten Weibchen;
- —
- Fertilität — Gesamtzahl der befruchteten Eigelege pro Gesamtzahl der in den Zuchtkäfig eingesetzten Weibchen;
- —
- Schätzung der toxischen Endpunkte, z. B. ECx (und dazugehörige Konfidenzintervalle) und NOEC unter Angabe der zu ihrer Bestimmung verwendeten statistischen Methoden;
- —
- Diskussion der Ergebnisse einschließlich aller Auswirkungen auf das Testergebnis, die auf Abweichungen von dieser Prüfmethode zurückzuführen sind.
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LITERATUR | (1) | Kapitel C.28 dieses Anhangs, ‚Chironomiden-Toxizitätstest in Sediment-Wasser-Systemen mit gespiktem Wasser‘. |
| (2) | Shobanov, N.A., Kiknadze, I.I., und M.G. Butler (1999), Palearctic and Nearctic Chironomus (Camptochironomus) tentans Fabricius are different species (Diptera: Chironomidae). Entomologica Scandinavica, 30: 311–322. |
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Anlage 1Begriffsbestimmungen
Für diese Prüfmethode gelten folgende Definitionen:
Chemikalie: ein Stoff oder Gemisch.
Formuliertes Sediment oder rekonstituiertes, künstliches oder synthetisches Sediment: ein Gemisch aus Stoffen, mit denen die physikalischen Bestandteile eines natürlichen Sediments nachgeahmt werden sollen.
Überstandswasser: das im Prüfgefäß auf dem Sediment stehende Wasser.
Interstitialwasser oder Porenwasser: das Wasser in den Zwischenräumen zwischen Sedimentpartikeln bzw. zwischen Bodenpartikeln.
Dotiertes Wasser: Wasser, dem eine Prüfchemikalie hinzugefügt wurde.
Prüfchemikalie: ein beliebiger Stoff oder eine beliebige Mischung, der/die nach dieser Methode geprüft wird.
Anlage 2
Empfehlungen für die Anzucht von Chironomus riparius
| 1. | ⁵⁰⁶⁰Für die Anzucht von Chironomus-Larven können Kristallisierungsschalen oder größere Behälter verwendet werden. ⁵⁰⁶¹Auf dem Boden des Behälters wird eine 5-10 mm dicke Schicht feiner Quarzsand aufgetragen. ⁵⁰⁶²Kieselgur (z. B. Merck, Art 8117) hat sich ebenfalls als Substrat bewährt (eine dünnere Schicht von nur wenigen Millimetern ist ausreichend). ⁵⁰⁶³Anschließend wird mit geeignetem Wasser auf eine Höhe von mehreren Zentimetern aufgefüllt. ⁵⁰⁶⁴Soweit erforderlich ist bei Verdunstungsverlusten Wasser nachzufüllen, um ein Austrocknen zu verhindern. ⁵⁰⁶⁵Nötigenfalls kann das Wasser ausgetauscht werden. ⁵⁰⁶⁶Das Wasser wird leicht belüftet. ⁵⁰⁶⁷Die Larvenzuchtgefäße sind in geeignete Käfige zu setzen, um zu verhindern, dass die schlüpfenden Imagines entweichen. ⁵⁰⁶⁸Der Käfig muss groß genug sein (Mindestgröße ca. ⁵⁰⁶⁹30 × 30 × 30 cm), damit die geschlüpften Imagines schwärmen können. ⁵⁰⁷⁰Ansonsten kommt es nicht zur Paarung. |
| 2. | ⁵⁰⁷¹Die Käfige sind bei Raumtemperatur oder in einer Klimakammer bei 20 ± 2 °C und einer Licht-/Dunkelphase von 16:8 Std. ⁵⁰⁷²(Lichtintensität ca. ⁵⁰⁷³1 000 lx) zu halten. ⁵⁰⁷⁴Es wurde berichtet, dass eine relative Luftfeuchte von weniger als 60 % eine Vermehrung unterbinden kann. |
Verdünnungswasser | 3. | ⁵⁰⁷⁵Es kann jedes natürliche oder synthetische Wasser verwendet werden. ⁵⁰⁷⁶Im Allgemeinen werden Brunnenwasser, entchlortes Leitungswasser und künstliches Medium (z. B. Elendt-Medium ‚M4‘ oder ‚M7‘, siehe unten) verwendet. ⁵⁰⁷⁷Das Wasser muss vor Verwendung belüftet werden. ⁵⁰⁷⁸Soweit erforderlich kann das Anzuchtwasser durch vorsichtiges Abgießen oder Absaugen des gebrauchten Wassers aus den Prüfgefäßen erneuert werden; dabei ist darauf zu achten, dass die Wohnröhren der Larven nicht zerstört werden. |
Fütterung der Larven | 4. | Chironomus-Larven sind mit etwa 250 mg frischem Fischfutter (Flocken, Tetra Min®, Tetra Phyll® oder Fischfutter einer vergleichbaren Marke) pro Gefäß und Tag zu füttern. ⁵⁰⁸⁰Das Futter kann als trocken gemahlenes Pulver oder suspendiert in Wasser angeboten werden (1,0 g Futterflocken mit 20 ml Verdünnungswasser zu einer homogenen Masse gemischt). ⁵⁰⁸¹Diese Zubereitung kann in 5-ml-Portionen pro Gefäß und Tag verfüttert werden (vor Gebrauch schütteln). ⁵⁰⁸²Ältere Larven können etwas mehr Futter erhalten. |
| 5. | ⁵⁰⁸³Das Futter ist an die Wasserqualität anzupassen. ⁵⁰⁸⁴Bei Trübung des Kulturmediums ist die Futterration zu reduzieren. ⁵⁰⁸⁵Die Futterzugaben sind sorgfältig zu notieren. ⁵⁰⁸⁶Zu wenig Futter kann dazu führen, dass die Larven in die Wassersäule abwandern, während zu viel Futter die mikrobielle Aktivität verstärkt und die Sauerstoffkonzentrationen verringert. ⁵⁰⁸⁷In beiden Fällen kann sich das Wachstum der Organismen verlangsamen. |
| 6. | Wenn neue Kulturgefäße angesetzt werden, können auch einige Grünalgenzellen (z. B. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) hinzugefügt werden. |
Fütterung der geschlüpften Imagines | 7. | Einige Experimentatoren empfehlen, als Futter für die geschlüpften Imagines ein mit gesättigter Zuckerlösung getränktes Wattepad zu verwenden. |
Emergenz | 8. | Nach ca. ⁵⁰⁹⁰13 bis 15 Tagen bei einer Temperatur von 20 ± 2 °C beginnen die Imagines in den Larvenzuchtgefäßen zu schlüpfen. ⁵⁰⁹¹Männchen sind leicht an den gefiederten Antennen und dem schlanken Körper zu erkennen. |
Eiegelege | 9. | ⁵⁰⁹²Sobald sich Imagines in den Zuchtkäfigen befinden, sind alle Larvenzuchtgefäße dreimal wöchentlich auf gallertartige Eigelege zu kontrollieren. ⁵⁰⁹³Vorhandene Gelege sind vorsichtig zu entnehmen und in eine kleine Schale mit einer Probe des Zuchtwassers zu geben. ⁵⁰⁹⁴Mit den Eigelegen werden neue Kulturen angesetzt (z. B. 2-4 Eigelege pro Gefäß) oder Toxizitätstests durchgeführt. |
| 10. | Nach 2-3 Tagen sollten L1-Larven schlüpfen. |
Ansetzen neuer Kulturen | 11. | ⁵⁰⁹⁶Sobald die Zucht etabliert ist, müssten je nach Prüfungsanforderungen wöchentlich oder weniger häufig frische Kulturen angesetzt und die älteren Prüfgefäße nach dem Schlüpfen der Imagines entfernt werden können. ⁵⁰⁹⁷So sind bei geringem Aufwand ständig neue Imagines verfügbar. |
Zubereitung der Prüflösungen M4 und M7 | 12. | ⁵⁰⁹⁸Das Medium M4 wurde von Elendt (1990) beschrieben. ⁵⁰⁹⁹Das Medium M7 wird wie das Medium M4 zubereitet, mit Ausnahme der in Tabelle 1 angegebenen Stoffe, deren Konzentration bei M7 viermal niedriger ist als bei M4. Die Prüflösungen werden nicht nach den Anweisungen von Elendt und Bias (1990) zubereitet, da die für die Zubereitung der Stammlösungen angegebenen Konzentrationen von NaSiO3 · 5H2O, NaNO3, KH2PO4 und K2HPO4 für diesen Test nicht geeignet sind. |
Herstellung des M7-Mediums | 13. | ⁵¹⁰⁰Zunächst wird jede Stammlösung (I) einzeln zubereitet; diese Stammlösungen (I) werden anschließend zu einer kombinierten Stammlösung (II) zusammengegossen (siehe Tabelle 1). ⁵¹⁰¹50 ml der kombinierten Stammlösung (II) und die in Tabelle 2 angegebenen jeweiligen Mengen der Makronährstoff-Stammlösung werden zur Herstellung des M7-Mediums mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. ⁵¹⁰²Durch Zugabe von drei Vitaminen gemäß Tabelle 3 zu entionisiertem Wasser wird eine kombinierte Vitamin-Stammlösung hergestellt, von der 0,1 ml vor der Verwendung dem fertigen M7-Medium zugesetzt werden. ⁵¹⁰³Die Vitaminstammlösung wird in kleinen Portionen tiefgefroren aufbewahrt. ⁵¹⁰⁴Das Medium wird belüftet und stabilisiert. |
Tabelle 1Stammlösungen der Spurenelemente für das M4- und das M7-Medium
| Stammlösungen (I) | Menge (mg), die mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt wird | Herstellung der kombinierten Stammlösung (II): Folgende Mengen (ml) der Stammlösungen (I) werden gemischt und mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. | Endkonzentrationen der Prüflösungen (mg/l) | | M4 | M7 | M4 | M7 | | H3BO3 | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | | MnCl2 · 4H2O (25) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | | LiCl (25) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | | RbCl (25) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | | SrCl2 · 6H2O (25) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | | NaBr (25) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | | Na2MoO4 · 2H2O (25) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | | CuCl2 · 2H2O (25) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | | CaCl2 · 6H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | | Na2EDTA · 2H2O (25) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | | FeSO4 · 7H2O (25) (26) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 |
Tabelle 2
Makronährstoff-Stammlösung für das M4- und das M7-Medium
| Menge (mg), die mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt wird(mg)
| Zur Herstellung des M4- und des M7-Mediums zugesetzte Menge an Makronährstoff-Stammlösungen(ml/l)
| Endkonzentrationen der Prüflösungen M4 und M7(mg/l)
| | CaCl2· 2H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | | MgSO4 · 7H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | | NaSiO3 · 9H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 |
Tabelle 3
Vitamin-Stammlösung für das M4- und das M7-Medium
Aus den drei Vitaminlösungen wird eine einzige Vitamin-Stammlösung hergestellt.
| Menge (mg), die mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt wird(mg)
| Zur Herstellung des M4- und des M7-Mediums zugesetzte Menge an Vitamin-Stammlösung(ml/l)
| Endkonzentrationen der Prüflösungen M4 und M7(mg/l)
| | Thiaminhydrochlorid | 750 | 0,1 | 0,075 | | Cyanocobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | | Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075 |
LITERATURBBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, Hrsg. M. Streloke und H. Köpp. Berlin.
Elendt, B.P. (1990), Selenium deficiency in Crustacea, Protoplasma, 154: 25-33.
Elendt, B.P., und W.-R. Bias (1990), Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing, Effects on the optimisation of culture conditions on life history parameters of D. magna, Water Research, 24: 1157-1167.
Anlage 3
Zubereitung des formulierten Sediments
ZUSAMMENSETZUNG DES SEDIMENTS
Das formulierte Sediment setzt sich wie folgt zusammen:
| Bestandteil | Beschreibung | % der Trockenmasse des Sediments | | Torf | Sphagnum-Torf, ph-Wert möglichst 5,5-6,0, ohne sichtbare Pflanzenreste, fein gemahlen (Partikelgröße ≤ 1 mm) und luftgetrocknet | 4-5 | | Quarzsand | Partikelgröße: > 50 % der Partikel 50-200 μm | 75-76 | | Kaolin-Ton | Kaolinitgehalt ≥ 30 % | 20 | | Organischer Kohlenstoff | Eingestellt durch Zugabe von Torf und Sand | 2 (± 0,5) | | Calciumcarbonat | CaCO3, pulverisiert, chemisch rein | 0,05-0,1 | | Wasser | Leitfähigkeit ≤ 10 μS/cm | 30-50 |
ZUBEREITUNGDer Torf wird luftgetrocknet und zu feinem Pulver zermahlen. ⁵¹¹²Mit entionisiertem Wasser wird in einer leistungsstarken Homogenisiereinrichtung eine Suspension der erforderlichen Menge an Torfpulver hergestellt. Der pH-Wert dieser Suspension wird mit CaCO3 auf 5,5 ± 0,5 eingestellt. ⁵¹¹³Diese Suspension wird bei 20 ± 2 °C für mindestens zwei Tage unter sanftem Rühren konditioniert, um den pH-Wert zu stabilisieren und eine Etablierung der mikrobiellen Fauna zu ermöglichen. ⁵¹¹⁴Der pH-Wert wird erneut bestimmt und muss bei 6,0 ± 0,5 liegen. ⁵¹¹⁵Nun werden die übrigen Komponenten (Sand und Kaolin-Ton) sowie entionisiertes Wasser zur Torf-Wasser-Suspension hinzugegeben und zu einem homogenen Sediment vermischt, dessen Wassergehalt 30-50 % der Trockenmasse des Sediments betragen sollte. Der pH-Wert der fertigen Mischung wird erneut gemessen und erforderlichenfalls mit CaCO3 auf 6,5-7,5 eingestellt. ⁵¹¹⁶Anhand von Sedimentproben werden die Trockenmasse und der Gehalt an organischem Kohlenstoff bestimmt. ⁵¹¹⁷Es wird empfohlen, das formulierte Sediment vor der Verwendung in einem Chironomiden-Toxizitätstest sieben Tage unter denselben Bedingungen wie sie im anschließenden Test vorherrschen, zu konditionieren.
LAGERUNG
Die trockenen Bestandteile für die Zubereitung des künstlichen Sediments können an einem trockenen und kühlen Ort bei Raumtemperatur gelagert werden. ⁵¹¹⁹Das formulierte (feuchte) Sediment darf vor seiner Verwendung im Prüfversuch nicht gelagert werden. ⁵¹²⁰Es ist unmittelbar nach Ablauf der siebentägigen Konditionierung, mit der die Zubereitung abschließt, zu verwenden.
LITERATUR
OECD (1984), Earthworm, Acute Toxicity Test, Test Guideline No. 207, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris.
⁵¹²³Meller, M., Egeler, P., Roembke, J., Schallnass, H., Nagel, R., und B. ⁵¹²⁴Streit (1998), Short-term toxicity of lindane, hexachlorobenzene and copper sulfate on tubificid sludgeworms (Oligochaeta) in artificial media, Ecotox. Environ. ⁵¹²⁵Safety, 39: 10-20.
Anlage 4
Chemische Eigenschaften eines geeigneten Verdünnungswassers
| BESTANDTEILE | KONZENTRATIONEN | | Partikel | < 20 mg/l | | Gesamtgehalt an organischen Kohlenstoffen | < 2 mg/l | | Nicht ionisiertes Ammonium | < 1 μg/l | | Härte in CaCO3 | < 400 mg/l | | Restchlor | < 10 μg/l | | Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden und polychlorierten Biphenylen | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an organischem Chlor | < 25 ng/l |
Anlage 5Leitlinien zur Durchführung des Tests
Zuchtkäfig (Beispiel):
 | A | : | Gaze-Abdeckung oben und mindestens auf einer Seite (Maschenweite ca. 1 mm) | | B | : | Öffnung zum Einsetzen der Imagines in den Zuchtkäfig und zur Entnahme der gelegten Eigelege aus den Kristallisierungsschalen (in dieser Abbildung nicht dargestellt) | | C | : | Mindestabmessungen der Zuchtkäfige (L × H × B): 30 cm × 30 cm × 30 cm |
Prüfgefäß (Beispiel): | A | : | Pasteur-Pipette zur Belüftung des Überstandswassers | | B | : | Glasdeckel, damit die Imagines das Gefäß nicht verlassen | | C | : | Überstandswasser | | D | : | Prüfgefäß (Becherglas mit einem Fassungsvermögen von mindestens 600 ml) | | E | : | Sedimentschicht |
Absaugvorrichtung zur Extraktion von Imagines (Luftdurchfluss in Pfeilrichtung): | A | : | Glasrohr (Innendurchmesser ca. 5 mm), mit einer selbstansaugenden Pumpe verbunden | | B | : | Korken aus vulkanisiertem Kautschuk, durch den das Glasrohr (A) geführt wird; innen ist die Öffnung des Glasrohrs (A) mit etwas Watte und einer Gaze (Maschenweite ca. 1 mm2) verschlossen, damit die in die Vorrichtung eingesaugten Mücken nicht beschädigt werden. | | C | : | transparentes Behältnis (Kunststoff oder Glas, Länge ca. 15 cm) für die extrahierten Mücken | | D | : | Korken aus vulkanisiertem Kautschuk, durch den ein Rohr (E) geführt wird; um die Mücken in den Zuchtkäfig zu entlassen, wird der Korken (D) aus dem Behältnis (C) gezogen. | | E | : | Rohr (Kunststoff oder Glas, Innendurchmesser ca. 8 mm) zur Aufnahme der Imagines aus dem Gefäß |
Schematische Darstellung eines Lebenszyklustests: | A | : | 1. Generation — Prüfgefäße mit einem Sediment-Wasser-System, acht Replikate, 20 L1-Larven pro Gefäß | | B | : | vier Prüfgefäße pro Zuchtkäfig, A und B | | C | : | Zuchtkäfige (A und B) zur Förderung der Schwarmbildung, der Paarung und der Eiablage | | D | : | Kristallisierungsschalen zur Ablage der Eigelege | | E | : | Mikrotiterplatten, für jedes Eigelege jeweils eine Vertiefung | | F | : | 2. Generation — Prüfgefäße mit einem Sediment-Wasser-System, acht Replikate, 20 L1-Larven pro Gefäß |
C.41. FISH SEXUAL DEVELOPMENT TEST (TEST ZUR GESCHLECHTSENTWICKLUNG BEI FISCHEN)EINLEITUNG
| 1. | ⁵¹³¹Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 234 (2011). ⁵¹³²Sie beruht auf dem 1998 gefassten Beschluss, neue Prüfmethoden zur Untersuchung und zum Testen von Stoffen mit potenziell endokriner Wirkung zu entwickeln bzw. bestehende Methoden zu aktualisieren. ⁵¹³³Der Test zur Geschlechtsentwicklung bei Fischen — Fish Sexual Development Test (FSDT) — wurde als viel versprechende Methode zur Berücksichtigung eines empfindlichen Stadiums im Lebenszyklus von Fischen bewertet, die gleichermaßen auf östrogen und auf androgen wirkende Chemikalien anspricht. ⁵¹³⁴Die Prüfmethode wurde in den Jahren 2006 bis 2010 einem Ringtest unterzogen, in dem Japanische Reiskärpflinge (Oryzias latipes), Zebrabärblinge (Danio rerio) und Dreistachlige Stichlinge (Gasterosteus aculeatus) vollständig und Dickkopfelritzen (Pimephales promelas) teilweise validiert wurden (41)(42)(43). ⁵¹³⁵Das hier beschriebene Protokoll umfasst Japanische Reiskärpflinge (Medakas), Dreistachlige Stichlinge und Zebrabärblinge. ⁵¹³⁶Das Protokoll ist im Prinzip eine Verlängerung der OECD-Prüfrichtlinie 210, Fish, Early Life Stage Toxicity Test (FELS-Test) (1); die Exposition wird fortgesetzt, bis die sexuelle Differenzierung erfolgt ist, d. h. bei Japanischen Reiskärpflingen, bei Dreistachligen Stichlingen und bei Zebrabärblingen etwa 60 Tage nach dem Schlüpfen (wobei die Expositionsdauer bei anderen künftig zu validierenden Arten noch länger oder kürzer sein kann); außerdem werden endokrinsensitive Endpunkte einbezogen. ⁵¹³⁷Im FSDT werden Wirkungen in frühen Lebensstadien und potenzielle nachteilige Folgen mutmaßlich endokrin wirkender Chemikalien (z. B. Östrogene, Androgene und Steroidogenese-Inhibitoren) auf die Geschlechtsentwicklung beurteilt. ⁵¹³⁸Aufgrund der Kombination der beiden wesentlichen endokrin relevanten Endpunkte (der VTG-Konzentration und des phänotypischen Geschlechterverhältnisses) kann die Wirkungsweise der Prüfchemikalie ermittelt werden. ⁵¹³⁹Wegen der populationsrelevanten Änderung des phänotypischen Geschlechterverhältnisses kann der FSDT zur Gefahren- und Risikobewertung verwendet werden. ⁵¹⁴⁰Wenn der Test allerdings zur Gefahren- oder Risikobewertung durchgeführt wird, dürfen keine Stichlinge verwendet werden, weil die bislang verfügbaren Validierungsdaten gezeigt haben, dass bei dieser Art ohnehin nur selten durch die Prüfchemikalien induzierte Änderungen des phänotypischen Geschlechterverhältnisses auftreten. |
| 2. | ⁵¹⁴¹Gemäß dem Prüfprotokoll werden die Fische in der für die Geschlechtsentwicklung labilen Phase, in der die Fische wahrscheinlich am empfindlichsten auf Chemikalien mit endokriner Wirkung reagieren, über das Wasser Chemikalien ausgesetzt, die Einfluss auf ihre Geschlechtsentwicklung haben. ⁵¹⁴²Zwei wichtige Endpunkte werden als Indikatoren für mit endokrinen Wirkungen verbundene Entwicklungsstörungen bewertet: die VTG-Konzentration und das Geschlechterverhältnis; die betreffenden Daten werden durch histologische Gonadenuntersuchungen ermittelt. ⁵¹⁴³Histopathologische Gonadenuntersuchungen (Bewertung und Bestimmung des Entwicklungsstadiums von Oozyten und von Spermatogenesezellen) können zusätzlich durchgeführt werden. ⁵¹⁴⁴Außerdem wird möglichst eine Bestimmung des genetischen Geschlechts vorgenommen (z. B. bei Japanischen Reiskärpflingen und bei Dreistachligen Stichlingen). ⁵¹⁴⁵Die Tatsache, dass ein Marker für die Bestimmung des genetischen Geschlechts verfügbar ist, stellt insoweit einen erheblichen Vorteil dar, als sie die Aussagekraft der Statistiken zum Geschlechterverhältnis erhöht und die Erkennung einer phänotypischen Geschlechtsumkehr bei einzelnen Exemplaren ermöglicht. ⁵¹⁴⁶Weitere ebenfalls zu messende apikale Endpunkte sind die Schlupfrate, die Überlebensrate, die Länge und das Körpergewicht. ⁵¹⁴⁷Die Prüfmethode kann an andere Arten als die oben genannten angepasst werden, wenn diese Arten einer Validierung entsprechend der Validierung für den Japanischen Reiskärpfling, den Dreistachligen Stichling und den Zebrabärbling unterzogen werden, wenn die Kontrollfische am Ende des Tests sexuell differenziert sind, wenn die VTG-Werte hinreichend hoch sind, um signifikante auf die betreffende Chemikalie zurückzuführende Variationen zu erkennen und wenn die Empfindlichkeit des Prüfsystems mit Referenzchemikalien mit endokriner Wirkung ((Anti-)Östrogene, (Anti-)Androgene, Aromatasehemmer usw.) nachgewiesen wurde. ⁵¹⁴⁸Außerdem müssen sämtliche Validierungsberichte, die auf FSDT-Daten anderer Arten Bezug nehmen, von der OECD geprüft worden sein. ⁵¹⁴⁹Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, ist das Ergebnis der Validierung als zufriedenstellend zu betrachten. |
Ausgangserwägungen und Einschränkungen | 3. | ⁵¹⁵⁰Vitellogenin (VTG) wird gewöhnlich in der Leber weiblicher oviparer Vertebraten infolge des im Blutkreislauf zirkulierenden endogenen Östrogens produziert (2). ⁵¹⁵¹VTG ist eine Vorstufe verschiedener Eidotter-Proteine und bewegt sich, einmal in der Leber produziert, durch die Blutbahn bis zum Ovar, wo es aufgenommen und unter Entwicklung von Eiern modifiziert wird. ⁵¹⁵²Die VTG-Synthese erfolgt auch bei unreifen Fischen und bei adulten Männchen, wenn auch in sehr beschränktem Umfang, ist aber nachweisbar. ⁵¹⁵³Die Leber kann VTG aber auch aufgrund einer exogenen Östrogenstimulation synthetisieren und sekretieren (3)(4)(5). |
| 4. | ⁵¹⁵⁴Die Messung der VTG-Konzentration ermöglicht den Nachweis von Chemikalien mit östrogener, anti-östrogener und androgener Wirkung und die Erkennung von Chemikalien, die die Steroidogenese beeinträchtigen (beispielsweise Aromatasehemmer). ⁵¹⁵⁵Der Nachweis östrogener Chemikalien kann über die VTG-Induktion bei männlichen Fischen erfolgen und wurde in peer reviewed wissenschaftlichen Veröffentlichungen umfassend dokumentiert. ⁵¹⁵⁶Außerdem wurde eine VTG-Induktion infolge der Exposition gegenüber aromatisierbaren Androgenen nachgewiesen (6)(7). ⁵¹⁵⁷Eine Reduktion des im Blutkreislauf weiblicher Tiere zirkulierenden Östrogens beispielsweise durch Hemmung der Aromatase, die endogene Androgene in natürliches öströgenes 17β-Östradiol umwandelt, bewirkt eine Verringerung der VTG-Konzentration. ⁵¹⁵⁸Anhand dieser Reduzierung der VTG-Konzentration können Chemikalien mit Aromatase hemmender Wirkung oder Steroidogenese-Inhibitoren im Allgemeinen nachgewiesen werden (33). ⁵¹⁵⁹Die biologische Relevanz der VTG-Reaktion aufgrund einer Östrogen-/Aromatasehemmung wurde nachgewissen und umfassend dokumentiert (8)(9). ⁵¹⁶⁰Allerdings kann die VTG-Produktion bei weiblichen Tieren auch durch eine allgemeine Toxizität und durch toxische Wirkungsweisen unabhängig vom endokrinen System beeinträchtigt werden. |
| 5. | ⁵¹⁶¹Mehrere Messverfahren wurden entwickelt und für die regelmäßige Verwendung standardisiert, um die VTG-Konzentration im Blut, in der Leber, im gesamten Körper oder in Homogenatproben aus dem Kopf-/Schwanzgewebe einzelner Exemplare zu quantifizieren. ⁵¹⁶²Dies gilt für Zebrabärblinge, Dreistachlige Stichlinge und Japanische Reiskärpflinge, aber auch für die nur teilweise validierte Dickkopfelritze. Zur Bestimmung der VTG-Konzentration können auch artspezifische, auf Immunchemie gestützte ELISA-Verfahren (ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) verwendet werden (5)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16). ⁵¹⁶³Bei Japanischen Reiskärpflingen und bei Zebrabärblingen besteht eine ausgeprägte Korrelation zwischen der im Blutplasma, in der Leber und in Homogenatproben gemessenen VTG-Konzentration, wenn auch Homogenate allerdings leicht niedrigere Werte als Plasmabestimmungen (17)(18)(19) ergeben. ⁵¹⁶⁴In Anlage 5 werden empfohlene Verfahren zur Probenahme für VTG-Analysen beschrieben. |
| 6. | ⁵¹⁶⁵Die Änderung des phänotypischen Geschlechterverhältnisses ist ein Endpunkt für eine Geschlechtsumkehr. ⁵¹⁶⁶Grundsätzlich können Östrogene, Antiöstrogene, Androgene, Antiandrogene und die Steroidogenese hemmende Chemikalien das Geschlechterverhältnis bei in der Entwicklung befindlichen Fischen beeinträchtigen (20). ⁵¹⁶⁷Es wurde nachgewiesen, dass diese Geschlechtsumkehr nach der Exposition gegenüber einer östrogenen Chemikalie bei Zebrabärblingen teilweise reversibel ist (21); eine Geschlechtsumkehr infolge der Exposition gegenüber einer androgenen Chemikalie ist hingegen irreversibel (30). ⁵¹⁶⁸Die Geschlechter werden erfasst als weiblich, männlich, intersexuell (in einer Gonade sowohl Oozyten als auch Spermatogenesezellen) oder nicht differenziert jeweils bezogen auf ein einzelnes Exemplar und ermittelt durch histologische Untersuchung der Gonaden. Nähere Informationen sind Anlage 7 sowie dem OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22) zu entnehmen. |
| 7. | ⁵¹⁶⁹Das genetische Geschlecht wird mit genetischen Markern untersucht — soweit diese bei der jeweiligen Fischart vorkommen. ⁵¹⁷⁰Bei Japanischen Reiskärpflingen sind die beiden X-Chromosome (bei weiblichen Tieren) bzw. das X- und das Y-Chromosom (bei männlichen Tieren) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachweisbar, oder das männliche Determinationsgen DMY kann wie in den Quellen (23) und (24) beschrieben analysiert werden (DMY negativ oder positiv). ⁵¹⁷¹Beim Dreistachligen Stichling kann das genetische Geschlecht durch ein entsprechendes PCR-Verfahren bestimmt werden (siehe Anlage 10). ⁵¹⁷²Wenn das genetische Geschlecht individuell dem phänotypischen Geschlecht zugeordnet werden kann, hat der Test eine höhere Aussagekraft; entsprechend sollte bei Arten mit dokumentierten Markern für das genetische Geschlecht auch eine Bestimmung des genetischen Geschlechts vorgenommen werden. |
| 8. | ⁵¹⁷³Die endokrine Wirksweise einer Chemikalie lässt sich durch eine Kombination der beiden wesentlichen endokrin relevanten Endpunkte (die VTG-Konzentration und das Geschlechterverhältnis) nachweisen (Tabelle1). Das Geschlechterverhältnis ist ein populationsbezogener Biomarker (25)(26), und bei einigen gut definierten Wirkungsweisen können die Ergebnisse eines Fish Sexual Development Test (FSDT) für die Gefahren- und Risikobewertung verwendet werden, wenn die zuständige Behörde diesen Ansatz als geeignet betrachtet. ⁵¹⁷⁴Diese Wirkungsweisen sind bei Östrogenen, Androgenen und bei Steroidogenesehemmern gegeben.Tabelle 1
Reaktion der endokrin relevanten Endpunkte auf unterschiedliche Wirkungsweisen von Chemikalien
↑ = zunehmend, ↓ = abnehmend, — = nicht untersucht
| Wirkungsmechanismus | VTG ♂ | VTG ♀ | Geschlechterverhältnis | Quellen | | Schwacher Östrogenagonist | ↑ | ↑ | ↑ ♀ oder ↑ nicht diff. | (27) (40) | | Starker Östrogenagonist | ↑ | ↑ | ↑ ♀ oder ↑ nicht diff., kein ♂ | (28) (40) | | Östrogenantagonist | - | - | ↓ ♀, ↑ nicht diff. | (29) | | Androgenagonist | ↓ oder — | ↓ oder — | ↑ ♂, kein ♀ | (28) (30) | | Androgenantagonist | - | - | ↑ ♀↑ intersex.
| (31) | | Aromatasehemmer | ↓ | ↓ | ↓ ♀ | (33) |
|
| 9. | Im FSDT wird die Reproduktionsphase im Lebenszyklus der Fische nicht berücksichtigt; daher sind Chemikalien, bei denen der Verdacht besteht, dass sie bereits in geringeren Konzentrationen als bei der Geschlechtsentwicklung die Reproduktionsfähigkeit beeinträchtigen, einem Reproduktionstest zu unterziehen. |
| 10. | Begriffsbestimmungen im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode sind Anlage 1 zu entnehmen. |
| 11. | ⁵¹⁸⁰Mit dem In-vivo-FSDT sollen Chemikalien mit androgenen und östrogenen Eigenschaften sowie Antiandrogene, Antiöstrogene und die Steroidogenese hemmende Chemikalien nachgewiesen werden. ⁵¹⁸¹Beim FSDT wurden in den Validierungsphasen (1 und 2) östrogene, androgene und die Steroidogenese hemmende Chemikalien berücksichtigt. ⁵¹⁸²Die Wirkung von Östrogen- und Androgenantagonisten im FSDT wird in Tabelle 1 dargestellt; die entsprechenden Wirkmechanismen sind aber gegenwärtig noch nicht umfassend dokumentiert. |
PRINZIP DER PRÜFUNG | 12. | ⁵¹⁸³In der Prüfung werden Fische aus frisch befruchteten Eiern bis zum Abschluss der Geschlechtsdifferenzierung mindestens drei Konzentrationen der in Wasser gelösten Prüfchemikalie ausgesetzt. ⁵¹⁸⁴Wenn die Verfügbarkeit bzw. die Beschaffenheit (z. B. eine begrenzte Löslichkeit) der Prüfchemikalie dies zulassen, wird der Test in einem Durchflusssystem vorgenommen. ⁵¹⁸⁵Die Prüfung beginnt mit dem Einsetzen frisch befruchteter Eier (vor dem Blastula-Stadium) in die Versuchsbecken. ⁵¹⁸⁶Wie das Einsetzen in die Versuchsbecken erfolgt, wird in Nummer 27 für die verschiedenen Arten beschrieben. ⁵¹⁸⁷Bei den validierten Fischarten (Japanischer Reiskärpfling, Dreistachliger Stichling und Zebrabärbling) wird die Prüfung 60 Tage nach dem Schlüpfen beendet. ⁵¹⁸⁸Am Ende der Prüfung werden alle Fische getötet. ⁵¹⁸⁹Für die VTG-Analyse wird von jedem Fisch eine Probe von biologischem Material (Blutplasma oder Leber oder Kopf-/Schwanz-Homogenat) entnommen; der verbleibende Teil der Fische wird zur histologischen Gonadenuntersuchung zur Bestimmung des phänotypischen Geschlechts fixiert. ⁵¹⁹⁰Optional kann eine histopathologische Untersuchung vorgenommen werden (z. B. Entwicklungsstadium der Gonaden oder Grad der Intersexualität). ⁵¹⁹¹Bei Arten mit geeigneten Markern (siehe Anlagen 9 und 10) wird zur Bestimmung des genetischen Geschlechts eine Probe von biologischem Material (Schwanz- oder Rückenflosse) genommen. |
| 13. | Anlage 2 bietet einen Überblick über die Prüfbedingungen der validierten Arten (Japanischer Reiskärpfling, Dreistachliger Stichling und Zebrabärbling). |
INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 14. | ⁵¹⁹³Ergebnisse einer Prüfung der akuten Toxizität oder eines sonstigen kurzzeitigen Toxizitätstests (z. B. Prüfmethode C.14 (34) und OECD-Prüfrichtlinie 210 (1)), vorzugsweise für die in diesem Test verwendete Art, sollten vorliegen. ⁵¹⁹⁴Dafür müssen die Wasserlöslichkeit und der Dampfdruck der Prüfchemikalie bekannt und eine zuverlässige Analysemethode zur quantitativen Erfassung der Chemikalie in den Versuchsbecken mit bekannter und dokumentierter Genauigkeit und Nachweisgrenze verfügbar sein. |
| 15. | Weitere hilfreiche Informationen sind die Strukturformel, die Reinheit der Chemikalie, die Stabilität in Wasser und die Lichtbeständigkeit, pKa, Pow und die Ergebnisse einer Prüfung auf leichte biologische Abbaubarkeit (Prüfmethode C.4) (35). |
Validitätskriterien | 16. | Die Prüfergebnisse sind dann akzeptabel, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind:- —
- Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff liegt während der gesamten Prüfung mindestens bei 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts.
- —
- Die Wassertemperaturen der Versuchsbecken dürfen sich während der Expositionsdauer zu keinem Zeitpunkt um mehr als ± 1,5 °C unterscheiden und müssen in dem Temperaturbereich liegen, der für die jeweils im Test zu verwendenden Arten vorgesehen ist (Anlage 2);
- —
- eine validierte Methode zur Analyse der Prüfchemikalie mit einer Nachweisgrenze deutlich unter der niedrigsten nominellen Konzentration muss verfügbar sein, und es müssen hinreichende Belege dafür vorliegen, dass die Konzentrationen der Prüfchemikalie in der Lösung im Bereich von ± 20 % der mittleren Messwerte aufrechterhalten wurden;
- —
- insgesamt muss die Anzahl der überlebenden befruchteten Eier in den Kontrollen sowie ggf. in den Lösungsmittelkontrollen mindestens mit den in Anlage 2 genannten Grenzwerten übereinstimmen;
- —
- die Validitätskriterien im Zusammenhang mit dem Wachstum und dem Geschlechterverhältnis am Ende des Tests beruhen auf Daten der Kontrollgruppen (gepoolte Lösungsmittel- und Wasserkontrollen bzw. — wenn beide sich erheblich unterscheiden — ausschließlich der Lösungsmittelkontrolle):
| Japanischer Reiskärpfling | Zebrabärbling | Dreistachliger Stichling | | Wachstum | Feuchtmasse der Fische, trockengetupft | > 150 mg | > 75 mg | > 120 mg | | Länge (Standardlänge) | > 20 mm | > 14 mm | > 20 mm | | Geschlechterverhältnis (% männliche oder weibliche Tiere) | 30-70 % | 30-70 % | 30-70 % |
- —
- Ein verwendetes Lösungsmittel darf keine statistisch signifikante Wirkung auf das Überleben und keine endokrine oder in sonstiger Weise beeinträchtigende Wirkung auf die frühen Lebensstadien haben; dass diese Wirkungen nicht zu erwarten sind, ist anhand einer Lösungsmittelkontrolle nachzuweisen.
Wenn eine Abweichung von den Annahmekriterien des Tests festgestellt wird, sind die Konsequenzen im Hinblick auf die Zuverlässigkeit der Testdaten zu prüfen; die Ergebnisse dieser Prüfung sind in den Bericht aufzunehmen. |
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODEVersuchsbecken
| 17. | ⁵²⁰⁰Für den Test können beliebige Becken aus Glas, Edelstahl oder sonstigem chemisch inertem Material verwendet werden. ⁵²⁰¹Die Kammern müssen so groß bemessen sein, dass die im Folgenden genannten Besatzkriterien erfüllt werden. ⁵²⁰²Vorzugsweise werden die Versuchsbecken im Prüfbereich randomisiert aufgestellt. ⁵²⁰³Eine randomisierte Aufstellung, bei der jeweils sämtliche Konzentrationen in jedem Block enthalten sind, ist gegenüber einer vollständig randomisierten Aufstellung zu bevorzugen. ⁵²⁰⁴Die Versuchsbecken sind gegen unerwünschte Störungen abzuschirmen. |
Auswahl der im Test zu verwendenden Art | 18. | ⁵²⁰⁵In Anlage 2 werden empfohlene Fischarten genannt. ⁵²⁰⁶Die Verfahren zur Einbeziehung neuer Arten werden in Nummer 2 erläutert. |
Haltung der Elternfische | 19. | ⁵²⁰⁷Nähere Informationen zur Haltung der Elternfische sind der OECD-Prüfrichtlinie 210(1) zu entnehmen. ⁵²⁰⁸Die Elternfische sind ein- oder zweimal täglich mit geeignetem Futter zu versorgen. |
Handhabung von Embryos und Larven | 20. | ⁵²⁰⁹Zunächst können Embryos und Larven in einer Hauptkammer mit kleineren Glas- oder Edelstahlkammern ausgesetzt werden, die seitlich oder auf den Stirnseiten mit einem Sieb versehen sind, damit die Prüfchemikalie hindurchströmen kann. ⁵²¹⁰Um einen nicht verwirbelnden Strom durch diese kleinen Versuchsbecken zu erzeugen, können die Becken an einem Arm aufgehängt werden, mit dem sie angehoben und abgesenkt werden; die Organismen befinden sich dabei ständig unter Wasser. |
| 21. | ⁵²¹¹Wenn Eibehälter, Gitter oder Siebe verwendet wurden, um die Eier im Haupt-Versuchsbecken zu halten, sind die Behälter, Gitter oder Siebe nach dem Schlüpfen der Larven zu entfernen, es sei denn die Behälter werden benötigt, um ein Verlassen der Fische aus dem großen Behälter zu verhindern. ⁵²¹²Wenn die Larven umgesetzt werden, dürfen sie nicht mit der Umgebungsluft in Berührung kommen, und die Fische dürfen nicht mit einem Netz aus den Eierbehältern entnommen werden. ⁵²¹³Wann und ob überhaupt eine Umsetzung erfolgt, hängt von der jeweiligen Art ab. |
Wasser | 22. | ⁵²¹⁴Als Testwasser ist jedes Wasser geeignet, in dem die im Test verwendete Art unter kontrollierten Bedingungen nachweislich mindestens ebenso gut wie in dem in Anlage 3 beschriebenen Wasser überlebt. ⁵²¹⁵Während der gesamten Testdauer muss eine konstante Wasserqualität aufrechterhalten werden. ⁵²¹⁶Um sicherzustellen, dass das Wasser die Testergebnisse nicht unangemessen beeinträchtigt (indem es beispielsweise mit der Prüfchemikalie reagiert) oder dass das Wasser sich nicht auf das Verhalten des Zuchtbestands auswirkt, sind regelmäßig Proben zu nehmen. ⁵²¹⁷Zu messen sind der gesamte organisch gebundene Kohlenstoff (TOC), die Leitfähigkeit, der pH-Wert und die suspendierten Feststoffe, beispielsweise alle drei Monate, wenn das Wasser bekanntermaßen von verhältnismäßig konstanter Qualität ist. Bei zweifelhafter Wasserqualität müssen die Anteile an Schwermetallen (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd und Ni) sowie an wichtigen Anionen und Kationen (z. B. Ca2+, mg2+, Na+, K+, Cl– und SO42–) und Pestiziden gemessen werden. ⁵²¹⁸Nähere Informationen zu chemischen Analysen und zur Entnahme des Wassers sind Nummer 34 zu entnehmen. |
Prüflösungen | 23. | ⁵²¹⁹Nach Möglichkeit sollten Durchflusssysteme verwendet werden. ⁵²²⁰Für Durchflusstests wird für die Versorgung der Versuchsbecken mit unterschiedlichen Konzentrationen ein System benötigt, das kontinuierlich eine Stammlösung der Prüfchemikalie abgibt und verdünnt (z. B. eine Dosierpumpe, ein Proportionalverdünner oder eine Sättigungsvorrichtung). ⁵²²¹Die Durchflussraten von Stammlösungen und Wasser sind während des Tests regelmäßig zu prüfen und dürfen während des Tests höchstens um 10 % schwanken. ⁵²²²Ein Durchfluss entsprechend mindestens fünf Becken-Volumina in 24 Stunden hat sich als angemessen erwiesen (1). ⁵²²³Leitungen aus Kunststoff oder aus sonstigen Materialien, die zum Teil biologisch aktive Chemikalien enthalten oder die Prüfchemikalie adsorbieren können, sind zu vermeiden. |
| 24. | ⁵²²⁴Die Stammlösung wird vorzugsweise ohne Lösungsmittel hergestellt, indem die Prüfchemikalie einfach mechanisch (z. B. durch Rühren oder mit Ultraschall) in das Wasser gemischt wird. Wenn die Prüfchemikalie in Wasser schwer löslich ist, wird verfahren, wie im OECD Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures beschrieben (36). ⁵²²⁵Der Einsatz von Lösungsmitteln sollte vermieden werden, ist aber unter Umständen in Einzelfällen erforderlich, um eine Stammlösung von geeigneter Konzentration zu erzielen. ⁵²²⁶In (36) werden einige geeignete Lösungsmittel genannt. |
| 25. | ⁵²²⁷Semistatische Testbedingungen sollten vermieden werden, wenn keine zwingenden Gründe im Zusammenhang mit der jeweiligen Prüfchemikalie (Stabilität, eingeschränkte Verfügbarkeit, hohe Kosten oder Risiken usw.) gegeben sind. ⁵²²⁸Bei semistatischen Tests können zwei unterschiedliche Verfahren zur Erneuerung des Wassers verwendet werden. ⁵²²⁹Entweder werden neue Testlösungen in sauberen Kammern hergestellt, und die überlebenden Eier und Larven werden vorsichtig in die neuen Kammern umgesetzt, oder die Testorganismen werden in den Versuchsbecken belassen, und ein Teil des Testwassers (mindestens zwei Drittel) wird täglich erneuert. |
VERFAHRENExpositionsbedingungen
Entnahme der Eier und Dauer der Prüfung
| 26. | ⁵²³⁰Um einen Bias durch genetische Effekte zu vermeiden, werden für den Beginn des Tests Eier von mindestens drei Brutpaaren oder Gruppen entnommen, gemischt und zufällig ausgewählt. ⁵²³¹Bei Dreistachligen Stichlingen ist die Beschreibung der künstlichen Befruchtung in Anlage 11 zu beachten. ⁵²³²Der Test sollte möglichst bald nach der Befruchtung der Eier beginnen; die Embryos werden vorzugsweise vor dem Blastula-Stadium oder zumindest möglichst bald nach diesem Stadium und spätestens 12 h nach der Befruchtung in die Testlösungen eingesetzt. ⁵²³³Der Test wird fortgesetzt, bis die Geschlechtsdifferenzierung in der Kontrollgruppe abgeschlossen ist (bei Japanischen Reiskärpflingen, Dreistachligen Stichlingen und Zebrabärblingen 60 Tage nach dem Schlüpfen). |
Besatz | 27. | ⁵²³⁴Zu Beginn des Tests müssen mindestens 120 befruchtete Eier pro Konzentration auf mindestens 4 Replikate verteilt werden. ⁵²³⁵(Eine Aufteilung auf die Kontrollen nach dem Quadratwurzelgesetz von Penrose ist annehmbar.) Die Eier werden randomisiert (mithilfe statistischer Tabellen) auf die verschiedenen Konzentrationen verteilt. ⁵²³⁶Die Besatzrate (Begriffsbestimmung siehe Anlage 1) muss so gering sein, dass ein Gehalt an gelöstem Sauerstoff von mindestens 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts ohne direkte Belüftung der Kammern aufrechterhalten werden kann. ⁵²³⁷Bei Durchflusstests ist eine Besatzrate von 0,5 g/l in 24 Stunden und ständig höchstens 5 g/l Lösung zu empfehlen. ⁵²³⁸Spätestens 28 Tage nach der Befruchtung sind die Fische so auf die einzelnen Replikate umzuverteilen, dass die Replikate jeweils möglichst genau die gleiche Anzahl an Fischen enthalten. ⁵²³⁹Wenn es zu expositionsbedingter Mortalität kommt, ist die Anzahl der Replikate entsprechend zu reduzieren, damit die Besatzdichte immer möglichst einheitlich ist. |
Licht und Temperatur | 28. | Die Photoperiode und die Wassertemperatur müssen auf die jeweilige Testspezies abgestimmt sein. (Zu den Versuchsbedingungen des FSDT siehe Anlage 2.) |
Fütterung | 29. | ⁵²⁴¹Die Futterqualität und die Bereitstellung des Futters sind von entscheidender Bedeutung; für jedes Entwicklungsstadium muss das richtige Futter in den richtigen Intervallen und in hinreichender Menge angeboten werden, damit die Tiere sich normal entwickeln können. ⁵²⁴²Die Fütterung erfolgt ad libitum; ein Überangebot sollte aber möglichst vermieden werden. ⁵²⁴³Um ein hinreichendes Wachstum zu ermöglichen, müssen die Fische mindestens zweimal (bzw. an Wochenenden auch nur einmal) täglich gefüttert werden; zwischen den Fütterungszeiten sollten jeweils mindestens drei Stunden liegen. ⁵²⁴⁴Nicht verzehrtes Futter und Kot sind gegebenenfalls zu entfernen, damit sich keine Verunreinigungen ansammeln. ⁵²⁴⁵Mit zunehmender praktischer Erfahrung werden Futterqualität und Fütterungszeiten kontinuierlich optimiert, um bestmögliche Überlebens- und Wachstumsbedingungen zu erzielen. ⁵²⁴⁶Daher müssen anerkannte Fachleute das vorgeschlagene Fütterungsprotokoll bestätigen. ⁵²⁴⁷24 Stunden vor Ende des Tests ist die Fütterung einzustellen. ⁵²⁴⁸In Anlage 2 werden einige Beispiele für geeignetes Futter genannt (siehe auch OECD-Rahmenleitlinien für Fischtests) (39). |
Prüfkonzentrationen | 30. | ⁵²⁴⁹Die Prüfchemikalien sind in den in Anlage 4 genannten Konzentrationen zu verwenden. ⁵²⁵⁰Bei mindestens vier Replikaten sind mindestens drei Prüfkonzentrationen zu verwenden. Die Kurve der LC50-Werte im Verhältnis zur Expositionsdauer in den verfügbaren akuten Toxizitätstests ist bei der Auswahl des Spektrums der Prüfkonzentrationen zu berücksichtigen. ⁵²⁵¹Wenn die Daten zur Risikobewertung verwendet werden sollen, werden fünf Prüfkonzentrationen empfohlen. |
| 31. | Konzentrationen von mehr als 10 % des LC50-Werts für akute Toxizität bei adulten Tieren bzw. von mehr als 10 mg/l brauchen nicht geprüft zu werden. (Maßgeblich ist der jeweils niedrigere Wert.) Die maximale Prüfkonzentration sollte bei 10 % des LC50-Wertes für die Larven/juvenilen Tiere liegen. |
Kontrollgefäße | 32. | ⁵²⁵³Zusätzlich zu den Prüfkonzentrationen werden eine Kontrolle mit Wasser (≥ 4 Replikate) sowie gegebenenfalls eine Lösungsmittelkontrolle (≥ 4 Replikate) benötigt. ⁵²⁵⁴Im Test sind ausschließlich Lösungsmittel zu verwenden, die nachweislich keine statistisch signifikante Wirkung auf die Endpunkte des Tests haben. |
| 33. | ⁵²⁵⁵Wenn ein Lösungsmittel verwendet wird, darf die Endkonzentration nicht mehr als 0,1 ml/l (36) betragen; außerdem muss die Konzentration in allen Versuchsbecken mit Ausnahme der Kontrolle mit dem Wasser gleich sein. ⁵²⁵⁶Allerdings sollte die Verwendung der Lösungsmittel möglichst unbedingt vermieden werden, und die Konzentrationen der Lösungsmittel sollten auf ein Minimum begrenzt werden. |
Häufigkeit der analytischen Bestimmungen und Messungen | 34. | ⁵²⁵⁷Vor Beginn des Tests ist durch chemische Analysen der Konzentrationen der Prüfchemikalie zu prüfen, ob die Validitätskriterien erfüllt sind. ⁵²⁵⁸Alle Replikate sind zu Beginn und am Ende des Tests einzeln zu analysieren. ⁵²⁵⁹Pro Prüfkonzentration wird während der Testdauer mindestens einmal wöchentlich ein Replikat analysiert; dabei sind die Replikate regelmäßig abzuwechseln (1, 2, 3, 4, 1, 2…). ⁵²⁶⁰Wenn Proben für eine Analyse zu einem späteren Zeitpunkt aufbewahrt werden, muss die Methode zur Lagerung der Proben zuvor validiert worden sein. ⁵²⁶¹Um sicherzustellen, dass die zu analysierende Chemikalie tatsächlich vollständig gelöst ist, sind die Proben zu filtern (z. B. mit einer Porengröße von 0,45 μm) oder zu zentrifugieren. |
| 35. | ⁵²⁶²Während des Tests werden der gelöste Sauerstoff, der pH-Wert, die Gesamthärte, die Leitfähigkeit, der Salzgehalt (soweit von Bedeutung) und die Temperatur in allen Becken gemessen. ⁵²⁶³Der Anteil an gelöstem Sauerstoff, der Salzgehalt (soweit von Bedeutung) und die Temperatur sind mindestens wöchentlich und der pH-Wert, die Leitfähigkeit und die Härte jeweils zu Beginn und am Ende des Tests zu messen. ⁵²⁶⁴Die Temperatur sollte vorzugsweise in mindestens einem Prüfgefäß kontinuierlich überwacht werden. |
| 36. | ⁵²⁶⁵Die Ergebnisse sollten auf gemessene Konzentrationen bezogen werden. ⁵²⁶⁶Wenn die Konzentration der gelösten Prüfchemikalie während der gesamten Testdauer zufriedenstellend aufrechterhalten wurde (± 20 % der nominellen Konzentration), können auch die Nennwerte oder die gemessenen Werte zugrunde gelegt werden. |
Beobachtungen und MessungenEmbryonale Entwicklungsstadien
| 37. | Die Exposition beginnt möglichst bald nach der Befruchtung, vor dem Balstula -Stadium und spätestens 12 h nach der Befruchtung, damit eine Exposition auch bereits im frühen Embryonalstadium gegeben ist. |
Schlupfrate und Überlebensrate | 38. | ⁵²⁶⁸Mindestens einmal täglich wird geprüft, ob Jungtiere geschlüpft sind und wie viele noch leben; die entsprechenden Zahlen werden protokolliert. ⁵²⁶⁹Tote Embryos, Larven und juvenile Fische sind möglichst zu entfernen, nachdem sie bemerkt wurden; sonst könnten sie sich rasch zersetzen und unter Einwirkung der übrigen Fische zerstört werden. ⁵²⁷⁰Beim Entfernen toter Tiere ist mit höchster Sorgfalt vorzugehen, damit andere Eier bzw. Larven (die äußerst empfindlich sind) nicht durch Stöße oder auf sonstige Weise mechanisch beschädigt werden. Je nach Lebensstadium gibt es unterschiedliche Kriterien für die Mortalität:- —
- Eier: insbesondere in den frühen Stadien eine ausgeprägte Verringerung der Lichtdurchlässigkeit sowie Farbänderungen durch Koagulation und/oder ausgefällte Proteine und entsprechend weißliches und opakes Aussehen der Eier;
- —
- Larven und juvenile Fische: Unbeweglichkeit und/oder Fehlen von Atembewegungen und/oder Herzschlägen und/oder opake weiße Verfärbung des zentralen Nervensystems und/oder fehlende Reaktion auf mechanische Reize.
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Anomales Aussehen | 39. | ⁵²⁷¹Die Anzahl der Larven oder Fische mit anomaler Körperform ist zu protokollieren; außerdem ist die Art der Anomalität zu beschreiben. ⁵²⁷²Anomale Embryos und Larven kommen auch natürlich vor und können in den Kontrollen bei einigen Arten im Bereich von mehreren Prozent liegen. ⁵²⁷³Anomale Tiere sind erst nach dem Tod aus den Becken zu entfernen. ⁵²⁷⁴Nach Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere sind diese Tiere jedoch wie in Nummer 44 beschrieben zu betäuben und zu töten, wenn die Anomalien, Schmerzen, Leiden oder Stressbelastung oder anhaltende Schäden zur Folge haben und der Tod der Tiere zuverlässig absehbar ist; in der Datenanalyse sind die Tiere dann als gestorben zu behandeln. |
Anomales Verhalten | 40. | Festgestellte Anomalien (z. B. Hyperventilation, unkoordiniertes Schwimmverhalten, untypisch ruhiges Verhalten und untypisches Fressverhalten) sind zu protokollieren. |
Gewicht | 41. | Am Ende des Tests werden alle überlebenden Fische getötet (betäubt, wenn Blutproben genommen werden müssen); anschließend wird jeweils die Feuchtmasse (trockengetupft) gemessen. |
Länge | 42. | Am Ende des Tests ist die Länge (Standardlänge) der einzelnen Fische zu messen. |
| 43. | Aufgrund dieser Beobachtungen können die folgenden Daten teilweise oder vollständig in den Berichten erfasst werden:- —
- kumulative Mortalität;
- —
- Anzahl gesunder Fische am Ende des Tests;
- —
- Dauer des Schlupfprozesses (Beginn und Ende);
- —
- Länge und Gewicht der überlebenden Tiere;
- —
- Anzahl der Larven mit Fehlbildungen;
- —
- Anzahl der Fische mit Verhaltensauffälligkeiten.
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Entnahme von Fischen | 44. | ⁵²⁷⁹Das Beproben der Fische wird am Ende des Tests durchgeführt. ⁵²⁸⁰Die Fische werden z. B. mit MS-222 (100-500 mg/l gepuffert mit 200 mg NaHCO3/l) oder mit FA-100 (4-Allyl-2-methoxyphenol: Eugenol) getötet und einzeln gemessen und gewogen (Feuchtmasse, trockengetupft) bzw. betäubt, wenn eine Blutprobe genommen werden soll (siehe Nummer 49). |
Probenahme für die VTG-Analyse und für die Geschlechtsbestimmung durch histologische Untersuchung | 45. | ⁵²⁸¹Zur Probenahme sind alle Fische zu entnehmen und für die VTG-Analyse und die Geschlechtsbestimmung vorzubereiten. ⁵²⁸²Zur Geschlechtsbestimmung werden alle Fische histologisch untersucht. ⁵²⁸³Für die VTG-Messungen ist eine Teilprobe von mindestens 16 Fischen aus den einzelnen Replikaten annehmbar. ⁵²⁸⁴Wenn die Ergebnisse der Teilproben sich als nicht eindeutig herausstellen, ist eine größere Anzahl an Fischen einer VTG-Analyse zu unterziehen. |
| 46. | Die Verfahren zur Probenahme für VTG-Analysen und Geschlechtsbestimmungen hängen von der jeweils eingesetzten Methode zur VTG-Analyse ab: |
VTG-Analyse mit der Kopf-/Schwarz-Homogenat-Methode | 47. | ⁵²⁸⁵Die Fische werden getötet. ⁵²⁸⁶Kopf und Schwanz werden jeweils durch Schnitte unmittelbar hinter den Brustflossen und unmittelbar hinter der Rückenflosse mit einem scharfen Skalpell vom Körper getrennt (siehe Abbildung 1). ⁵²⁸⁷Köpfe und Schwänze der Fische werden gepoolt, gewogen, einzeln nummeriert, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei mindestens – 70 °C zur VTG-Analyse aufbewahrt. ⁵²⁸⁸Der Körper der Fische wird ebenfalls nummeriert und in einer geeigneten Fixierlösung zur histologischen Untersuchung fixiert (22). ⁵²⁸⁹Bei dieser Methode wird jedes einzelne Exemplar einer VTG-Analyse und einer histopathologischen Untersuchung unterzogen; eine mögliche Änderung des VTG-Wertes kann dann in Beziehung zum phänotypischen oder zum genotypischen Geschlecht (Japanischer Reiskärpfling und Dreistachliger Stichling) gesetzt werden. ⁵²⁹⁰Weitere Informationen sind den Leitlinien zur Homogenisierung (Anlage 5) sowie den Leitlinien für eine quantitative Bestimmung des VTG-Wertes (Anlage 6) zu entnehmen. |
VTG-Analyse mit der Leber-Homogenat-Methode | 48. | ⁵²⁹¹Die Fische werden getötet. ⁵²⁹²Die Leber wird herauspräpariert und bei mindestens – 70 °C gelagert. ⁵²⁹³Empfohlene Verfahren zum Herauspräparieren und zur Vorbehandlung der Leber sind OECD-Prüfrichtlinie 229 (37) oder OECD-Prüfrichtlinie 230 zu entnehmen (38). ⁵²⁹⁴Anschließend werden die Lebern einzeln homogenisiert, wie in den OECD-Prüfrichtlinien 229 oder 230 beschrieben. ⁵²⁹⁵Der Überstand wird zur VTG-Messung mit einem homologen ELISA-Verfahren entnommen. ⁵²⁹⁶(Ein Beispiel für die quantitative Bestimmung bei Zebrabärblingen wird in Anlage 6 beschrieben; die quantitative Bestimmung beim Japanischen Reiskärpfling wird in der OECD-Prüfrichtlinie 229 (37) erläutert.) Bei diesem Verfahren können auch Daten zu einzelnen Fischen sowohl aus der VTG-Analyse als auch aus der histologischen Gonadenuntersuchung ermittelt werden. |
VTG-Analyse mit der Blutplasma-Methode | 49. | ⁵²⁹⁷Den betäubten Fischen wird mit einer Herzpunktion oder durch einen Schnitt in die Schwanzvene oder in den Schwanz Blut entnommen; das Blut wird zur Plasmagewinnung bei 4 °C zentrifugiert. ⁵²⁹⁸Bis zur Verwendung wird das Plasma bei mindestens – 70 °C gelagert. ⁵²⁹⁹Die Fische werden getötet und zur histologischen Untersuchung fixiert. ⁵³⁰⁰Die Plasmaproben und die Fische werden einzeln nummeriert, um VTG-Konzentrationen dem Geschlecht der Fische zuordnen zu können.Abbildung 1
Sezieren der Fische zur VTG-Messung an einem Kopf-/Schwanz-Homogenat und zur histologischen Analyse des mittleren Abschnitts
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Bestimmung des genetischen Geschlechts | 50. | ⁵³⁰¹Von einzelnen Fischen von Arten mit geeigneten Markern wird eine biologische Probe zur Bestimmung des genetischen Geschlechts entnommen. ⁵³⁰²Bei Japanischen Reiskärpflingen werden die Afterflosse und die Rückenflosse verwendet. ⁵³⁰³Eine detaillierte Beschreibung einschließlich Erläuterungen zur Entnahme von Gewebeproben und zur Geschlechtsbestimmung mit einem PCR-Verfahren (PCR = Polymerase-Kettenreaktion) ist Anlage 9 zu entnehmen. ⁵³⁰⁴Die Entnahme von Gewebeproben und die Geschlechtsbestimmung durch PCR bei Dreistachligen Stichlingen werden in Anlage 10 beschrieben. |
VTG-Messung | 51. | ⁵³⁰⁵Die Messung der VTG-Konzentration muss auf einer quantitativen und einer analytisch validierten Methode bestehen. ⁵³⁰⁶Informationen zur Intra- und Inter-Assay-Variabilität der Methode sollten verfügbar sein. ⁵³⁰⁷Ursache der Intra- und Inter-Assay-Variabilität sind (sehr wahrscheinlich) die verschiedenen Entwicklungsstadien der Fischpopulation. ⁵³⁰⁸Angesichts der Variabilität bei den VTG-Messungen sind allein mit diesem Endpunkt ermittelte NOECs mit erheblicher Vorsicht zu bewerten. ⁵³⁰⁹Die Bewertung der VTG-Produktion bei der in diesem Test berücksichtigten Fischart kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Ein sowohl verhältnismäßig empfindliches als auch hinreichend spezifisches Messverfahren besteht in der Bestimmung von Proteinkonzentrationen mit einem ELISA-Verfahren (ELISA = Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). ⁵³¹⁰Im Test sind homologe Antikörper (gebildet gegen VTG der jeweiligen Art) sowie die wichtigsten homologen Standards zu verwenden. |
Geschlechtsbestimmung | 52. | ⁵³¹¹Je nach Probenahmeverfahren bei VTG-Bestimmungen wird der gesamte Fisch oder der verbleibende mittlere Abschnitt der einzelnen Fische in eine bereits gekennzeichnete Bearbeitungskassette gelegt und in einer geeigneten Lösung zur histologischen Geschlechtsbestimmung (sowie optional auch zur Bewertung des Entwicklungszustands der Gonaden) fixiert. Nähere Informationen zum Fixieren und zum Einbetten sind Anlage 7 sowie dem OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22) zu entnehmen. ⁵³¹²Nach der Vorbereitung wird der Fisch in Paraffinblöcke eingebettet. ⁵³¹³Die einzelnen Tiere sind der Länge nach in einen Paraffinblock zu legen. ⁵³¹⁴Von jedem Fisch werden mindestens sechs Längsschnitte (mit einer Stärke von 3-5 μm) in der Frontalebene einschließlich des Gewebes aus beiden Gonaden hergestellt. ⁵³¹⁵Diese Schnitte sollten im Abstand von etwa 50 μm bei männlichen Tieren und von 250 μm bei weiblichen Tieren erfolgen. ⁵³¹⁶Da jeder Block häufig sowohl männliche als auch weibliche Tiere enthält (wenn in einen Block mehrere Fische eingebettet wurden), sollte der Abstand zwischen den einzelnen Schnitten etwa 50 μm betragen, bis von jedem männlichen Exemplar mindestens sechs Schnitte aus dem Gonadengewebe hergestellt wurden. ⁵³¹⁷Anschließend kann der Abstand zwischen den Schnitten bis auf etwa 250 μm bei weiblichen Fischen erhöht werden. ⁵³¹⁸Die Schnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und unter einem Lichtmikroskop unter schwerpunktmäßiger Berücksichtigung des Geschlechts (männlich, weiblich, intersexuell oder nicht differenziert) untersucht. ⁵³¹⁹Eine Intersexualität ist dann festzustellen, wenn bei sechs analysierten Schnitten in den Hoden mehr als ein Oozyt erkannt wird, oder wenn in den Ovarien Spermatogenesezellen nachgewiesen werden (ja/nein). ⁵³²⁰Die histopathologische Untersuchung und die Bewertung des Entwicklungsstadiums von Ovarien und Hoden ist fakultativ; wenn eine Untersuchung vorgenommen wird, müssen die Ergebnisse statistisch analysiert und im Bericht erfasst werden. ⁵³²¹Bei einigen Fischarten sind die Gonadenpaare von Natur aus nicht vollständig entwickelt; diese Fische verfügen vielleicht nur über eine einzelne Gonade (z. B. Japanische Reiskärpflinge und gelegentlich Zebrabärblinge). ⁵³²²Die entsprechenden Beobachtungen sind zu protokollieren. |
| 53. | ⁵³²³Zur Bestimmung des genetischen Geschlechts bei einzelnen Japanischen Reiskärpflingen wird geprüft, ob das männliche Determinationsgen DMY auf dem Y-Chromosom vorhanden ist. ⁵³²⁴Das genotypische Geschlecht der Reiskärpflinge kann durch Sequenzieren des DMY-Gens aus DNA bestimmt werden, die beispielsweise aus einem Stück der After- oder der Rückflosse gewonnen wurde. ⁵³²⁵Unabhängig vom Phänotyp kennzeichnet das DMY-Gen die männlichen Tiere (XY); entsprechend ist das Fehlen des DMY-Gens unabhängig vom Phänotyp als Beleg für das Vorliegen eines weiblichen Tieres (XX) anzunehmen (23). ⁵³²⁶Leitlinien zur Präparation der Gewebe und zur PCR-Methode sind Anlage 9 zu entnehmen. ⁵³²⁷Die Bestimmung des genetischen Geschlechts bei einzelnen Dreistachligen Stichlingen erfolgt mit einer PCR-Methode (siehe Anlage 10). |
| 54. | Eine festgestellte Intersexualität (Begriffsbestimmung siehe Anlage 1) ist im Bericht zu vermerken. |
Sekundäre Geschlechtsmerkmale | 55. | ⁵³²⁹Sekundäre Geschlechtsmerkmale werden bei Arten wie dem Japanischen Reiskärpfling hormonell gesteuert. ⁵³³⁰Daher ist am Ende der Expositionsdauer möglichst auch das physische Aussehen der Fische zu prüfen. ⁵³³¹Bei Japanischen Reiskärpflingen reagiert die Papillenbildung im hinteren Teil der Afterflosse bei Weibchen androgensensitiv. ⁵³³²In diesem Anhang enthält Kapitel C.37 (38) Fotos sekundärer männlicher Geschlechtsmerkmale und maskulinisierter Weibchen. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 56. | ⁵³³³Wichtig ist, dass der Endpunkt mit dem gültigen statistischen Test mit der höchsten Aussagekraft bestimmt wird. ⁵³³⁴Die Replikate werden jeweils als Versuchseinheit behandelt; Variabilität innerhalb eines Replikats ist in den statistischen Tests zu berücksichtigen. ⁵³³⁵Anlage 8 enthält ein Flussdiagramm, das die Auswahl des angesichts der Merkmale der zu ermittelnden Daten jeweils am besten geeigneten statistischen Tests erleichtern soll. ⁵³³⁶Das Signifikanzniveau beträgt für alle Endpunkte 0,05. |
Geschlechterverhältnisse und genetisches Geschlecht | 57. | ⁵³³⁷Bei einer monotonen Dosis-Wirkungs-Beziehung sind die Geschlechterverhältnisse mit dem Jonckheere-Terpstra-Test (Trend-Test) im Hinblick auf signifikante Expositionswirkungen zu analysieren (NOEC-/LOEC-Ansatz). ⁵³³⁸Wenn keine Monotonie festgestellt wird, kann ein paarweiser Test durchgeführt werden. ⁵³³⁹Der Dunnett-Test ist bei Normalverteilung und Varianzhomogenität vorzunehmen. ⁵³⁴⁰Bei heterogener Varianz wird der Tamhane-Dunnett-Test durchgeführt. ⁵³⁴¹Ansonsten ist der Exakt Mann-Whitney-Test mit Anpassung nach Bonferroni-Holm vorzunehmen. ⁵³⁴²Anlage 8 enthält ein Flussidagramm mit statistischen Angaben zu den Geschlechterverhältnissen. ⁵³⁴³Die Geschlechterverhältnisse sind tabellarisch als Konzentrationsverhältnisse ± Standardabweichung der männlichen, weiblichen, intersexuellen und nicht differenzierten Tiere darzustellen. ⁵³⁴⁴Die statistische Signifikanz ist besonders hervorzuheben. ⁵³⁴⁵Beispiele sind dem Validierungsbericht über den FSDT Phase 2 zu entnehmen (42). ⁵³⁴⁶Das genetische Geschlecht ist als Prozentanteil der Umwandlung des phänotypischen Geschlechts bei männlichen, weiblichen, intersexuellen und nicht differenzierten Tieren zu protokollieren. |
VTG-Konzentrationen | 58. | ⁵³⁴⁷VTG-Konzentrationen sind auf signifikante Expositionswirkungen zu untersuchen (NOEC-/LOEC-Ansatz). ⁵³⁴⁸Der Dunnett-Test ist dem t-Test mit Bonferroni-Korrektur vorzuziehen. ⁵³⁴⁹Wenn eine Bonferroni-Korrektur vorgenommen wird, ist eine Anpassung nach Bonferroni-Holm vorzuziehen. ⁵³⁵⁰Zur Erzielung einer Normalverteilung und der nötigen Varianzhomogenität wird eine Log-Transformation der VTG-Werte vorgesehen. ⁵³⁵¹Wenn dann eine monoton ansteigende Dosis-Wirkungsbeziehung festgestellt werden kann, sollte anstelle aller oben genannten Tests der Jonckheere-Terpstra-Test vorgenommen werden. ⁵³⁵²Wenn t-Tests oder der Dunnett-Test durchgeführt werden, können die folgenden Schritte ausgeführt werden, ohne im Rahmen einer ANOVA zunächst einen F-Test zur Prüfung auf Signifikanz durchzuführen. ⁵³⁵³Nähere Informationen sind Anlage 8 zu entnehmen. ⁵³⁵⁴Die Ergebnisse werden in einer Tabelle als mittlere Konzentrationen ± Standardabweichung für männliche, weibliche, intersexuelle und nicht differenzierte Fische getrennt dargestellt. ⁵³⁵⁵Die statistische Signifikanz phänotypischer Weibchen und phänotypischer Männchen ist besonders hervorzuheben. ⁵³⁵⁶Beispiele sind dem Validierungsbericht über den FSDT Phase 2 zu entnehmen (42). |
Tatsächliche Konzentrationen der Prüfchemikalie | 59. | ⁵³⁵⁷Die tatsächlichen Konzentrationen der Prüfchemikalie in den Aquarien sind in den in Nummer 34 genannten Intervallen zu bestimmen. ⁵³⁵⁸Die Ergebnisse werden in Tabellen als mittlere Konzentration ± Standardabweichung bezogen auf die Replikate sowie bezogen auf Konzentrationen unter Angabe der Anzahl der Proben erfasst; Ausreißer gegenüber der mittleren Prüfkonzentration ± 20 % sind besonders hervorzuheben. ⁵³⁵⁹Beispiele sind dem Validierungsbericht über den FSDT Phase 2 zu entnehmen (42). |
Interpretation der Ergebnisse | 60. | Die Testergebnisse sind mit Vorsicht zu bewerten, wenn sich die gemessenen Konzentrationen der Prüfchemikalie in Testlösungen in der Nähe der Nachweisgrenze der jeweiligen Analysemethode bewegen. |
Prüfbericht | 61. | Das Prüfprotokoll enthält die folgenden Informationen: | Prüfchemikalie| — | relevante physikalisch-chemische Merkmale; chemischer Name; Daten u. a. zur Reinheit und zur Analysemethode zur Quantifizierung der Prüfchemikalie. |
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| Prüfbedingungen- —
- verwendetes Testverfahren (z. B. Durchfluss, semistatisch oder Erneuerung); Prüfprotokoll einschließlich Prüfkonzentrationen, Methode zur Herstellung der Stammlösungen (in einem Anhang), Häufigkeit der Erneuerung (wenn verwendet, sind das Lösungsmittel und die Konzentration des Lösungsmittels anzugeben);
- —
- die nominellen Prüfkonzentrationen, die Mittelwerte der gemessenen Werte und die jeweiligen Standardabweichungen in den Becken sowie die Methode zur Ermittlung dieser Werte (die verwendete Analysemethode ist in einem Anhang zu beschreiben); Nachweise dafür, dass sich die Messungen der Konzentrationen auf die vollständig gelöste Prüfchemikalie beziehen;
- —
- Wasserqualität in den Becken; pH-Wert, Härte, Temperatur und Anteil des gelösten Sauerstoffs;
- —
- detaillierte Angaben zur Fütterung (z. B. Art des Futters, Herkunft, Menge und Häufigkeit der Fütterung sowie gegebenenfalls Analysen auf Verunreinigungen (z B. PCB, PAH und chlororganische Pestizide)).
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| Ergebnisse- —
- Belege dafür, dass die Kontrollen die Validitätskriterien erfüllt haben: Daten zur Schlupfrate sind in Tabellen als Prozentanteile pro Replikat und pro Konzentration anzugeben. ⁵³⁶⁵Ausreißer bezogen auf die Validitätskriterien (in den Kontrollen) sind besonders hervorzuheben. ⁵³⁶⁶Die Überlebensrate ist als Prozentanteil pro Replikat und pro Konzentration anzugeben. ⁵³⁶⁷Ausreißer bezogen auf die Validitätskriterien (in den Kontrollen) sind besonders hervorzuheben.
- —
- klare Angaben der ermittelten Ergebnisse zu den verschiedenen Endpunkten: Überlebensrate der Embryos und Schlupfrate; äußerliche Anomalien; Länge und Gewicht; VTG-Messungen (ng/g Homogenat, ng/ml Plasma oder ng/mg Leber); histologische Gonadenuntersuchung, Geschlechterverhältnis; Daten zum genetischen Geschlecht; ungewöhnliche Reaktionen der Fische sowie jegliche sichtbare Wirkungen der Prüfchemikalie.
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| 62. | ⁵³⁶⁹Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) bzw. Standardfehler anzugeben. ⁵³⁷⁰Die Statistiken müssen mindestens die NOEC und die LOEC sowie die Konfidenzintervalle enthalten. ⁵³⁷¹Das statistische Flussdiagramm (Anlage 8) ist zu berücksichtigen. |
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| (8) | Panter, G.H., T.H. Hutchinson, R. ⁵³⁹²Lange, C.M. Lye, J.P. Sumpter, M. ⁵³⁹³Zerulla und C.R. Tyler (2002), ‚Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances‘, Environmental Toxicology and Chemistry 21, S. 319-326. |
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| (30) | Morthorst, J.E., H. ⁵⁴⁶⁴Holbech und P. ⁵⁴⁶⁵Bjerregaard (2010), ‚Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations‘, Aquatic Toxicology 98, S. 336-343. |
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| (32) | Panter, G.H., T.H. Hutchinson, K.S. Hurd, A. Sherren, R.D. Stanley und C.R. Tyler (2004), ‚Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development‘, Aquatic Toxicology 70, S. 11-21. |
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| (34) | Kapitel C.14 dieses Anhangs, Wachstumstest an Jungfischen. |
| (35) | Kapitel C.4 in diesem Anhang, Leichte biologische Abbaubarkeit. |
| (36) | OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Series on Testing and Assessment No. 23, OECD, Paris. |
| (37) | OECD (2009), Fish Short Term Reproduction Assay, Test Guideline No. 229, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. |
| (38) | Kapitel C.37 in diesem Anhang, 21-Tage-Fischtest: eine Kurzzeitprüfung auf Östrogen- und Androgenaktivität und auf Aromatasehemmung. |
| (39) | OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Series on Testing and Assessment No. 171, OECD, Paris |
| (40) | Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), ‚Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio‘ Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10, S 768-779. |
| (41) | OECD (2011), Validation Report (Phase 1) for the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 141, ENV/JM/MONO(2011)22, OECD, Paris. |
| (42) | OECD (2011), Validation Report ( Phase 2) for the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 142, ENV/JM/MONO(2011)23, OECD, Paris. |
| (43) | OECD (2011), Peer Review Report of the validation of the Fish Sexual Development Test, Series on Testing and Assessment No 143, ENV/JM/MONO(2011)24, OECD, Paris. |
Anlage 1Abkürzungen und Begriffsbestimmungen
Apikaler Endpunkt: Punkt, an dem eine Wirkung auf Populationsebene verursacht wird.
ASV: Air Saturation Value (Luftsauerstoff-Sättigungswert)
Biomarker: Punkt, an dem eine Wirkung auf individueller Ebene verursacht wird.
Chemikalie: ein Stoff oder ein Gemisch
Dph: Days post hatch (Tage nach dem Schlüpfen)
DMY: Y-spezifisches Determinationsgen; wichtig für die Entwicklung männlicher Japanischer Reiskärpflinge
ELISA:
Enzyme-Linked Immunosorbent AssayFischmasse: Feuchtmasse der Fische, trockengetupftFSDT:
Fish Sexual Development TestHPG-Achse: Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-AchseIntersexueller Fisch: Fisch mit mehr als einem Oozyten in den Hoden bei 6 analysierten Schnitten bzw. mit Spermatogenesezellen in den Ovarien (ja/nein)
Besatzrate: Feuchtmasse eines Fischs pro Wasservolumen
MOA: Mode Of Action (Wirkmechanismus)
RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion)
Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode getestet wird.
Nicht differenzierter Fisch: Fisch mit Gonaden ohne identifizierbare (männlich/weiblich) Keimzellen.
VTG: Vitellogenin
Anlage 2
Versuchtsbedingungen des FSDT (Süsswasser-Arten)
| Japanischer Reiskärpfling (Oryzias latipes) | Zebrabärbling (Danio rerio) | Dreistachliger Stichling (Gasterostreus aculeatus) | | Durchfluss oder semistatisch: | Durchfluss oder semistatisch: | Durchfluss oder semistatisch: | | 25 ± 2 °C | 27 ± 2 °C | 20 ± 2 °C | | Leuchtstofflampen (breites Spektrum) | Leuchtstofflampen (breites Spektrum) | Leuchtstofflampen (breites Spektrum) | | 10-20 μE/m2/s, 540-1 080 lx, oder 50-100 ft-c (Werte für Laborumgebung) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 080 lx, oder 50-100 ft-c (Werte für Laborumgebung) | 10-20 μE/m2/s, 540-1 080 lx, oder 50-100 ft-c (Werte für Laborumgebung) | | 12-16 h Licht, 8-12 h Dunkelheit | 12-16 h Licht, 8-12 h Dunkelheit | 16 h Licht, 8 h Dunkelheit | | 7. | Mindestgröße der Aquarien |
| Die einzelnen Aquarien müssen ein Fassungsvermögen von mindestens 7 l haben. | Die einzelnen Aquarien müssen ein Fassungsvermögen von mindestens 7 l haben. | Die einzelnen Aquarien müssen ein Fassungsvermögen von mindestens 7 l haben. | | 8. | Erneuerung der Prüflösungen (im Durchfluss) |
| Mindestens 5-mal täglich | Mindestens 5-mal täglich | Mindestens 5-mal täglich | | 9. | Alter der Prüforganismen bei Beginn der Exposition |
| Frisch befruchtete Eier (frühes Blastula-Stadium) | Frisch befruchtete Eier (frühes Blastula-Stadium) | Frisch befruchtete Eier | | 10. | Anzahl der Eier pro Behandlung |
| Mind. 120 | Mind. 120 | Mind. 120 | | 11. | Anzahl der Behandlungen |
| Mind. 3 (sowie entsprechende Kontrollen) | Mind. 3 (sowie entsprechende Kontrollen) | Mind. 3 (sowie entsprechende Kontrollen) | | 12. | Anzahl der Replikate pro Behandlung |
| Mind. 4 (wenn keine Aufteilung auf die Kontrollen nach dem Quadratwurzelgesetz von Penrose vorgenommen wird) | Mind. 4 (wenn keine Aufteilung auf die Kontrollen nach dem Quadratwurzelgesetz von Penrose vorgenommen wird) | Mind. 4 (wenn keine Aufteilung auf die Kontrollen nach dem Quadratwurzelgesetz von Penrose vorgenommen wird) | | Lebende Artemia, tiefgefrorene adulte Salinenkrebse, Flockenfutter usw., möglichst zweimal täglich | Spezielle Jungfische, lebende Artemia, tiefgefrorene adulte Salinenkrebse, Flockenfutter usw., möglichst zweimal täglich | Lebende Artemia, tiefgefrorene adulte Salinenkrebse, Flockenfutter usw., möglichst zweimal täglich | | Keine, wenn der Gehalt an gelöstem Sauerstoff nicht unter eine Sättigung von 60 % fällt | Keine, wenn der Gehalt an gelöstem Sauerstoff nicht unter eine Sättigung von 60 % fällt | Keine, wenn der Gehalt an gelöstem Sauerstoff nicht unter eine Sättigung von 70 % fällt | | Sauberes Oberflächen- oder Brunnenwasser oder rekonstituiertes Wasser | Sauberes Oberflächen- oder Brunnenwasser oder rekonstituiertes Wasser | Sauberes Oberflächen- oder Brunnenwasser oder rekonstituiertes Wasser | | 16. | Dauer der Exposition gegenüber der Prüfchemikalie |
| 60 Tage nach dem Schlüpfen | 60 Tage nach dem Schlüpfen | 60 Tage nach dem Schlüpfen | | Schlupfrate, Überlebensrate, Gesamtmorphologie, VTG histologische Gonadenuntersuchungen, genetisches Geschlecht, Geschlechterverhältnis | Schlupfrate, Überlebensrate, Gesamtmorphologie, VTG histologische Gonadenuntersuchungen, Geschlechterverhältnis | Schlupfrate, Überlebensrate, Gesamtmorphologie, VTG histologische Gonadenuntersuchungen, Geschlechterverhältnis | | 18. | Validitätskriterien der Prüfung bei gepoolten Replikaten der Kontrollen |
| Schlupfrate > 80 % | Schlupfrate > 80 % | Schlupfrate > 80 % | | Überlebensrate nach dem Schlüpfen ≥ 70 % | Überlebensrate nach dem Schlüpfen ≥ 70 % | Überlebensrate nach dem Schlüpfen ≥ 70 % | | Wachstum (Feuchtmasse der Fische, trockengetupft) > 150 mg | Wachstum (Feuchtmasse der Fische, trockengetupft) > 75 mg | Wachstum (Feuchtmasse der Fische, trockengetupft) > 120 mg | | Länge (Standardlänge) > 20 mm | Länge (Standardlänge) > 14 mm | Länge (Standardlänge) > 20 mm | Geschlechterverhältnis (% männliche oder weibliche Fische)30-70 %
| Geschlechterverhältnis (% männliche oder weibliche Fische) 30-70 % | Geschlechterverhältnis (% männliche oder weibliche Fische) 30-70 % |
Anlage 3Chemische Eigenschaften eines geeigneten Wassers
| BESTANDTEILE | KONZENTRATION | | Partikelmaterial | < 20 mg/l | | Gesamtgehalt an organischen Kohlenstoffen | < 2 mg/l | | Nichtionisiertes Ammonium | < 1 μg | | Restchlor | < 10 μg/l | | Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden und polychloriertem Biphenylen | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an organischem Chlor | < 25 ng/l |
Anlage 4Aus Prüfmethode C.14 / Leitlinien zu Prüfkonzentrationen
| Spalte (Anzahl der Konzentrationen zwischen 100 und 10 oder zwischen 10 und 1) | | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | | 32 | 46 | 56 | 63 | 68 | 72 | 75 | | 10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56 | | 3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42 | | 1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32 | | 2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24 | | 1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18 | | | 1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13 | | | 1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10 | | | | 1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5 | | | | 1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6 | | | | | 1,5 | 2,7 | 4,2 | | | | | 1,0 | 1,9 | 3,2 | | | | | | 1,4 | 2,4 | | | | | | 1,0 | 1,8 | | | | | | | 1,3 | | | | | | | 1,0 |
Anlage 5Leitlinien zur Herstellung von Kopf- und Schwanz-Homogenaten von juvenilen Zebrabärblingen, Dickkopfelritzen, Dreistachligen Stichlingen und japanischen Reiskärpflingen
In diesem Abschnitt werden die Verfahren vor der Quantifizierung der VTG-Konzentration beschrieben. ⁵⁴⁹³Es können jedoch auch andere Verfahren eingesetzt werden, mit denen die VTG-Konzentration in vergleichbarer Weise quantifiziert werden kann. ⁵⁴⁹⁴Mit diesem Verfahren kann die VTG-Konzentration auch in Blutplasma oder in Leberpräparaten (statt in Kopf- oder Schwanz-Homogenaten) bestimmt werden.
Verfahren
| 1. | Die Fische werden betäubt und getötet, wie für den Test beschrieben. |
| 2. | Kopf und Schwanz der Fische werden abgeschnitten, wie im Test erläutert. Wichtig: Jeweils nach der Präparation eines Fischs sind die Sezierinstrumente und das Sezierbrett abzuwaschen und ordnungsgemäß zu reinigen (z. B. mit 96 %igem Ethanol), um VTG-‚Kontaminationen‘ bei weiblichen Fischen oder Kontaminationen von induzierten Männchen auf nicht induzierte Männchen zu vermeiden. |
| 3. | Das Gewicht der gepoolten Kopf- und Schwanz-Präparate der einzelnen Fische wird auf 1 mg genau gemessen. |
| 4. | Nach dem Wiegen werden die Präparate in geeignete Röhrchen (z. B. 1,5 ml Eppendorf) gegeben und bei – 80 °C bis zur Homogenisierung gefroren oder unmittelbar mit zwei Kunststoff-Pistillen auf Eis homogenisiert. (Alternativ können auch andere Methoden verwendet werden, sofern sie auf Eis durchgeführt werden und eine homogene Masse entsteht.) Wichtig:Die Röhrchen sind ordnungsgemäß zu nummerieren, damit die Kopf- und Schwanz-Präparate der Fische für die histologische Gonadenuntersuchung dem jeweiligen Rumpf zugeordnet werden können. |
| 5. | ⁵⁵⁰⁰Wenn die Masse homogen ist, wird die eisgekühlte Homogenisierungs-Pufferlösung (das 4- bis 10-Fache des Gewebegewichts) hinzugegeben. ⁵⁵⁰¹(Der Verdünnungsfaktor ist zu protokollieren.) Das Präparat wird weiter mit den Pistillen bearbeitet, bis eine homogene Mischung entstanden ist. Wichtiger Hinweis:Für jeden Fisch ist ein frisches Pistill zu verwenden. |
| 6. | Die Proben werden bis zur Zentrifugierung (4 °C, 50 000 g, 30 Minuten) auf Eis gelegt. |
| 7. | Mit einer Pipette werden Anteile von 20-50 μl (Volumen protokollieren) des Überstands in mindestens zwei Röhrchen gefüllt, indem die Spitze der Pipette unter die Fettschicht des Überstands getaucht und der Überstand vorsichtig eingesaugt wird, ohne jedoch Fett- oder Pelletfraktionen aufzunehmen. |
| 8. | Die Röhrchen werden bis zur Verwendung bei – 80 °C gelagert. |
Hinweis: Die Homogenisierungs-Pufferlösung ist am Tag der Herstellung zu verbrauchen. Während der Verwendung muss die Pufferlösung auf Eis gelegt werden.Anlage 6
Leitlinien zur Bestimmung der Vitellogenin-Konzentration in Kopf- und Schwanz-Homogenaten von Zebrabärblingen (Danio rerio) (modifiziert nach Holbech et al., 2001); alternativ können auch andere Verfahren unter Verwendung homologer Antikörper und andere Standards angewendet werden.
| 1. | Mit 5 μg/ml Anti-Zebrabärbling-Lipovitellin-IgG beschichtete Mikrotiterplatten (zertifiziert Maxisorp F96, Nunc, Roskilde, Dänemark) werden aufgetaut und dreimal mit Waschpuffer gewaschen (*). |
| 2. | ⁵⁵⁰⁹Gereinigter Zebrabärblings-Vitellogenin-Standard wird in einem Verdünnungspuffer (**) seriell auf 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 und 20 ng/ml verdünnt; anschließend werden die Proben nochmals mindestens 200-mal in einem Verdünnungspuffer verdünnt (um Matrixeffekte zu verhindern) und in die Platten gegeben. ⁵⁵¹⁰Außerdem werden duplizierte Assay-Kontrollen hergestellt. ⁵⁵¹¹In die Vertiefungen werden jeweils 150 μl gefüllt. ⁵⁵¹²Die Standards werden dupliziert und die Proben tripliziert. ⁵⁵¹³Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 4 °C in einer Schüttelvorrichtung. |
| 3. | Die Platten werden 5-mal mit Waschpuffer gewaschen (*). |
| 4. | ⁵⁵¹⁵HRP gekoppelt an eine Dextrankette (z. B. AMDEX A/S, Dänemark) und konjugierte Antikörper werden im Waschpuffer verdünnt. ⁵⁵¹⁶Die Verdünnung ist je nach Charge und Alter unterschiedlich. ⁵⁵¹⁷In jede Vertiefung werden 150 μl gegeben; anschließend werden die Platten 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Schüttelvorrichtung inkubiert. |
| 5. | Die Platten werden fünfmal mit Waschpuffer (*) gewaschen; die Unterseite der Platten wird sorgfältig mit Ethanol gereinigt. |
| 6. | ⁵⁵¹⁹In die Vertiefungen werden jeweils 150 μl TMB plus (***) gegeben. ⁵⁵²⁰Die Platte ist mit Alufolie gegen Lichteinfall zu schützen; in einer Schüttelvorrichtung wird die Farbentwicklung beobachtet. |
| 7. | Wenn sich die Standardkurve vollständig entwickelt hat, wird die Enzymaktivität gestoppt, indem in die Vertiefungen jeweils 150 μl 0,2 M H2SO4 gegeben werden. |
| 8. | ⁵⁵²²Die Absorption wird bei 450 nm gemessen (z. B. auf einem Photometer für Mikrotiterplatten (Molecular Devices Thermomax Microplate Reader). ⁵⁵²³Die Daten werden mit der dazugehörigen Software (z. B. Softmax) analysiert. |
| (*) | Waschpuffer:| PBS-Stammlösung (****) | 500,0 | ml | | BSA | 5,0 | g | | Tween 20 | 5,0 | ml | | Der pH-Wert wird auf 7,3 eingestellt; anschließend wird mit Millipore-H2O auf 5 l aufgefüllt. Die Proben werden bei 4 °C gelagert. |
|
| (**) | Verdünnungspuffer:| PBS-Stammlösung (****) | 100,0 | ml | | BSA | 3,0 | g | | Tween 20 | 1,0 | ml | | Der pH-Wert wird auf 7,3 eingestellt; anschließend wird mit Millipore-H2O auf 1 l aufgefüllt. Die Proben werden bei 4 °C gelagert. |
|
| (***) | TMB plus ist ein ‚gebrauchsfertiges‘ Substrat von KemEnTec (Dänemark). Das lichtempfindliche Substrat wird bei 4 °C gelagert. |
| (****) | PBS-Stammlösung| NaCl | 160,0 | g | | KH2PO4 | 4,0 | g | | Na2HPO4, 2H2O | 26,6 | g | | KCl | 4,0 | g | | Der pH-Wert wird auf 6,8 eingestellt; anschließend wird mit Millipore-H2O auf 2 l aufgefüllt. Die Proben werden bei Raumtemperatur gelagert. |
|
Anlage 7Leitlinien zur Präparation von Gewebeschnitten zur Geschlechtsbestimmung und zur Beurteilung des Stadiums der Gonadenentwicklung
In diesem Abschnitt werden die Verfahren vor der Untersuchung der histologischen Schnitte beschrieben. Alternativ können auch andere Verfahren verwendet werden, mit denen eine Geschlechtsbestimmung vorgenommen und das Stadium der Gonadenentwicklung festgestellt werden kann.
Mit einigen wenigen Ausnahmen sind diese Verfahren bei Japanischen Reiskärpflingen (JMD = Japanische Medaka) und Zebrabärblingen (ZF = Zebrafish) ähnlich.
Tötung, Sektion und Gewebefixierung
Ziele:
- 1.
- Gewährleistung einer schmerzlosen Tötung der Fische;
- 2.
- Ermittlung der benötigten Körpergewichte und Durchführung der erforderlichen Messungen;
- 3.
- Beurteilung sekundärer Geschlechtsmerkmale;
- 4.
- Herstellung von Gewebesektionen für VTG-Analysen;
- 5.
- Fixierung der Gonaden;
Verfahren:- 1.
- Die Fische sind unmittelbar vor der Sektion zu töten. Wenn nicht mehrere Prosektoren verfügbar sind, dürfen daher nicht mehrere Fische gleichzeitig getötet werden.
- 2.
- Mit dem kleinen Kescher wird ein Fisch aus der Versuchskammer entnommen und in einem Transportbehältnis in den Sektionsbereich gebracht.
- 3.
- ⁵⁵³⁸Der Fisch wird in die Tötungslösung gesetzt. ⁵⁵³⁹Wenn die Atmung zum Stillstand gekommen ist und der Fisch auf äußere Reize nicht mehr reagiert, wird der Fisch aus der Lösung genommen.
- 4.
- Danach wird die Feuchtmasse des Fischs ermittelt.
- 5.
- Für die Präparation der Gewebe zur VTG-Analyse kann der Fisch auf eine Korkplatte auf dem Tisch eines Präpariermikroskops gelegt werden.
| a. | Bei Zebrabärblingen wird der Kopf unmittelbar hinter der Brustflosse und der Schwanz unmittelbar hinter der Rückenflosse abgeschnitten. |
| b. | ⁵⁵⁴³Bei Japanischen Reiskärpflingen wird der Bauch mit einem sorgfältigen Schnitt entlang der Bauchmittellinie vom Schultergürtel bis zu einem Punkt unmittelbar kranial zum After aufgetrennt. ⁵⁵⁴⁴Mit der kleinen Pinzette und mit einer kleinen Schere wird vorsichtig die Leber entnommen. |
- 6.
- Proben für die VTG-Analyse werden in Eppendorf-Röhrchen gegeben und umgehend in flüssigem Stickstoff gefroren.
- 7.
- ⁵⁵⁴⁶Der Fischkörper wird einschließlich der Gonaden in eine gekennzeichnete Gewebe-Kassette gelegt, die anschließend in eine Fixierlösung (Davidson oder Bouin) gestellt wird. ⁵⁵⁴⁷Von der Fixierlösung wird mindestens das zehnfache Volumen des ungefähren Gewebevolumens benötigt. ⁵⁵⁴⁸Das Behältnis mit der Fixierlösung wird fünf Sekunden lang vorsichtig geschüttelt, um Luftblasen vollständig aus der Kassette zu entfernen.
- 8.
| a. | ⁵⁵⁴⁹Alle Gewebe verbleiben über Nacht in der Davidson-Fixierlösung; am folgenden Tag werden sie in einzelne Behältnisse mit 10 %igem neutral gepuffertem Formalin gegeben. ⁵⁵⁵⁰Die Behältnisse mit den Kassetten werden fünf Sekunden lang vorsichtig geschüttelt, um eine angemessene Durchdringung der Kassette mit dem Formalin sicherzustellen. |
| b. | Die Gewebe werden 24 h in der Bouin-Fixierlösung belassen; anschließend werden sie in 70 %iges Ethanol gelegt. |
Präparation der GewebeZiele:
- 1.
- Dehydrieren der Gewebe, damit eine angemessene Durchdringung mit Paraffin ermöglicht wird;
- 2.
- Imprägnieren der Gewebe mit Paraffin, um die Gewebe unversehrt zu konservieren und eine feste Oberfläche für die Mikrotomie zu schaffen;
Verfahren:- 3.
- Die gekennzeichneten Kassetten werden aus der Formalin-/Ethanol-Lösung genommen und in die Einbettungskörbe gesetzt. Diese werden in den Gewebeeinbetter gestellt.
- 4.
- Danach wird das Einbettungsprogramm ausgewählt.
- 5.
- Nach Abschluss des Einbettungsvorgangs können die Körbe im Aufbewahrungsbereich abgelegt werden.
EinbettungZiel:
Ordnungsgemäße Ausrichtung der Proben in verfestigtem Paraffin zur anschließenden Mikrotomie.
Verfahren:
- 1.
- Die Körbe mit den Kassetten werden aus dem Gewebeeinbetter genommen und in die mit Paraffin gefüllte Frontkammer der Heizkonsole der Einbettungsstation oder separat in einen Paraffin-Erwärmer gestellt.
- 2.
- ⁵⁵⁵⁸Die erste einzubettende Kassette wird aus der Frontkammer der Heizkonsole des Paraffin-Erwärmers genommen. ⁵⁵⁵⁹Der Deckel der Kassette wird geöffnet und entsorgt; die Kennzeichnung der Kassette wird mit den Daten des jeweiligen Tiers verglichen, um mögliche Diskrepanzen noch vor dem Einbetten festzustellen.
- 3.
- Danach wird eine Einbettungsform mit geeigneter Größe ausgewählt.
- 4.
- Die Form wird unter den Auslass der Gießkonsole gestellt und mit geschmolzenem Paraffin gefüllt.
- 5.
- ⁵⁵⁶²Danach wird die Probe aus der Kassette genommen und in die Form in das geschmolzene Paraffin gelegt. ⁵⁵⁶³Dieser Vorgang wird für jede Paraffinform mit 4-8 Proben wiederholt. ⁵⁵⁶⁴Die Fische werden so eingelegt, dass Fisch Nr. 1 im Winkel von 180° zu den Fischen 2-4/8 liegt.
- 6.
- Anschließend wird weiteres Paraffin eingefüllt, bis die gesamte Probe abgedeckt ist.
- 7.
- Die Form mit der Kassette wird auf die Abkühlplatte der Kryokonsole gestellt.
- 8.
- Nach dem Aushärten des Paraffins wird der Block (d. h. das feste Paraffin mit den Geweben und mit der Kassette) aus der Form herausgenommen.
MikrotomieZiel:
Herstellen und Aufziehen der Gewebeschnitte zur Beurteilung der Entwicklungsphasen.
Verfahren:
- 1.
- Die Anfangsphase der Mikrotomie (‚Facing‘) gestaltet sich wie folgt:
| a. | Der Paraffinblock wird in das Spannfutter des Mikrotoms gesetzt. |
| b. | Das Spannfutter wird durch Drehen des Mikrotomrads vorgeschoben, und aus der Paraffinfläche des Blocks werden dicke Schnitte abgetragen, bis das Messer zu den eingebetteten Geweben gelangt. |
| c. | ⁵⁵⁷¹Das Mikrotom wird auf eine Schnittstärke von 3-5 μm eingestellt. ⁵⁵⁷²Anschließend wird das Futter vorgeschoben, und aus dem Block werden mehrere Schnitte hergestellt, um bei den Grobschnitten eventuell entstandene Verunreinigungen an der Schnittfläche des Gewebes zu entfernen. |
| d. | Danach kann der Block aus dem Spannfutter genommen und mit der Oberseite nach unten auf Eis gelegt werden, damit das Gewebe Feuchtigkeit aufnehmen kann. |
- 2.
- In der nächsten Phase der Mikrotomie werden die endgültigen Schnitte hergestellt und die Gewebeschnitte auf Objektträger aufgezogen. Diese Schritte werden wie folgt durchgeführt:
| a. | Wenn der Block auf Eis gesetzt wurde, wird er heruntergenommen und wieder in das Futter des Mikrotoms gespannt. |
| b. | ⁵⁵⁷⁶Nachdem das Mikrotom auf eine Schnittstärke von 3-5 μm eingestellt wurde, wird das Spannfutter durch Drehen des Mikrotomrads vorgeschoben. ⁵⁵⁷⁷Von dem Block werden Schnitte abgetragen, bis ein Schnittband mit mindestens einem annehmbaren Schnitt einschließlich der Gonaden vorliegt. (Während des Schneidvorgangs kann der Block aus dem Spannfutter genommen und erneut auf Eis gesetzt werden, damit das Gewebe die Feuchtigkeit aufnehmen kann; anschließend wird der Block wieder in das Mikrotom gespannt.) |
| c. | ⁵⁵⁷⁸Die Schnitte schwimmen im Wasserbad flach auf der Wasseroberfläche auf. ⁵⁵⁷⁹Es wird versucht, mindestens einen Schnitt ohne Falten und ohne eingeschlossene Luftblasen zu erhalten. |
| d. | ⁵⁵⁸⁰Unter den besten Schnitt wird ein Objektträger geschoben, um den Schnitt dann mit dem Objektträger aus dem Wasser zu heben. ⁵⁵⁸¹Dieser Schritt wird als ‚Aufziehen‘ des Schnitts bezeichnet. |
| e. | ⁵⁵⁸²Für die Proben eines Fischs werden jeweils drei Schnitte angefertigt. ⁵⁵⁸³Der zweite und der dritte Schnitt werden in Abständen von 50 μm vom ersten Schnitt angesetzt. ⁵⁵⁸⁴Wenn die Fische nicht mit den Gonaden auf derselben Schnittebene eingebettet wurden, müssen mehrere Schnitte angefertigt werden, um sicherzustellen, dass von jedem Fisch mindestens sechs Schnitte mit den Gonaden verfügbar sind. |
| f. | Mit einem Folienstift wird auf dem Objektträger die Nummer des Blocks notiert, aus dem der Schnitt stammt. |
| g. | Danach wird der Objektträger in ein Färbegestell gesetzt. |
| h. | Nun wird der Block aus dem Spannfutter genommen und zur Lagerung mit der Oberseite nach unten gedreht. |
Färben, Eindecken und Kennzeichnen der ObjektträgerZiele:
- —
- Färben der Schnitte zur histopathologischen Untersuchung;
- —
- Permanentversiegeln der aufgezogenen und gefärbten Gewebe;
- —
- Permanente Kennzeichnung der gefärbten Schnitte, um eine uneingeschränkte Rückverfolgbarkeit zu gewährleisten;
Verfahren:- 1.
- Färben
| a. | Die Objektträger werden vor dem Färben über Nacht an der Luft getrocknet. |
| b. | Zur Färbung der Schnitte wird Hematoxylin-Eosin verwendet. |
- 2.
- Eindecken
| a. | Die Deckel können von Hand oder automatisch aufgesetzt werden. |
| b. | Die Objektträger werden in Xylol oder TissueClear getaucht; anschließend wird das überschüssige Xylol/TissueClear vorsichtig abgeklopft. |
| c. | Zum Ende des Objektträgers hin werden auf die der gefrorenen Seite gegenüberliegende Seite oder auf das Deckglas etwa 0,1 ml Eindeckmedium gegeben. |
| d. | Das Deckglas wird in spitzem Winkel gekippt auf den Objektträger aufgesetzt. |
- 3.
- Kennzeichnung
| a. | Die Objektträger müssen jeweils mit folgenden Informationen gekennzeichnet werden:- i.
- Name des Labors
- ii.
- Arten
- iii.
- Proben-Nr. / Objektträger-Nr.
- iv.
- Chemikalie / Behandlungsgruppe
- v.
- Datum
|
Anlage 8Statistisches Flussdiagramm zur Vitellogenin-Analyse
 Statistisches Flussdiagramm zur Analyse des Geschlechterverhältnisses Anlage 9Leitlinien zur Bestimmung des genetischen Geschlechts mit Gewebeproben und durch Polymerase-Kettenreaktion
Entnahme, Präparation und Lagerung von Gewebeproben vor der Bestimmung des genetischen Geschlechts durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei Medakas (erstellt vom Labor für aquatische Organismen der Bayer CropScience AG)
| 1. | Mit einer feinen Schere wird bei den einzelnen Fischen die After- oder die Rückenflosse abgeschnitten und in ein Röhrchen mit 100 μl Extraktionspuffer 1 gegeben (Informationen zur Herstellung der Pufferlösung s. u.). Nach jedem Fisch wird die Schere in einem mit destilliertem H2O gefüllten Becherglas gereinigt und mit einem Papiertuch getrocknet. |
| 2. | ⁵⁵⁹⁵Danach wird das Flossengewebe mit einem Teflon-Mikro-Pistill homogenisiert, um die Zellen aufzuschließen. ⁵⁵⁹⁶Um Kontaminationen zu vermeiden, wird für jedes Röhrchen ein neues Pistill verwendet. Die Pistillen werden über Nacht in 0,5 M NaOH gestellt, anschließend 5 Minuten in destilliertem H2O gewaschen und bis zum Gebrauch in Ethanol bzw. (nach dem Autoklavieren) steril aufbewahrt. |
| 3. | ⁵⁵⁹⁷Das Flossengewebe kann auch ohne den Extraktionspuffer 1 auf Trockeneis aufbewahrt und dann bei – 80 °C gefroren gelagert werden, um eine Beeinträchtigung der DNA zu vermeiden. ⁵⁵⁹⁸Die Extraktion gelingt jedoch besser, wenn die DNA gleichzeitig extrahiert wird (Handhabung s. o.; bei – 80 °C gelagerte Proben sind auf Eis aufzutauen, bevor die Pufferlösung in die Röhrchen gefüllt wird). |
| 4. | Nach dem Homogenisieren werden alle Röhrchen in ein Wasserbad gesetzt und 15 Minuten bei 100 °C aufgekocht. |
| 5. | ⁵⁶⁰⁰Anschließend werden jeweils 100 μl des Extraktionspuffers 2 (Hinweise zur Herstellung der Pufferlösung s. u.) in die Röhrchen pipettiert. ⁵⁶⁰¹Die Proben werden 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen; während dieser 15 Minuten werden sie vorsichtig von Hand geschüttelt. |
| 6. | Dann werden alle Röhrchen in das Wasserbad gesetzt und nochmals 15 Minuten bei 100 °C aufgekocht. |
| 7. | Bis zur Durchführung der Analysen werden die Röhrchen bei – 20 °C gefroren. |
Herstellen der PufferlösungPCR-Puffer 1:
| 500 mg N-Lauroylsarcosine (z. B. Merck KGaA, Darmstadt, DE) |
PCR-Puffer 2: | 20 g Chelex (z. B.. Biorad, München, DE) |
| In 100 ml dest. H2O quellen lassen. |
Bestimmung des genetischen Geschlechts durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei Medakas (erstellt vom Labor für aquatische Organismen der Bayer CropScience AG)Die präparierten und gefrorenen Röhrchen (siehe Beschreibung im vorstehenden Abschnitt) werden auf Eis aufgetaut. ⁵⁶⁰⁶Anschließend werden sie mit einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert (30 s mit maximaler Drehzahl bei Raumtemperatur). ⁵⁶⁰⁷Für die PCR wird der vom Niederschlag getrennte klare Überstand verwendet. Es ist unbedingt zu vermeiden, dass Spuren von Chelex (aus dem Niederschlag) in die PCR gelangen, da sonst die Taq-Polymerase gestört wird. ⁵⁶⁰⁸Der Überstand ist umgehend zu verwenden oder gefroren (bei – 20 °C) aufzubewahren und in mehreren Schritten aufzutauen (damit bei später durchzuführenden Analysen die DNA nicht beeinträchtigt ist).
1. Herstellung des ‚Reaktionsgemischs‘ (25 μl pro Probe):
| Menge | Endkonzentration | | Template-DNA | 0,5-2 μl | | | 10 x PCR-Puffer mit MgCl2 | 2,5 μl | 1 x | | Nukleotide (jeweils dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 4 μl (5 mM) | 200 μM | | Vorwärtsprimer (10 μM) (s. u. 3-5) | 0,5 μl | 200 nM | | Rückwärtsprimer (10 μM) (s. u. 3-5) | 0,5 μl | 200 nM | | DMSO | 1,25 μl | 5 % | | Wasser (PCR-Qualität) | bis zu 25 μl | | | Taq-E-Polymerase | 0,3 μl | 1.5U | | 10 x PCR-Puffer mit MgCl2: 670mM Tris/HCl (pH 8,8 bei 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20 |
Bei jeder PCR (s. u. 3-5) werden für jede einzelne Probe (s. o.) der Spezialprimer als neue ‚Reaktionsmischung‘ und die entsprechende Menge an Template-DNA benötigt. ⁵⁶¹⁰Die betreffenden Mengen werden in frische Röhrchen pipettiert. ⁵⁶¹¹Danach werden alle Röhrchen verschlossen, gerührt (ca. ⁵⁶¹²10 s) und zentrifugiert (10 s bei Raumtemperatur). ⁵⁶¹³Anschließend kann mit den jeweiligen PCR-Programmen begonnen werden. ⁵⁶¹⁴Für jedes PCR-Programm werden außerdem eine positive Kontrolle (eine exemplarische DNA-Probe mit bekannter Aktivität und eindeutigen Ergebnissen) und eine negative Kontrolle (1 μl dest. H2O) benötigt.2. Herstellung des Agarosegels (1 %) — während der PCR-Programme:
- —
- 3 g Agarose werden in 300 ml 1 × TAE-Puffer gelöst (1- %-Agarosegel).
- —
- Diese Lösung wird in einem Mikrowellengerät aufgekocht (ca. 2-3 min).
- —
- Die heiße Lösung wird in einen auf Eis stehenden speziellen Gießkasten gegeben.
- —
- Nach etwa 20 min kann das Agarosegel verwendet werden.
- —
- Das Agarosegel wird bis zum Ende der PCR-Programme in 1 × TAE-Puffer aufbewahrt.
3. Actin-PCR-Programm:Mit dieser PCR soll nachgewiesen werden, dass die DNA der Probe nicht beschädigt ist.
- —
- Spezialprimer:
| — | ‚Mact1(aufwärts/vorwärts)‘ → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA |
| — | ‚Mact2(abwärts/rückwärts)‘ → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG |
- —
- Programm:
| — | Zyklus (35-mal):| Denaturierung | → 45 s bei 95 °C | | Annealing | → 45 s bei 56 °C | | Verlängerung | → 1 min bei 68 °C |
|
4. X- und Y-Gen-PCR-Programm:Bei diesem PCR-Programm werden die X- und Y-Gene anhand der Proben mit unversehrter DNA nachgewiesen. ⁵⁶²²Proben männlicher Tiere müssen eine doppelsträngige und weiblicher Tiere eine einsträngige DNA aufweisen (nach dem Färben und nach der Gel-Elektrophorese). ⁵⁶²³Bei diesem Programmdurchlauf ist jeweils eine positive Kontrolle für männliche (XY-Probe) und für weibliche Tiere (XX-Probe) zu berücksichtigen.
- —
- Spezialprimer:
| — | ‚PG 17,5‘ (aufwärts/vorwärts) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG |
| — | ‚PG 17,6‘ (abwärts/rückwärts) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA |
- —
- Programm:
| — | Zyklus (40-mal):| Denaturierung | → 45 s bei 95 °C | | Annealing | → 45 s bei 55 °C | | Verlängerung | → 1 min 30 s bei 68 °C |
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5. Y-Gen-PCR-Programm als ‚Kontrolle‘ für das X- und Y-Gen-PCR-Programm:Mit diesem PCR-Programm werden die Ergebnisse des ‚X- und Y-Gen-PCR-Programms‘ verifiziert. Die ‚männlichen‘ Proben müssen einen Strang aufweisen, in den ‚weiblichen‘ Proben darf kein Strang enthalten sein (nach dem Färbern und der Gel-Elektrophorese).
- —
- Spezialprimer:
| — | ‚DMTYa (aufwärts/vorwärts)‘ → GGC CGG GTC CCC GGG TG |
| — | ‚DMTYd (abwärts/rückwärts)‘ → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G |
- —
- Programm:
| — | Zyklus (40-mal):| Denaturierung | → 45 s bei 95 °C | | Annealing | → 45 s bei 56 °C | | Verlängerung | → 1 min bei 68 °C |
|
6. Färben der PCR-Proben:Färbelösung:
In die Röhrchen wird jeweils 1 μl der Färbelösung pipettiert.7. Beginn der Gel-Elektrophorese:
- —
- Das hergestellte 1 %ige Agarosegel wird in eine mit 1 × TAE-Puffer gefüllte Gel-Elektrophoresekammer gegeben.
- —
- Von den gefärbten PCR-Proben werden jeweils 10-15 μl in einen Agarosegel-Slot pipettiert.
- —
- Außerdem werden 5-15 μl der 1kb-Ladder (Invitrogen) in einen eigenen Slot pipettiert.
- —
- Die Elektrophorese wird mit 200 V begonnen.
- —
- Nach 30-45 min wird die Elektrophorese beendet.
8. Bestimmung der Banden:- —
- Das Agarosegel wird in destilliertem H2O gereinigt.
- —
- Anschließend wird das Agarosegel 15-30 min in Ethidiumbromid gegeben.
- —
- Danach ist in einem UV-Lichtschrank eine Aufnahme des Agarosegels herzustellen.
- —
- Zum Schluss werden die Proben im Vergleich zum positiven Kontrollband (bzw. den positiven Kontrollbanden) und zur DNA-Leiter analysiert.
Anlage 10Leitlinien zur Herstellung von Gewebeproben zur Bestimmung des genetischen Geschlechts durch PCR beim Dreistachligen Stichling
Herstellung von Gewebeproben und DNA-Extraktion
Die DNA kann mit verschiedenen handelsüblichen Reagenzien und mit manuellen oder automatischen Systemen extrahiert werden. Im Folgenden wird das Protokoll des CEFAS-Labors (CEFAS = Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science) in Weymouth beschrieben; gegebenenfalls werden auch alternative Methoden erläutert.
| 1. | ⁵⁶³⁶Bei jedem einzelnen Fisch wird mit einer feinen Schere jeweils etwas Gewebematerial (10-20 mg) aus dem Rückenbereich (dorsolateral) entnommen (nachdem der Kopf und der Schwanz für die VTG-Analyse abgetrennt wurden). ⁵⁶³⁷Das Gewebe wird in ein Röhrchen gegeben und entweder sofort in flüssigen Stickstoff gestellt (zur Lagerung bei – 80 °C) oder mit 70 %igem Ethanol gefüllt (zum Transport und zur anschließenden Aufbewahrung bei 4 °C). ⁵⁶³⁸Jeweils nach Entnahme der Gewebeprobe bei einem Fisch wird die Schere zunächst mit 70 %igem Ethanol und dann mit destilliertem Wasser gereinigt und mit Hygienepapier trockengetupft. |
| 2. | ⁵⁶³⁹Das Ethanol wird (soweit vorhanden) abgesaugt und das Gewebe über Nacht mit Proteinase K in 400 μl ATL-Pufferlösung (Qiagen) gelöst. ⁵⁶⁴⁰Eine Aliquote (200 μl) des gelösten Gewebes wird in einen S-Block (Qiagen) mit 96 Vertiefungen gegeben, und die DNA wird in mit Qiagen Universal BioRobot und dem QIamp-Investigator-BioRobot-Kit mit 96 Vertiefungen Qlamp-Ivestigator-BioRobot-Kit extrahiert. ⁵⁶⁴¹Die DNA wird in 50 μl DNase- und RNase-freies Wasser eluiert. ⁵⁶⁴²Wenn feste Gewebe zur DNA-Extraktion verwendet werden (z. B. die Wirbelsäule oder eine Brustflosse), muss die Probe unter Umständen mit einem FastPrep®-Tissue-Lyser oder mit einem gleichwertigen Aufschlusssystem im Lysepuffer homogenisiert werden.Alternativ kann wie folgt verfahren werden:
| (a) | Das Gewebe wird über Nacht mit Proteinase K in 400 μl G2-Lysepuffer (Qiagen) gelöst, und die DNA wird entweder mit dem EZ-1-DNA-Easy-Tissue-Kit und dem EZ-1-Biorobot oder mit dem DNA-Easy-Tissue-Mini-Kit aus 200 μl des gelösten Gewebes extrahiert. Anschließend wird die DNA in ein Flüssigkeitsvolumen von 50 μl eluiert. |
| (b) | Die Gewebe werden mit DNAzol-Reagens verarbeitet. ⁵⁶⁴⁶Die Gewebeproben werden 10 Minuten lang in einem Mikrozentrifugen-Röhrchen (1,5 ml) in 1 ml DNAzol gelöst und dann 5 Minuten mit 13 000 U/min zentrifugiert, um vorhandene Partikel vollständig abzutrennen. ⁵⁶⁴⁷Die gelöste Probe wird dann in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugen-Röhrchen mit 500 μl 100 % molekular reinem Ethanol gegeben und dann 10 Minuten mit 13 000 U/min zentrifugiert, um die DNA auszufällen. ⁵⁶⁴⁸Das Ethanol wird entfernt, durch 400 μl molekular reines Ethanol (70 %) ersetzt und nochmals 5 Minuten mit 13 000 U/min zentrifugiert. ⁵⁶⁴⁹Anschließend wird das DNA-Pellet in 50 μl molekularem DNase- und RNase-freiem Wasser gelöst. Auch in diesem Fall muss die Probe unter Umständen mit einem FastPrep®-Tissue-Lyser oder mit einem gleichwertigen Aufschlusssystem im Lysepuffer homogenisiert werden, wenn feste Gewebe zur DNA-Extraktion verwendet werden (z. B. die Wirbelsäule oder eine Brustflosse), |
|
| 3. | Die DNA wird bis zur Verwendung bei – 20 °C gespeichert. |
Wichtiger Hinweis: Während der Verfahren sind Handschuhe zu tragen.Analyse durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Mit 2,5 μl des DNA-Extrakts in 50 μl Reaktionsvolumen wurden unter Verwendung der IDH-Locus-Primer (nach Peichel et al., 2004. Current Biology 1:1416-1424) Amplifikationen vorgenommen:
| Vorwärtsprimer | 5' GGG ACG AGC AAG ATT TAT TGG 3' | | Rückwärtsprimer | 5' TAT AGT TAG CCA GGA GAT GG 3' |
Geeignete PCR-Reagenzien werden von zahlreichen Herstellern angeboten. Die im Folgenden beschriebene Methode wird im CEFAS-Labor in Weymouth praktiziert.1. Herstellung des ‚Reaktionsgemischs‘ (50 μl pro Probe):
Im Folgenden wird die Herstellung eines Mastermix erläutert. ⁵⁶⁵⁵Die Herstellung kann vorab erfolgen; anschließend wird der Mastermix bis zur Verwendung bei – 20 °C gelagert. ⁵⁶⁵⁶Der hergestellte Mastermix muss auch für eine negative Kontrolle (nur Wasser in für die Molekularbiologie geeigneter Qualität) ausreichen.
| ⁵⁶⁵⁷Menge (Konz. ⁵⁶⁵⁸Stammlösung) / Probe | Endkonzentration | | 5xGoTaq® Reaktionspuffer | 10 μl | 1 x | | MgCl2 | 5 μl (25 mM) | 2,5 mm | | Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 0,5 μl (jeweils 25 mM) | jeweils 250 μM | | Vorwärtsprimer | 0,5 μl (0,1 nmol/μl) | 2,0 μM | | Rückwärtsprimer | 0,5 μl (0,1 nmol/μl) | 2,0 μM | | Wasser in für die Molekularbiologie geeigneter Qualität | 30,75 μl | | | GoTaq-Polymerase | 0,25 μl | 1,25 U |
- —
- 47,5 μl werden in ein gekennzeichnetes dünnwandiges 0,5 ml-PCR-Röhrchen gegeben.
- —
- ⁵⁶⁵⁹2,5 μl der gereinigten DNA werden in das entsprechend gekennzeichnete Röhrchen geben. ⁵⁶⁶⁰Dieser Schritt ist für alle Proben und für die negative Kontrolle zu wiederholen.
- —
- ⁵⁶⁶¹Mit 2 Tropfen Mineralöl wird ein Überstand erzeugt. ⁵⁶⁶²Alternativ kann ein Thermocycler mit beheiztem Deckel verwendet werden.
- —
- Die Proben werden verschlossen.
- —
- Die Proben wurden 5 Minuten in einem Thermocycler (Peltier PTC-225) bei 94 ± 2 °C denaturiert; danach folgen weitere 39 Zyklen von jeweils 1 Minute bei 94 ± 2 °C, 1 Minute bei 55 ± 2 °C, 1 Minute bei 72 ± 2 °C und schließlich nochmals 10 Minuten bei 72 ± 2 °C.
2. Herstellung des Agarosegels (2 %):Traditionell werden die PCR-Produkte auf einem 20 %igen Agarosegel mit Ethidiumbromid gelöst.
Alternativ können auch Kapillar-Elektrophoresesysteme verwendet werden.
- —
- 2 g Agarose werden in 100 ml 1 × TAE-Puffer eingewogen.
- —
- ⁵⁶⁶⁸Die Agarose wird unter Erwärmung in einem Mikrowellengerät (ca. ⁵⁶⁶⁹2-3 min) aufgelöst.
- —
- 2 Tropfen Ethidiumbromid werden hinzugegeben (Endkonzentration 0,5 μg/ml).
- —
- Die heiße Lösung wird in den Gießstand gegossen.
- —
- Anschließend muss gewartet werden, bis das Gel sich verfestigt hat.
3. Gel-Electrophorese:- —
- Das Agarosegel wird in das Elektrophorese-Gerät gegeben und mit 1 × TAE-Puffer bedeckt.
- —
- Von den Proben werden jeweils 20 μl in jeweils eine Vertiefung gefüllt; außerdem wird ein Molekulargewichtsmarker (100 bp DNA-Leiter, Promega) in eine freie Vertiefung gegeben.
- —
- Die Elektrophorese erfolgt über einen Zeitraum von 30-45 Minuten mit einer Spannung von 120 V.
4. Visualisierung der AmplifikationsprodukteWenn das Ethidiumbromid mit dem Agarosegel gemischt wurde, wie oben beschrieben, werden die DNA-Produkte unter einer UV-Quelle sichtbar gemacht. Alternativ kann das Agarosegel angefärbt werden, indem das Gel vor der Visualisierung 30 Minuten mit einer Ethidiumbromid-Verdünnungslösung (0,5 μg/ml in Wasser) bedeckt wird.
Anlage 11
Leitlinien zur künstlichen Befruchtung bei Dreistachligen Stichlingen
In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Laich des Dreistachligen Stichlings zur anschließenden Verwendung im FSDT befruchtet wird.
Verfahren
Gewinnung des Spermas von den männlichen Fischen
| 1. | Ein kräftig gefärbtes Männchen der gewünschten Population wird getötet. |
| 2. | Auf beiden Seiten werden die Hoden entnommen. Die Hoden sind gewöhnlich als stark pigmentierte, rote Strukturen an der seitlichen Mittellinie des Körpers gut erkennbar. Dabei kann eine der folgenden Methoden verwendet werden: |
| 3. | Mit einer feinen Schere wird von der Kloake im Winkel von etwa 45° mit einem einzigen Schnitt ein 1-1,5 cm langer Einschnitt vorgenommen. |
| 4. | Mit einem Skalpell wird ein kurzer seitlicher Schnitt hinter dem Becken und ventral zu den Knochenplatten entlang der Seitenlinie geführt. |
| 5. | Die Hoden werden mit einer feinen Pinzette entnommen und in eine Petrischale gelegt. |
| 6. | Jeder Hoden wird mit 100 μl frisch hergestellter Hankscher Lösung bedeckt. |
| 7. | ⁵⁶⁸⁴Die Hoden werden mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell fein geschnitten. ⁵⁶⁸⁵Dadurch wird das Sperma freigesetzt, und die Hanksche Lösung erhält ein milchiges Aussehen. |
| 8. | Die Flüssigkeit mit dem Sperma wird in ein Röhrchen gefüllt; beim Pipettieren ist darauf zu achten, dass kein Hodengewebe aufgenommen wird. |
| 9. | 800 μl Hankscher Lösung werden in das Röhrchen gegeben und gut gemischt. |
| 10. | ⁵⁶⁸⁸Wenn erforderlich, kann das Männchen mit 100 %igem Ethanol oder einer sonstigen Fixierlösung fixiert und aufbewahrt werden. ⁵⁶⁸⁹Dies ist besonders wichtig, wenn die juvenilen Fische bei der Untersuchung den Elterntieren zugeordnet werden sollen. |
Wichtiger Hinweis:Die meisten benötigten Stammlösungen können im Voraus hergestellt werden; nur Stammlösung 5 und schließlich die endgültige Lösung müssen am Tag der Verwendung frisch hergestellt werden.| Stammlösung 1 | | NaCl | 8,00 g | | KCl | 0,40 g | | Destilliertes Wasser (DW) | 100 ml | | Stammlösung 2 | | Na2HPO4 (wasserfrei) | 0,358 g | | KH2PO4 | 0,60 g | | DW | 100 ml | | Stammlösung 3 | | CaCl2 | 0,72 g | | DW | 50 ml | | Stammlösung 4 | | MgSO4,7H2O | 1,23 g | | DW | 50 ml | | Stammlösung 5 (frisch hergestellt) | | NaHCO3 | 0,35 g | | DW | 10 ml |
Hinweis: Wenn einige der vorstehenden Salze bereits hergestellt wurden, aber einen anderen Wasseranteil aufweisen (d. h. statt wasserfrei 2H2O), können auch diese verwendet werden, sofern sie vor der Verwendung auf das richtige Gewicht (bezogen Molekulargewicht) gebracht werden.Die Hanksche Lösung wird in der nachstehenden Reihenfolge hergestellt:
| Stammlösung 1 | 1,0 ml | | Stammlösung 2 | 0,1 ml | | Stammlösung 3 | 0,1 ml | | DW | 8,6 ml | | Stammlösung 4 | 0,1 ml | | Stammlösung 5 | 0,1 ml |
Vor der Verwendung müssen die Lösungen gut gemischt werden.Befruchtung
| 1. | ⁵⁶⁹³Aus der betreffenden Population werden große gravide Weibchen ausgewählt. ⁵⁶⁹⁴Die Weibchen sind nur dann zum Herausdrücken des Laichs geeignet, wenn Eier aus der Kloake hervortreten. ⁵⁶⁹⁵Typisch für laichbereite Weibchen ist der ‚angehobene‘ Kopf. |
| 2. | ⁵⁶⁹⁶Mit dem Daumen oder mit einem anderen Finger wird seitlich zum Schwanz über den Fisch gestrichen, um die Abgabe eines Eiersacks in eine frische Petrischale zu provozieren. ⁵⁶⁹⁷Diese Behandlung wird auf der anderen Seite wiederholt. ⁵⁶⁹⁸Anschließend wird der Fisch wieder in das Becken zurückgesetzt. |
| 3. | ⁵⁶⁹⁹Die Eier können mit einem feinen Pinsel (zu einer Monolage) verteilt werden. ⁵⁷⁰⁰Wichtig ist, dass möglichst viele Eier mit dem Sperma in Berührung gebracht werden; hilfreich ist daher die Ausbreitung der Eier über eine möglichst große Fläche. ⁵⁷⁰¹Wichtiger Hinweis: Um die Eier herum müssen feuchte Tücher gelegt werden, damit sie nicht austrocknen. ⁵⁷⁰²(Dabei ist darauf zu achten, dass die Eier nicht unmittelbar mit Wasser in Berührung kommen, damit das Chorion nicht vorzeitig verhärtet und eine Befruchtung verhindern würde.) Die Anzahl der von einem Weibchen produzierten Eier kann erheblich schwanken; in der Regel werden aber von einem einzigen graviden Weibchen leicht etwa 150 Eier gewonnen. |
| 4. | ⁵⁷⁰³25 μl Sperma in der Hankschen Lösung werden mit einem Pinsel gleichmäßig über die gesamte Fläche der Eier verteilt. ⁵⁷⁰⁴Die Eier verhärten rasch und ändern (innerhalb einer Minute) ihre Farbe, sobald die Befruchtung begonnen hat. ⁵⁷⁰⁵Wenn geschätzt mehr als 150 Eier entnommen wurden, ist der Schritt zu wiederholen. ⁵⁷⁰⁶Verhärten die Eier nicht binnen einer Minute, ist etwas mehr Sperma hinzugeben. ⁵⁷⁰⁷Wichtiger Hinweis: Die Zugabe einer größeren Spermamenge erhöht nicht zwangsläufig die Befruchtungsrate. |
| 5. | Die Eier und die Spermalösung müssen mindestens 15 Minuten miteinander ‚reagieren‘ können; anschließend sind die befruchteten Eier spätestens 1,5 Stunden nach der Befruchtung in das Expositionsbecken zu bringen. |
| 6. | Das Verfahren wird mit einem anderen Weibchen wiederholt, bis die benötigte Anzahl an Eiern entnommen wurde. |
| 7. | Vom letzten Entnahmeschritt sind einige Eier aufzubewahren und in 10 %iger Essigsäure zu fixieren. |
Zählen und Verteilen der Eier im Prüfbecken | 1. | ⁵⁷¹¹Um einen Bias durch genetische Effekte zu vermeiden, werden die Eier gleichmäßig auf die einzelnen Konzentrationen verteilt. ⁵⁷¹²Die Chargen der befruchteten Eier sind mit einem stumpfen Instrument (d. h. mit einer breiten Entomologiepinzette oder mit einer Inokulationsöse) jeweils in gleich große Gruppen zu teilen (entsprechend der Anzahl der Konzentrationen). ⁵⁷¹³Wenn 4 Replikate mit jeweils 20 Eiern pro Konzentration vorgesehen sind, müssen in jedes Expositionsbecken mindestens 80 Eier gegeben werden. ⁵⁷¹⁴Wichtiger Hinweis: Eine Zugabe von 20 % (d. h. insgesamt 96 Eier pro Konzentration) ist empfehlenswert, bis mit Sicherheit davon ausgegangen werden kann, dass die Eier zu 100 % befruchtet sind. |
| 2. | ⁵⁷¹⁵Stichling-Eier entwickeln außerhalb des von den Männchen bewachten Nests sehr leicht Pilzinfektionen. ⁵⁷¹⁶Daher ist entscheidend, dass alle Eier während der ersten 5 Tage des Tests mit Methylenblau behandelt werden. ⁵⁷¹⁷Methylenblau-Stammlösung wird mit einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt und in das Expositionsbecken gegeben, bis eine endgültige Konzentration von höchstens 2,125 mg/l erreicht ist. ⁵⁷¹⁸Wichtiger Hinweis: Stichlinge dürfen nicht mit Methylenblau in Berührung kommen; nach dem Schlüpfen muss das Methylenblau entfernt werden, und an Tag 6 darf sich kein Methylenblau mehr im Becken befinden. |
| 3. | ⁵⁷¹⁹Die Eier werden täglich geprüft; die Anzahl der abgestorbenen und nicht befruchteten Eier wird protokolliert. ⁵⁷²⁰Wichtiger Hinweis: Die Eier müssen bis zum Schlüpfen ständig unter Wasser bleiben und dürfen auch kurzzeitig nicht aus dem Wasser genommen werden. |
C.42 BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT IN MEERWASSERALLGEMEINE EINLEITUNG
| 1. | ⁵⁷²¹Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 306 (1992). ⁵⁷²²Als die ursprünglichen Prüfmethoden entwickelt wurden, war nicht bekannt, in welchem Umfang Ergebnisse der Screening-Tests zur Prüfung auf leichte biologische Abbaubarkeit in Süßwasser mit Abwässern oder Belebtschlamm als Inokulum auf die Meeresumwelt übertragbar waren. ⁵⁷²³In diesem Zusammenhang wurde über unterschiedliche Ergebnisse berichtet (z. B. (1)). |
| 2. | ⁵⁷²⁴Viele industrielle Abwässer enthalten zahlreiche Chemikalien. ⁵⁷²⁵Diese gelangen entweder über direkte Einleitung oder über Ästuarien und Flüsse, in denen die Verweilzeiten gemessen an den für einen vollständigen biologischen Abbau erforderlichen Zeiträumen vieler Chemikalien verhältnismäßig kurz sind, in die Meere. ⁵⁷²⁶Da die Notwendigkeit des Schutzes der Meeresumwelt vor steigenden Belastungen durch Chemikalien zunehmend ins Bewusstsein rückt und da die wahrscheinlichen Konzentrationen von Chemikalien im Meer abgeschätzt werden müssen, wurden Methoden zur Prüfung der biologischen Abbaubarkeit in Meerwasser entwickelt. |
| 3. | ⁵⁷²⁷In den hier beschriebenen Methoden wird natürliches Meerwasser sowohl als wässrige Phase als auch als Bezugsquelle für Mikroorganismen. genutzt. ⁵⁷²⁸Analog zu den Methoden zur Prüfung der leichten biologischen Abbaubarkeit in Süßwasser wurde ultragefiltertes und zentrifugiertes Meerwasser untersucht, und Meeressedimente wurden als Inokulum verwendet. ⁵⁷²⁹Diese Untersuchungen führten nicht zum Ziel. ⁵⁷³⁰Als Prüfmedium wird daher natürliches Meerwasser verwendet, aus dem grobe Partikel abgetrennt wurden. |
| 4. | ⁵⁷³¹Um die vollständige biologische Abbaubarkeit mit der Schüttelmethode zu ermitteln, müssen angesichts der geringen Empfindlichkeit der analytischen Methode für gelösten organischen Kohlenstoff (DOC Die-Away-Tests) verhältnismäßig hohe Konzentrationen des Prüfstoffes verwendet werden. ⁵⁷³²Dazu wiederum müssen zum Meerwasser mineralische Nährstoffe (N und P) hinzugegeben werden; ansonsten würden die betreffenden niedrigen Konzentrationen den Abbau des gelösten organischen Kohlenstoffs beeinträchtigen. ⁵⁷³³Es ist auf Grund der Konzentration des verwendeten Prüfstoffes ebenfalls erforderlich, Nährstoffe in den geschlossenenen Flaschentest (Closed Bottle-Method) hinzuzugeben. |
| 5. | ⁵⁷³⁴Insoweit handelt es sich bei den Methoden nicht um Tests auf leichte biologische Abbaubarkeit, da über die bereits im Meerwasser befindlichen Mikroorganismen hinaus kein Inokulum zugegeben wird. ⁵⁷³⁵In den Tests wird auch die Meeresumwelt nicht simuliert, weil Nährstoffe hinzugegeben werden und weil die Konzentration des Prüfstoffes wesentlich höher ist als in natürlicher Umgebung. ⁵⁷³⁶Aus diesen Gründen werden die Methoden unter dem neuen Unterabschnitt ‚Biologische Abbaubarkeit in Meerwasser‘ vorgeschlagen. |
ANWENDUNG | 6. | ⁵⁷³⁷Die Ergebnisse der Prüfungen, die für Stoffe durchgeführt werden, die aufgrund ihrer Verwendungsformen und ihrer Entsorgung letztlich ins Meer gelangen können, vermitteln einen ersten Eindruck von der biologischen Abbaubarkeit in Meerwasser. ⁵⁷³⁸Bei positivem Ergebnis (Abbau des gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC) > 70 %; theoretischer Sauerstoffbedarf (ThSB) > 60 %) kann ein Potenzial für den biologischen Abbau in der Meeresumwelt festgestellt werden. ⁵⁷³⁹Ein negatives Ergebnis schließt ein solches Potenzial jedoch nicht zwangsläufig aus, sondern bedeutet nur, dass weitere Untersuchungen vorgenommen werden müssen (beispielsweise mit einer möglichst niedrigen Konzentration des Prüfstoffes). |
| 7. | ⁵⁷⁴⁰Wenn ein definitiverer Wert für die Rate des biologischen Abbaus in Meerwasser an einem bestimmten Standort benötigt wird, müssen in beiden Fällen komplexere, aufwendigere und entsprechend kostspieligere Methoden verwendet werden. ⁵⁷⁴¹Beispielsweise könnte ein Simulationstest mit einer Konzentration des Prüfstoffs durchgeführt werden, die näher an der wahrscheinlichen Konzentration in der Umwelt liegt. ⁵⁷⁴²Auch nicht angereichertes, nicht behandeltes Meerwasser, das am betreffenden Standort entnommen wurde, kann verwendet werden, und nach dem primären biologischen Abbau kann eine spezifische chemische Analyse vorgenommen werden. Zur Prüfung der vollständigen biologischen Abbaubarkeit werden 14C markierte Stoffe benötigt, damit der Abbau von löslichem organischem 14C sowie die Entstehung von 14CO2 bei umweltrelevanten Konzentrationen gemessen werden können. |
WAHL DER METHODEN | 8. | ⁵⁷⁴³Die Wahl der zu verwendenden Methode hängt von verschiedenen Faktoren ab. ⁵⁷⁴⁴Die folgende Tabelle vermittelt einen Überblick, der die Wahl erleichtern soll. ⁵⁷⁴⁵Während Stoffe mit einer Wasserlöslichkeit unterhalb eines Wertes von etwa 5 mg C/l mit der Schüttelmethode nicht getestet werden können, lassen sich schlecht lösliche Stoffe prinzipiell zumindest mit einem geschlossenen Flaschen-Test untersuchen.Tabelle
Vorteile und Nachteile des Schüttelkolben-Tests und des geschlossenen Flaschentests
| METHODE | VORTEILE | NACHTEILE | | SCHÜTTELKOLBEN | - —
- einfache Apparatur (abgesehen vom C-Analysegerät)
- —
- eine Testdauer von 60 Tagen ist unproblematisch
- —
- keine Beeinflussung durch Nitrifikation
- —
- Anpassung zur Berücksichtigung flüchtiger Stoffe möglich
| - —
- C-Analysegerät erforderlich
- —
- bei Verwendung von 5-40 mg DOC/1 können Hemmwirkungen auftreten
- —
- Ermittlung des gelösten organischen Kohlenstoffs mit geringen Konzentrationen im Meerwasser ist schwierig (Chlorideffekt)
- —
- DOC ist bei Meerwasser manchmal hoch
| | GESCHLOSSENE FLASCHE | - —
- einfache Apparatur
- —
- einfache Endbestimmung
- —
- durch Verwendung geringer Konzentrationen des Prüfstoffes (2 mg/l); entsprechend geringeres Hemmpotenzial
- —
- einfache Anpassung zur Berücksichtigung flüchtiger Stoffe
| - —
- unter Umständen Schwierigkeiten beim Aufrechterhalten der Luftdichtheit der Flaschen
- —
- mögliche Verfälschung der Werte durch Bakterienwachstum an den Wänden
- —
- die Werte für die Sauerstoffaufnahme der Blindkontrolle können hoch sein, besonders nach 28 Tagen; Abhilfe möglicherweise durch Alterung des Meerwassers
- —
- mögliche Störungen infolge der Sauerstoffaufnahme durch die Nitrifikation
|
|
SCHÜTTELMETHODEEINLEITUNG
| 1. | ⁵⁷⁴⁶Diese Methode ist die Meerwasser-Variante des in diesem Anhang in Kapitel C.4B beschriebenen modifizierten OECD-Screening-Tests (2). ⁵⁷⁴⁷Der Test wurde nach einem vom Dänischen Institut für Wasserqualität im Auftrag der Europäischen Kommission durchgeführten Ringtest abschließend beschrieben (3). |
| 2. | Wie beim begleitenden geschlossenen Flaschen-Test für Meerwasser sind auch die Ergebnisse dieses Tests nicht als Indikatoren für eine leichte biologische Abbaubarkeit zu betrachten, sondern vielmehr zur Ermittlung weiterer Informationen über die biologische Abbaubarkeit von Stoffen in der Meeresumwelt zu verwenden. |
PRINZIP DER METHODE | 3. | ⁵⁷⁴⁹Eine vorher festgelegte Menge des Prüfstoffes wird im Testmedium so gelöst, dass sich eine Konzentration von 5-40 mg gelöstem organischem Kohlenstoff (DOC)/l ergibt. ⁵⁷⁵⁰Wenn die Nachweisgrenzen der Analysen auf organischen Kohlenstoff verbessert werden, kann die Verwendung geringerer Konzentrationen des jeweiligen Prüfstoffes von Vorteil sein, insbesondere bei Stoffen mit hemmender Wirkung. ⁵⁷⁵¹Die Lösung des Prüfstoffes im Prüfmedium wird unter Schütteln im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung unter aeroben Bedingungen bei einer konstanten Temperatur (gewöhnlich im Bereich von 15-20 °C,), geregelt auf ± 2 °C inkubiert. ⁵⁷⁵²Wenn mit der Untersuchung Umweltbedingungen simuliert werden sollen, können die Tests auch außerhalb dieses normalen Temperaturbereichs durchgeführt werden. ⁵⁷⁵³Der Test sollte im Allgemeinen höchstens etwa 60 Tage dauern. ⁵⁷⁵⁴Der Abbau wird durch DOC-Messungen überwacht (endgültiger Abbau); in manchen Fällen erfolgt die Überwachung durch spezifische Analysen (primärer Abbau). |
INFORMATIONEN ZUM PRÜFSTOFF | 4. | ⁵⁷⁵⁵Um festzustellen, welcher Test bei einem bestimmten Stoff durchzuführen ist, müssen einige Merkmale des Stoffes bekannt sein. ⁵⁷⁵⁶Der Gehalt des Stoffes an organischen Kohlenstoffen ist zu ermitteln; die Flüchtigkeit muss so weit begrenzt sein, dass es während des Tests nicht zu erheblichen Verlusten kommt, und die Löslichkeit in Wasser muss einem Wert von mehr als 25-40 mg C/l entsprechen. ⁵⁷⁵⁷Außerdem darf der Prüfstoff nicht erheblich auf Glasflächen adsorbieren. ⁵⁷⁵⁸Informationen zur Reinheit oder zu den relativen Anteilen der Hauptkomponenten des Prüfstoffes werden benötigt, damit die Testergebnisse entsprechend interpretiert werden können. ⁵⁷⁵⁹Dies gilt insbesondere bei sehr knappem Testergebnis im Bereich des ‚Pass‘-Levels. |
| 5. | ⁵⁷⁶⁰Informationen über die Toxizität des Prüfstoffes für Bakterien (beispielsweise gemessen anhand des Kurzzeit-Atemfrequenztests (4)) können für die Wahl geeigneter Prüfkonzentrationen zweckdienlich und für die korrekte Interpretation niedriger Abbaubarkeitswerte erforderlich sein. ⁵⁷⁶¹Diese Informationen sind jedoch nicht immer hinreichend für die Interpretation der Ergebnisse von Tests zur Prüfung der biologischen Abbaubarkeit; eher geeignet ist gegebenenfalls das in Nummer 18 beschriebene Verfahren. |
REFERENZSTOFFE | 6. | ⁵⁷⁶²Zur Prüfung der mikrobiologischen Aktivität der Meerwasserproben sind geeignete Referenzstoffe zu verwenden, beispielsweise Natriumbenzoat, Natriumacetat und Anilin. ⁵⁷⁶³Die Referenzstoffe müssen in einer relativ kurzen Zeitspanne abgebaut sein; ansonsten sollte der Test mit einer anderen Meerwasserprobe wiederholt werden. |
| 7. | Im Ringtest der Europäischen Kommission, bei dem Meerwasserproben an unterschiedlichen Standorten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe eines Jahres genommen wurden (3), betrugen bei Natriumbenzoat die ‚Lag‘-Phase (tL) 1 bis 4 Tage und die Zeitdauer bis zu einem Abbau von 50 % (t50) (ohne ‚Lag‘-Phase) 1 bis 7 Tage. Bei Anilin belief sich tL auf 0-10 Tage; t50 lag bei 1-10 Tagen. |
REPRODUZIERBARKEIT UND EMPFINDLICHKEIT DER METHODE | 8. | ⁵⁷⁶⁵Die Reproduzierbarkeit der Methode wurde im Ringtest nachgewiesen (3). ⁵⁷⁶⁶Die niedrigste Konzentration des Prüfstoffes, bei der diese Methode noch in Verbindung mit einer DOC-Analyse verwendet werden kann, hängt weitgehend von der Nachweisgrenze bei der Ermittlung des Gehalts an organischen Kohlenstoff (gegenwärtig etwa 0,5 mg C/l) und von der Konzentration des gelösten organischen Kohlenstoffs im verwendeten Meerwasser (gewöhnlich 3-5 mg/l bei Proben aus dem offenen Meer) ab. ⁵⁷⁶⁷Die Hintergrundkonzentration an gelöstem organischem Kohlenstoff darf nicht mehr als etwa 20 % der gesamten DOC-Konzentration nach Zugabe des Prüfstoffes betragen. ⁵⁷⁶⁸Wenn dies nicht möglich ist, kann die DOC-Hintergrundkonzentration manchmal durch Alterung des Meerwassers vor dem Testen reduziert werden. ⁵⁷⁶⁹Wird diese Methode ausschließlich in Verbindung mit bestimmten chemischen Analysen verwendet (um den primären Abbau zu messen), muss der Prüfer anhand zusätzlicher Informationen angeben, ob ein vollständiger Abbau zu erwarten ist. ⁵⁷⁷⁰Diese zusätzlichen Informationen können aus den Ergebnissen anderer Tests zum Nachweis einer leichten oder inhärenten biologischen Abbaubarkeit bestehen. |
BESCHREIBUNG DER METHODEApparatur
| 9. | Übliche Laborausrüstung und folgende Geräte:- a.
- Schüttelmaschine für 0,5- bis 2-l-Erlenmeyer-Kolben, entweder mit automatischer Temperaturregelung oder zur Verwendung in einem Raum mit konstanter Temperatur von 15-20 °C (geregelt auf ± 2 °C);
- b.
- 0,5- bis 2-l-Erlenmeyer-Kolben mit engem Hals;
- c.
- Membranfiltrationsgerät oder Zentrifuge;
- d.
- Membranfilter, 0,2-0,45μm;
- e.
- Kohlenstoffanalysator;
- f.
- Ausrüstung für spezifische Analysen (optional).
|
Meerwasser | 10. | ⁵⁷⁷²In einem gründlich gereinigten Behältnis wird eine Meerwasserprobe genommen und möglichst innerhalb von ein bis zwei Tagen nach der Entnahme ins Labor gebracht. ⁵⁷⁷³Während des Transports darf die Probentemperatur die Testtemperatur nicht erheblich überschreiten. ⁵⁷⁷⁴Der Entnahme-Standort ist genau zu bezeichnen und hinsichtlich seines Verschmutzungsgrads und des Nährstoffgehalts zu beschreiben. ⁵⁷⁷⁵Insbesondere bei Proben aus Küstengewässern werden zudem die Koloniezahl heterotropher Mikroorganismen und die Konzentrationen an gelöstem Nitrat, Ammonium und Phosphat angegeben. |
| 11. | Für die eigentliche Meerwasserprobe sind folgende Informationen anzugeben:- —
- Entnahmedatum:
- —
- Tiefe der Probenahme;
- —
- Aussehen der Probe — z. B. trüb;
- —
- Temperatur zum Entnahmezeitpunkt;
- —
- Salzgehalt;
- —
- DOC;
- —
- Zeitspanne zwischen der Probenahme und der Verwendung im Test.
|
| 12. | ⁵⁷⁷⁷Wenn der DOC-Gehalt der Meerwasserprobe zu hoch ist (Nummer 8), wird vor der Verwendung eine Alterung des Meerwassers um etwa eine Woche empfohlen. ⁵⁷⁷⁸Die Alterung erfolgt durch Aufbewahrung unter aeroben Bedingungen bei Testtemperatur im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung. ⁵⁷⁷⁹Erforderlichenfalls ist durch mäßige Belüftung Sauerstoff zuzuführen. ⁵⁷⁸⁰Bei der Alterung verringert sich der Anteil leicht abbaubaren organischen Materials. ⁵⁷⁸¹Im Ringtest (3) wurde kein Unterschied zwischen dem Abbaupotenzial gealterter und frisch entnommener Meerwasserproben festgestellt. ⁵⁷⁸²Vor der Verwendung werden grobe Partikel aus dem Meerwasser abgetrennt (beispielsweise unter Filtration durch einen Nylonfilter oder ein grobes Papier (jedoch keine Membran- und keine GF-C-Filter) oder durch Ausfällen und Dekantieren). ⁵⁷⁸³Das verwendete Verfahren wird im Bericht vermerkt. ⁵⁷⁸⁴Eine Vorbehandlung wird ggf. ⁵⁷⁸⁵nach der Alterung durchgeführt. |
Stammlösungen mit mineralischen Nährstoffen | 13. | Die folgenden Stammlösungen werden mit Reagenzien in Analysequalität hergestellt:| (a) | Kaliumdihydrogenorthophosphat, KH2PO4 | 8,50 g | | Dikaliummonohydrogenorthophosphat, K2HPO4 | 21,75 g | | Dinatriummonohydrogenorthophosphat-Dihydrat, Na2HPO4.2H2O | 33,30 g | | Ammoniumchlorid, NH4Cl | 0,50 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | | | (b) | Calciumchlorid, CaCl2 | 27,50 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | | | (c) | Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO4 7H2O | 22,50 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | | | (d) | Eisen (III)chlorid-Hexahydrat, FeCl3 6H2O | 0,25 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | |
⁵⁷⁹⁰Das Ausfällen aus Lösung (d) kann verhindert werden, indem ein Tropfen konzentrierter Salzsäure oder 0,4 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Dinatriumsalz) pro Liter hinzugegeben werden. ⁵⁷⁹¹Wenn es in einer Stammlösung zu einer Ausfällung kommt, ist die Lösung durch eine frisch hergestellte Lösung zu ersetzen. |
Herstellung des Prüfmediums | 14. | Pro Liter vorbehandeltes Meerwasser wird jeweils 1 ml der oben genannten Stammlösungen hinzugegeben. |
Inokulum | 15. | ⁵⁷⁹³Zusätzlich zu den bereits im Meerwasser vorhandenen Mikroorganismen darf kein spezifisches Inokulum hinzugegeben werden. ⁵⁷⁹⁴Die Anzahl der koloniebildenden Heterotrophe im Meerwasser-Prüfmedium (sowie vorzugsweise auch in den ursprünglichen Meerwasserproben) kann fakultativ (beispielsweise durch Plattenzählung mit Meerwasseragar) bestimmt werden. ⁵⁷⁹⁵Dies ist insbesondere bei Proben aus Küstengewässern oder aus verschmutzten Standorten wünschenswert. ⁵⁷⁹⁶Die heterotrophe mikrobiologische Aktivität des Meerwassers wird anhand eines Tests mit einem Referenzstoff geprüft. |
Ansetzen der Flaschen | 16. | ⁵⁷⁹⁷Um Kontaminationen durch Rückstände aus früheren Tests zu vermeiden, müssen sämtliche Glasgeräte äußerst sauber, wenn auch nicht unbedingt steril, sein (beispielsweise kann alkoholische Salzsäure verwendet werden) und vor der Verwendung gewaschen und getrocknet werden. ⁵⁷⁹⁸Auch vor der erstmaligen Verwendung sind die Kolben zu reinigen. |
| 17. | ⁵⁷⁹⁹Die Prüfstoffe werden jeweils in zwei Kolben (Duplikate) zusammen mit einer einzelnen Flasche mit dem Referenzstoff untersucht. ⁵⁸⁰⁰Zur Bestimmung des analytischen Blindwerts wird ein doppelter Blindtest durchgeführt, bei dem weder der Prüfstoff noch ein Referenzstoff verwendet werden. ⁵⁸⁰¹Die Prüfstoffe werden so im Prüfmedium gelöst (einfache Zugabe über eine konzentrierte Stammlösung), dass die gewünschten Ausgangskonzentrationen von gewöhnlich 5-40 mg DOC/l erhalten wird. ⁵⁸⁰²Die Referenzstoffe werden in der Regel bei einer Ausgangskonzentration von 20 mg DOC/l getestet. ⁵⁸⁰³Wenn Stammlösungen der Prüfstoffe und/oder der Referenzstoffe verwendet werden, ist sicherzustellen, dass der Salzgehalt des Meerwassermediums nicht erheblich verändert wird. |
| 18. | ⁵⁸⁰⁴Wenn toxische Wirkungen zu erwarten sind oder nicht ausgeschlossen werden können, kann es empfehlenswert sein, im Versuchsaufbau einen Inhibitionstest in doppelter Ausführung vorzusehen. ⁵⁸⁰⁵Die Prüfstoffe und die Referenzstoffe werden in das gleiche Gefäß gegeben. ⁵⁸⁰⁶Die Konzentration des Referenzstoffes sollte identisch sein wie im Kontrollansatz (d. h. 20 mg DOC/l). |
| 19. | ⁵⁸⁰⁷In die Erlenmeyer-Kolben werden geeignete Mengen an Testlösungen gegeben (bewährt hat sich eine Füllung bis etwa zur Hälfte des Fassungsvermögens); und diese anschließend lose verschlossen (z. B. mit einer Alufolie), damit noch ein Gasaustausch zwischen dem Kolben und der Umgebungsluft stattfinden kann. ⁵⁸⁰⁸(Baumwollstopfen sind für DOC-Analysen ungeeignet.) Die Gefäße werden in die Schüttelmaschine gestellt und während des gesamten Tests kontinuierlich mit mäßiger Bewegung (z. B. 100 U/min) geschüttelt. ⁵⁸⁰⁹Die Temperatur wird geregelt auf 15-20 (± 2 °C), und die Gefäße werden vor Lichteinfall geschützt, damit sich keine Algen bilden. ⁵⁸¹⁰Die Umgebungsluft muss frei von toxischen Materialien sein. |
Physikalisch-chemische Kontrolle (optional) | 20. | ⁵⁸¹¹Wenn ein abiotischer Abbau oder andere Verlustprozesse, wie Hydrolyse (ein Problem nur bei der spezifischen Analyse), eine Verflüchtigung oder eine Adsorption zu erwarten sind, ist anzuraten, eine physikalisch-chemische Kontrolle durchzuführen. Das kann durch Zugabe von Quecksilber(II)-chlorid (HgCl2) (50-100 mg/l) in die Gefäße erfolgen, um die mikrobielle Aktivität zu unterbinden. ⁵⁸¹²Ein erheblicher Rückgang des DOC oder eine spezifische Konzentration eines Stoffes in der physikalisch-chemischen Kontrolle deutet auf abiotische Abbaumechanismen hin. (Wenn Quecksilberchlorid verwendet wird, ist bei der DOC-Analyse auf etwaige Störungen oder die Freisetzung von Katalysatorgiften zu achten.) |
Anzahl der Kolben | 21. | Bei einem typischen Test werden die folgenden Flaschen verwendet:| Kolben 1 und 2 | — | Prüfstoff (Testsuspension); | | Kolben 3 und 4 | — | nur Meerwasser (Blindprobe); | | Kolben 5 | — | Referenzstoff (Verfahrenskontrolle); | | Kolben 6 | — | Prüfstoff und Referenzstoff (Toxizitätskontrolle) — optional; | | Kolben 7 | — | Prüfstoff und Sterilisationsmittel (abiotische sterile Kontrolle) — optional. |
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DOC-Analyse | 22. | ⁵⁸¹⁴Im Laufe des Tests werden in geeigneten Intervallen Proben zur DOC-Analyse entnommen (Anlage 1). ⁵⁸¹⁵Grundsätzlich muss eine Entnahme zu Beginn des Tests (Tag 0) und an Tag 60 erfolgen. ⁵⁸¹⁶Insgesamt werden mindestens fünf Proben benötigt, um den zeitlichen Verlauf des Abbaus beschreiben zu können. ⁵⁸¹⁷Ein bestimmter zeitlicher Rahmen für die Probenahme kann nicht vorgegeben werden, da die Geschwindigkeit des biologischen Abbaus stark variiert. ⁵⁸¹⁸Die DOC-Analyse wird für die einzelnen Proben jeweils doppelt vorgenommen. |
Probenahme | 23. | ⁵⁸¹⁹Das benötigte Probenvolumen hängt von der Analysemethode (spezifische Analyse) sowie vom verwendeten Kohlenstoffanalysator und vom gewählten Verfahren (Membranfiltration oder Zentrifugierung) zur Behandlung der Probe vor der Bestimmung des Kohlenstoffgehalts ab (Nummern 25 und 26). ⁵⁸²⁰Vor der Probenahme ist sicherzustellen, dass das Prüfmedium gut gemischt wird und dass jegliches an den Wänden der Kolben anhaftende Material gelöst oder suspendiert wird. |
| 24. | ⁵⁸²¹Unmittelbar nach der Probenahme wird eine Membranfiltration oder eine Zentrifugierung vorgenommen. ⁵⁸²²Erforderlichenfalls werden die gefilterten oder zentrifugierten Proben bis zu 48 Stunden bei 2-4 °C oder über längere Zeiträume bei – 18 °C aufbewahrt. (Wenn bekannt ist, dass der Stoff dadurch nicht beeinträchtigt wird, wird die Probe vor der Lagerung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt.) |
| 25. | ⁵⁸²³Membranfilter (0,2-0,45 μm) können verwendet werden, wenn gewährleistet ist, dass sie bei der Filtration weder Kohlenstoff freisetzen noch den Stoff adsorbieren (z. B. Polycarbonat-Filter). ⁵⁸²⁴Manche Membranfilter werden mit Tensiden imprägniert und können beträchtliche Mengen an gelöstem Kohlenstoff freisetzen. ⁵⁸²⁵Diese Filter sind dreimal nacheinander jeweils für eine Stunde in entionisiertem Wasser auszukochen. ⁵⁸²⁶Nach dem Auskochen werden die Filter in entionisiertem Wasser aufbewahrt. ⁵⁸²⁷Die ersten 20 ml des Filtrats werden verworfen. |
| 26. | Alternativ zur Membranfiltration können die Proben auch zentrifugiert werden. Die Zentrifugierung erfolgt über 15 Minuten bei 40 000 m.s– 2 (~ 4 000 g), vorzugsweise in einer Kühlzentrifuge.Hinweis: Beim Zentrifugieren mit sehr niedrigen Konzentrationen scheint die Unterscheidung zwischen TOC (Total Organic Carbon = gesamter organisch gebundener Kohlenstoff) und DOC (Dissolved Organic Carbon = gelöster Kohlenstoff) nicht möglich zu sein, da entweder nicht alle Bakterien abgetrennt werden oder da der im Bakterienplasma enthaltene Kohlenstoff wieder gelöst wird. Bei höheren Prüfkonzentrationen (> 10 mg C/l) scheint der Fehler beim Zentrifugieren verhältnismäßig gering zu sein.
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Häufigkeit der Probenahme | 27. | Wenn Analysen unmittelbar nach der Probenahme vorgenommen werden, richtet sich der Zeitpunkt der nächsten Probenahme nach dem Ergebnis der Analyse. |
| 28. | ⁵⁸³²Werden Proben zur Analyse zu einem späteren Zeitpunkt aufbewahrt (Nummer 24), sind mehr als die mindestens erforderlichen fünf Proben zu nehmen. ⁵⁸³³Die zuletzt entnommenen Proben werden zuerst analysiert; durch eine schrittweise ‚rückwärts‘- Auswahl der entsprechenden Proben für die Analyse ist es möglich, eine gute Beschreibung der Bioabbaukurve mit einer relativ geringen Anzahl analytischer Bestimmungen zu erhalten. ⁵⁸³⁴Wenn am Ende des Tests kein biologischer Abbau erfolgt ist, brauchen keine weiteren Proben analysiert zu werden. ⁵⁸³⁵In diesem Fall kann die Strategie der ‚Rückwärtszählung‘ Analysekosten in erheblichem Umfang einsparen. |
| 29. | ⁵⁸³⁶Wenn die Abbaukurve vor Tag 60 ein Plateau erreicht, wird der Test beendet. ⁵⁸³⁷Findet der Abbau am Tag 60 offensichtlich statt, aber ist noch kein Plateau erreicht, ist der Versuch zu verlängern. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 30. | Die Ergebnisse der Analyse werden auf dem beigefügten Datenblatt (Anlage 2) protokolliert; anschließend wird der biologische Abbau des Prüfstoffes und der Referenzstoffe mit folgender Gleichung ermittelt:
Dabei sind:
| Dt | = | Abbau in Prozent DOC oder spezifischer Stoffabbau zum Zeitpunkt t, | | Co | = | Ausgangskonzentration DOC oder des spezifischen Stoffs im Prüfmedium, | | Ct | = | Konzentration DOC oder des spezifischen Stoffs im Prüfmedium zum Zeitpunkt t, | | Cbl(0) | = | Ausgangskonzentration DOC oder des spezifischen Stoffs in der Blindprobe, | | Cbl(t) | = | Konzentration DOC oder des spezifischen Stoffs in der Blindprobe zum Zeitpunkt t, |
|
| 31. | Der Abbau ist als prozentualer Abbau des gelösten organischen Kohlenstoffs (vollständiger Abbau) oder als Abbau spezifischer Stoffe (primärer Abbau) zum Zeitpunkt t anzugeben. Die DOC-Konzentrationen werden auf 0,1 mg/l berechnet; die Mittelwerte von Dt werden auf volle Prozentwerte gerundet. |
| 32. | Der Verlauf des biologischen Abbaus wird grafisch dargestellt (siehe Abbildung ‚Validität und Interpretation der Ergebnisse‘. Wenn hinreichende Daten vorliegen, werden aus der Kurve die ‚Lag‘-Phase (tL) und der Zeitpunkt berechnet, zu dem seit dem Ende der ‚Lag‘-Phase ein Abbau um 50 % erreicht ist (t50). |
Prüfbericht | 33. | Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: | Prüfstoff:- —
- physikalischer Zustand und, soweit relevant, physikalisch-chemische Eigenschaften.
- —
- Kenndaten;
|
| Prüfbedingungen:- —
- Lage und Beschreibung des Standorts der Probenahme; Verschmutzungsgrad und Nährstoffgehalt (ggf. Koloniezahl, Nitrat, Ammonium, Phosphat);
- —
- Merkmale der Probe (Datum der Probenahme, Tiefe, Aussehen, Temperatur, Salzgehalt, DOC (optional), Zeitraum zwischen Probenahme und Verwendung im Test;
- —
- verwendete Methode (ggf.) zur Alterung des Meerwassers;
- —
- Methode zur Vorbehandlung (Filtration/Sedimentation) des Meerwassers;
- —
- Methode zur DOC-Bestimmung;
- —
- Ausrüstung für spezifische Analysen (optional);
- —
- Methode zur Bestimmung der Anzahl der Heterotrophen im Meerwasser (Plattenzählung oder alternatives Verfahren) (optional);
- —
- sonstige Methoden (optional) zur Beschreibung des Meerwassers (ATP-Messungen usw.).
|
| Ergebnisse:- —
- auf einem Datenblatt eingetragene Analysedaten (Anlage 2);
- —
- Der Verlauf des Abbautests wird in einem Diagramm dargestellt, aus dem die ‚Lag‘-Phase (tL), die Steigung und die Dauer (ab dem Ende der ‚Lag‘-Phase) bis zu einem Abbau von 50 % (t50) hervorgehen. Die ‚Lag‘-Phase kann aufgrund der grafischen Darstellung abgeschätzt (siehe Abbildung im Abschnitt ‚Validität und Interpretation der Ergebnisse‘) oder auch einfach als Dauer bis zu einem Abbau von 10 % angenommen werden.
- —
- gemessener Abbau in Prozent. nach 60 Tagen oder am Ende des Tests
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| Diskussion der Ergebnisse. |
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Validität und Interpretation der Ergebnisse | 34. | ⁵⁸⁴⁵Die mit den Referenzstoffen (z. B. Natriumbenzoat, Natriumacetat oder Anilin) ermittelten Ergebnisse sollten mit den im Ringtest erhaltenen Ergebnissen (3) vergleichbar sein (siehe Abschnitt ‚Referenzstoffe‘, Nummer 7). ⁵⁸⁴⁶Wenn mit Referenzstoffen untypische Ergebnisse ermittelt werden, ist der Test mit einer anderen Meerwasserprobe zu wiederholen. ⁵⁸⁴⁷Obwohl die Ergebnisse von Inhibitionstests auf Grund der Beteiligung von DOC durch den Prüfstoff nicht immer einfach zu interpretieren sind, ist eine signifikante Verringerung des gesamten gelösten Kohlenstoffs gegenüber der Kontrolle ein klares Anzeichen für toxische Effekte. |
| 35. | ⁵⁸⁴⁸Wegen der Verwendung verhältnismäßig hoher Prüfkonzentrationen im Vergleich zu den meisten natürlichen Systemen (und entsprechend einem ungünstigen Verhältnis zwischen den Konzentrationen der Prüfstoffe und sonstiger Kohlenstoffquellen) wird diese Methode als Vorversuch betrachtet, mit dem ermittelt werden kann, ob ein Stoff grundsätzlich leicht biologisch abbaubar ist. ⁵⁸⁴⁹Ein niedriges Ergebnis bedeutet daher nicht unbedingt, dass der Prüfstoff in der Meeresumwelt nicht biologisch abbaubar wäre, sondern ist Anzeichen dafür, dass zur Klärung weitere Arbeiten durchgeführt werden müssen.In der folgenden Abbildung ist ein Beispiel zur Ermittlung des theoretischen Abbaus als Möglichkeit zur Abschätzung von tL (Dauer der ‚Lag‘-Phase) und t50 (Zeitdauer ab tL bis zu einem Abbau von 50 %) dargestellt:
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GESCHLOSSENER FLASCHEN-TESTEINLEITUNG
| 1. | Diese Methode ist eine für Meerwasser angepasste Variante des geschlossenen Flaschen-Tests (5); sie beruht auf einem von der Europäischen Kommission organisierten und vom Dänischen Institut für Wasserqualität durchgeführten Ringtest (3). |
| 2. | Analog zur beschriebenen Schüttelmethode sind auch die Ergebnisse dieses Tests nicht als Indikatoren für eine leichte biologische Abbaubarkeit zu betrachten, sondern vielmehr zum Erhalt weiterer Informationen über die biologische Abbaubarkeit von Stoffen in der Meeresumwelt zu verwenden. |
PRINZIP DER METHODE | 3. | ⁵⁸⁵²Eine zuvor festgelegte Menge des Prüfstoffes wird im Prüfmedium in einer Konzentration von gewöhnlich 2-10 mg/l gelöst. ⁵⁸⁵³(Es können eine oder auch mehrere Konzentrationen verwendet werden.) Die Lösung wird in einer geschlossenen Flasche im Dunkeln in einem Bad mit konstanter Temperatur oder in einem Schrank bei einer auf ± 1 °C geregelten Temperatur von 15-20 °C aufbewahrt. ⁵⁸⁵⁴Wenn mit der Untersuchung Umweltbedingungen simuliert werden sollen, können die Tests auch außerhalb dieses normalen Temperaturbereichs durchgeführt werden, sofern eine geeignete Temperaturregelung gegeben ist. ⁵⁸⁵⁵Der Abbau wird über einen Zeitraum von 28 Tagen mithilfe von Sauerstoffanalysen überwacht. |
| 4. | ⁵⁸⁵⁶Der Ringtest hat gezeigt, dass durch eine Ausdehnung des Tests auf mehr als 28 Tage wegen der dann meist auftretenden erheblichen Störungen keine verwendbaren Informationen erhalten wurden. ⁵⁸⁵⁷Der biologische Sauerstoffbedarf (BSB) der Blindkontrolle war wahrscheinlich wegen des Wachstums an den Wänden (wegen fehlender Schüttelung) und aufgrund der Nitrifikation übermäßig hoch. ⁵⁸⁵⁸Daher wird eine Dauer von 28 Tagen empfohlen. ⁵⁸⁵⁹Wenn jedoch der BSB-Wert einen Anteil von 30 % nicht übersteigt (Nummern 15 und 40), kann der Test auch über einen längeren Zeitraum fortgesetzt werden. |
INFORMATIONEN ZUM PRÜFSTOFF | 5. | ⁵⁸⁶⁰Um festzustellen, ob ein Test bei einem bestimmten Stoff durchzuführen ist, müssen einige Eigenschaften des Stoffes bekannt sein. ⁵⁸⁶¹Die Summenformel wird benötigt, um den theoretischen Sauerstoffbedarf (ThSB) zu berechnen (siehe Anlage 3). ⁵⁸⁶²Ansonsten ist als Referenzwert der chemische Sauerstoffbedarf (CSB) des jeweiligen Stoffes zu bestimmen. ⁵⁸⁶³Die Verwendung des CSB ist weniger zufriedenstellend, da manche Stoffe beim CSB-Test nicht vollständig oxidieren. |
| 6. | ⁵⁸⁶⁴Die Löslichkeit des Stoffes muss mindestens bei 2 mg/l liegen, wenngleich grundsätzlich auch weniger lösliche Stoffe (z. B. unter Ultraschallbehandlung) und flüchtige Stoffe getestet werden könnten. ⁵⁸⁶⁵Informationen zur Reinheit oder zu den relativen Anteilen der Hauptkomponenten des Prüfstoffes werden benötigt, damit die Testergebnisse entsprechend interpretiert werden können. ⁵⁸⁶⁶Dies gilt insbesondere bei sehr Testergebnissen nahe am ‚Pass‘-Level. |
| 7. | ⁵⁸⁶⁷Informationen über die Toxizität des Prüfstoffes für Bakterien (beispielsweise gemessen im Kurzzeit-Atemfrequenztests (4)) können für die Wahl geeigneter Prüfkonzentrationen sehr hilfreich und für die korrekte Auswertung niedriger Abbaubarkeitswerte ausschlaggebend sein. ⁵⁸⁶⁸Diese Informationen sind jedoch nicht immer hinreichend für die Interpretation der Ergebnisse von Tests zur Prüfung der biologischen Abbaubarkeit; eher geeignet ist gegebenenfalls das in Nummer 27 beschriebene Verfahren. |
REFERENZSTOFFE | 8. | ⁵⁸⁶⁹Zur Prüfung der mikrobiologischen Aktivität der Meerwasserproben sind geeignete Referenzstoffe zu verwenden. ⁵⁸⁷⁰Geeignet sind beispielsweise Anilin, Natriumacetat und Natriumbenzoat. ⁵⁸⁷¹Diese Stoffe müssen in einer angemessen kurzen Zeitspanne zu mindestens 60 % ihres jeweiligen ThSB abgebaut werden; ansonsten sollte der Test mit einer anderen Meerwasserprobe wiederholt werden. |
| 9. | Im Ringtest der Europäischen Kommission, bei dem Meerwasserproben an unterschiedlichen Standorten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe eines Jahres genommen wurden, betrug bei Natriumbenzoat die ‚Lag‘-Phase (tL) 0-2 Tage und die Zeitdauer bis zu einem Abbau von 50 % (t50) (ohne ‚Lag‘-Phase) 1-4 Tage. Für Anilin betrugen die tL-Werte 0-7 Tage und die t50-Werte 2-12 Tage. |
REPRODUZIERBARKEIT | 10. | Die Reproduzierbarkeit der Methode wurde im Ringtest der Europäischen Kommission nachgewiesen (3). |
BESCHREIBUNG DER METHODEApparatur
| 11. | Übliche Laborausrüstung und folgende Geräte:| (a) | 250-300 ml-BSB-Flaschen mit Glasstopfen oder 250-ml-Flaschen mit engem Hals und mit Glasstopfen; |
| (b) | mehrere 2-, 3- und 4-l-Flaschen mit Literteilung zur Vorbereitung des Versuchs und zum Füllen der BSB-Flaschen; |
| (c) | Wasserbad oder Raum mit konstanter Temperatur zur Aufbewahrung der Flaschen bei einer konstanten Temperatur (± 1 °C) unter Lichtabschluss; |
| (d) | Ausrüstung zur Analyse des gelösten Sauerstoffs; |
| (e) | Membranfilter, 0,2-0,45 μm (optional); |
| (f) | Ausrüstung für spezifische Analysen (optional). |
|
Meerwasser | 12. | ⁵⁸⁷⁵Eine Meerwasserprobe wird in einem gründlich gereinigten Behältnis genommen und möglichst innerhalb von ein bis zwei Tagen nach der Entnahme ins Labor gebracht. ⁵⁸⁷⁶Während des Transports darf die Probentemperatur die Testtemperatur nicht erheblich überschreiten. |
| 13. | ⁵⁸⁷⁷Der Entnahme-Standort ist genau zu bezeichnen und hinsichtlich seines Verschmutzungsgrads und des Nährstoffgehalts zu beschreiben. ⁵⁸⁷⁸Insbesondere bei Proben aus Küstengewässern und bei verschmutzten Gewässern werden zudem die Koloniezahl heterotropher Mikroorganismen und die Konzentrationen an gelöstem Nitrat, Ammonium und Phosphat angegeben. |
| 14. | Für die eigentliche Meerwasserprobe sind folgende Informationen anzugeben:- —
- Entnahmedatum:
- —
- Tiefe der Probenahme;
- —
- Aussehen der Probe — z. B. trüb;
- —
- Temperatur zum Entnahmezeitpunkt;
- —
- Salzgehalt;
- —
- gelöster organischer Kohlenstoff (DOC = Dissolved organic Carbon);
- —
- Zeitspanne zwischen der Probenahme und der Verwendung im Test.
|
| 15. | Wenn der DOC-Gehalt der Probe zu hoch ist oder wenn vermutet wird, dass der BSB der Blindkontrolle nach 28 Tagen mehr als 30 % über dem BSB des Referenzstoffes liegt, wird vor der Verwendung eine Alterung des Meerwassers um etwa eine Woche empfohlen. |
| 16. | ⁵⁸⁸¹Die Alterung der Probe erfolgt durch Lagerung unter aeroben Bedingungen bei Testtemperatur im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung. ⁵⁸⁸²Bei Bedarf ist Sauerstoff durch mäßige Belüftung zuzuführen. ⁵⁸⁸³Bei der Alterung verringert sich der Anteil leicht abbaubaren organischen Materials. ⁵⁸⁸⁴Im Ringtest (3) wurden keine Unterschiede zwischen dem Abbaupotenzial gealterter und frisch entnommener Meerwasserproben festgestellt. |
| 17. | ⁵⁸⁸⁵Vor der Verwendung werden grobe Partikel aus dem Meerwasser abgetrennt, beispielsweise unter Filtration durch einen Nylonfilter oder ein grobes Papier (jedoch keine Membran oder GF-C-Filter) oder durch Ausfällen und Dekantieren. ⁵⁸⁸⁶Das verwendete Verfahren ist zu protokollieren. ⁵⁸⁸⁷Diese Vorbehandlung erfolgt nach der Alterung, falls verwendet. |
Stammlösungen mit mineralischen Nährstoffen | 18. | Die folgenden Stammlösungen werden mit Reagenzien in Analysequalität hergestellt:| (a) | Kaliumdihydrogenorthophosphat, KH2PO4 | 8,50 g | | Dikaliummonohydrogenorthophosphat, K2HPO4 | 21,75 g | | Dinatriummonohydrogenorthophosphat-Dihydrat, Na2HPO4.2H2O | 33,30 g | | Ammoniumchlorid, NH4Cl | 0,50 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | | | (b) | Calciumchlorid, CaCl2 | 27,50 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | | | (c) | Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO4 7H2O | 22,50 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | | | (d) | Eisen(III)chlorid-Hexahydrat, FeCl3 6H2O | 0,25 g | | In Wasser lösen und mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. | |
⁵⁸⁹²Das Ausfällen in der Lösung (d) kann verhindert werden, indem ein Tropfen konzentrierter Salzsäure oder 0,4 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Dinatriumsalz) pro Liter hinzugegeben werden. ⁵⁸⁹³Wenn es in einer Stammlösung zu einer Ausfällung kommt, ist die Lösung durch eine frisch hergestellte Lösung zu ersetzen. |
Herstellung des Prüfmediums | 19. | ⁵⁸⁹⁴Pro Liter vorbehandeltes Meerwasser wird jeweils 1 ml der oben genannten Stammlösungen hinzugegeben. ⁵⁸⁹⁵Das Prüfmedium wird mit Luft (auf Testtemperatur) gesättigt, indem es etwa 20 Minuten mit sauberer Druckluft belüftet wird. ⁵⁸⁹⁶Danach wird die Konzentration des gelösten Sauerstoffs für Kontrollzwecke ermittelt. ⁵⁸⁹⁷Die gesättigte Konzentration an gelöstem Sauerstoff in Abhängigkeit vom Salzgehalt und von der Temperatur kann dem dieser Prüfmethode beigefügten Nomogramm entnommen werden (Anlage 4). |
Inokulum | 20. | ⁵⁸⁹⁸Zusätzlich zu den bereits im Meerwasser vorhandenen Mikroorganismen darf kein spezifisches Inokulum hinzugegeben werden. ⁵⁸⁹⁹Die Anzahl der koloniebildenden Heterotrophe im Meerwasser-Prüfmedium (sowie vorzugsweise auch in der ursprünglichen Meerwasserprobe) wird beispielsweise durch Plattenzählung mit Meerwasseragar (fakultativ) bestimmt. ⁵⁹⁰⁰Dies ist insbesondere bei Proben aus Küstengewässern oder aus verschmutzten Standorten wünschenswert. ⁵⁹⁰¹Die heterotrophe mikrobiologische Aktivität des Meerwassers wird anhand eines Tests mit einem Referenzstoff geprüft. |
Ansetzen der Testflaschen | 21. | Alle erforderlichen Schritte einschließlich des Alterns und der Vorbehandlung des Meerwassers sind bei der gewählten Testtemperatur im Bereich von 15-20 °C durchzuführen; die verwendeten Glasgeräte müssen sauber sein, brauchen aber nicht sterilisiert zu werden. |
| 22. | ⁵⁹⁰³Zur Bestimmung des BSB der Prüfstoffe und der Referenzstoffe werden mehrere Gruppen von BSB-Flaschen für gleichzeitige Versuchsreihen vorbereitet. ⁵⁹⁰⁴Sämtliche Analysen sind an jeweils zwei Flaschen (Blindkontrollen, Referenzstoffe und Prüfstoffe) vorzunehmen, d. h. für jede Messung werden jeweils zwei Flaschen vorbereitet. ⁵⁹⁰⁵Die Analysen werden mindestens an den Tagen 0, 5, 15 und 28 vorgenommen (4 Messungen). ⁵⁹⁰⁶Für die Analysen des Sauerstoffbedarfs werden insgesamt 3 × 2 × 4 = 24 Flaschen (Blindprobe, Referenzstoff und Prüfstoff) und entsprechend etwa 8 l Prüfmedium (pro Konzentration des Prüfstoffes) benötigt. |
| 23. | ⁵⁹⁰⁷Von den Prüfstoffen und den Referenzstoffen werden in großen Flaschen mit hinreichendem Fassungsvermögen (siehe Nummer 11) getrennte Lösungen hergestellt, indem die Prüfstoffe bzw. die Referenzstoffe zunächst entweder direkt oder über eine konzentrierte Stammlösung in die teilweise gefüllten großen Flaschen gegeben werden. ⁵⁹⁰⁸Danach wird weiteres Prüfmedium hinzugefügt, bis die gewünschte Endkonzentration erreicht ist. ⁵⁹⁰⁹Wenn Stammlösungen der Prüfstoffe und/oder der Referenzstoffe verwendet werden, ist sicherzustellen, dass der Salzgehalt des Meerwassermediums nicht erheblich verändert wird. |
| 24. | Bei der Auswahl der Prüfstoffe und der Referenzstoffe sind die folgenden Punkte zu berücksichtigen:| (a) | die Löslichkeit des gelösten Sauerstoffs im Meerwasser bei der jeweiligen Testtemperatur und beim jeweiligen Salzgehalt (siehe beigefügtes Nomogramm, Anlage 4); |
| (b) | der BSB der Blindprobe des Meerwassers und |
| (c) | der erwartete biologische Abbau des Prüfstoffes. |
|
| 25. | ⁵⁹¹¹Bei einer Temperatur von 15 °C bzw. 20 °C und einem Salzgehalt von 32 ppm (Meerwasser) liegt die Löslichkeit des gelösten Sauerstoffs etwa bei 8,1 bzw. 7,4 mg/l. Der Sauerstoffbedarf des eigentlichen Meerwassers (Sauerstoffzehrung der Blindprobe) kann 2 mg O2/l oder mehr betragen, wenn das Meerwasser nicht gealtert ist. ⁵⁹¹²Um eine signifikante Sauerstoffkonzentration nach der Oxidation des Prüfstoffes sicherzustellen, wird bei Stoffen, bei denen (ebenso wie bei den Referenzstoffen) unter den Testbedingungen ein vollständiger Abbau erwartet wird, mit einer Ausgangskonzentration des Prüfstoffes von etwa 2-3 mg/l (je nach ThSB) begonnen. ⁵⁹¹³Weniger leicht abbaubare Stoffe werden mit höheren Konzentrationen (bis zu etwa 10 mg/l) getestet, wenn keine toxischen Wirkungen eintreten. ⁵⁹¹⁴Es kann vorteilhaft sein, Tests gleichzeitig mit einer niedrigen (ca. ⁵⁹¹⁵2 mg/l) und einer hohen (ca. ⁵⁹¹⁶10 mg/l) Konzentration des Prüfstoffesdurchzuführen. |
| 26. | Parallel muss eine Sauerstoff-Kontrolle in Flaschen geprüft werden, die weder den Prüfstoff noch einen Referenzstoff enthalten. |
| 27. | Wenn Inhibitionswirkungen festgestellt werden sollen, sind die folgenden Reihen von Lösungen in getrennten großen Flaschen herzustellen (Nummer 13):| (a) | 2 mg/l eines leicht abbaubaren Stoffs (z. B. eine der genannten Referenzstoffe); |
| (b) | x mg/l Prüfstoff (x ist gewöhnlich 2); |
| (c) | 2 mg/l leicht abbaubarer Stoff und x mg/l Prüfstoff. |
|
Physikalisch-chemische Kontrolle (optional) | 28. | ⁵⁹¹⁹Wenn spezifische Analysen durchgeführt werden sollen, kann mit einem physikalisch-chemischen Versuch geprüft werden, ob der Prüfstoff durch abiotische Prozesse (z. B. Hydrolyse oder Adsorption) abgebaut wird. Ein physikalisch-chemischer Kontrolltest kann durchgeführt werden durch Zugabe von Quecksilber(II)-chlorid (HgCl2) (50-100 mg/l) zu zwei Gefäßen mit dem Prüfstoff, um das Wachstum von Mikroorganismen zu unterbinden. ⁵⁹²⁰Ein signifikanter Rückgang der Konzentration des spezifischen Stoffs im Laufe des Tests ist Anzeichen für die Wirkung abiotischer Abbaumechanismen. |
Anzahl der BSB-Flaschen bei einem typischen Testdurchlauf | 29. | Bei einem typischen Test werden die folgenden Flaschen verwendet:- —
- mindestens 8 Flaschen mit des Prüfstoffs,
- —
- mindestens 8 Flaschen mit Meerwasser, das nur mit Nährstoffen angereichert wurde,
- —
- mindestens 8 Flaschen mit dem Referenzstoff und (erforderlichenfalls)
- —
- 6 Flaschen mit Prüfstoffen und Referenzstoffen (zur Toxizitätskontrolle).
|
VERFAHREN | 30. | Nach der Herstellung werden die einzelnen Lösungen umgehend aus dem unteren Viertel (aber nicht ganz vom Boden) der jeweiligen großen Flasche abgesaugt, um die entsprechende Gruppe von BSB-Flaschen zu füllen. Unmittelbar danach wird der Anteil des gelösten Sauerstoffs in den Null-Kontrollen (d. h. den Kontrollen zum Zeitpunkt 0) geprüft (Nummer 33), oder die Kontrollen werden für eine spätere chemische Analyse durch Ausfällung mit MnCl2 (Mangan(II)-chlorid) und NaOH (Natriumhydroxid) aufbewahrt. |
| 31. | Die übrigen parallelen BSB-Flaschen werden bei Testtemperatur (15-20 °C) im Dunkeln inkubiert; in regelmäßigen Zeitabständen werden sie aus dem Inkubationsbereich genommen (mindestens z. B. nach 5, 15 und 28 Tagen) und auf den Anteil an gelöstem Sauerstoff geprüft (Nummer 33). |
| 32. | ⁵⁹²⁴Die Proben werden einer Membranfilteration (0,2-0,45 μm) unterzogen oder 15 Minuten lang zentrifugiert, um spezifische Analysen durchzuführen (optional). ⁵⁹²⁵Werden die Analysen nicht unmittelbar danach durchgeführt, sind die gefilterten oder zentrifugierten Proben bis zu 48 Stunden bei 2-4 °C oder über längere Zeiträume bei – 18 °C aufzubewahren. (Wenn bekannt ist, dass der Prüfstoff dadurch nicht beeinträchtigt wird, wird die Probe vor der Lagerung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt.) |
Bestimmung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs | 33. | Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wird mit einer national oder international anerkannten chemischen oder elektrochemischen Methode ermittelt. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 34. | Die Analyseergebnisse werden auf den beigefügten Datenblättern protokolliert (Anlage 5). |
| 35. | ⁵⁹²⁸Der BSB wird als Unterschied zwischen dem Sauerstoffabbau einer Blindprobe und einer Lösung des Prüfstoffs unter den Testbedingungen ermittelt. ⁵⁹²⁹Der Nettoabbau des Sauerstoffs wird durch die Konzentration (w/w) des jeweiligen Stoffs geteilt, um den BSB als mg BSB/mg Prüfsubstanz auszudrücken. ⁵⁹³⁰Als Abbau wird das Verhältnis des biochemischen Sauerstoffbedarfs entweder (vorzugsweise) zum theoretischen Sauerstoffbedarf (ThSB) oder zum chemischen Sauerstoffbedarf (CSD) in Prozent bezeichnet (siehe Nummer 36). |
| 36. | Der biologische Abbau wird für die Prüfstoffe und die Referenzstoffe bezogen auf die einzelnen Zeitpunkte der Probenahme mit einer der folgenden Gleichungen ermittelt:
Dabei sind:
| ThSB | = | theoretischer Sauerstoffbedarf (Berechnung, Anlage 3) | | CSB | = | chemischer Sauerstoffbedarf; experimentell zu bestimmen |
Hinweis: Manchmal führen die zwei Berechnungsmethoden (prozentualer ThSB oder prozentualer CSB) zu unterschiedlichen Ergebnissen. In diesen Fällen ist vorzugsweise vom ThSB auszugehen, da manche Stoffe im CSB-Test nicht vollständig oxidiert werden. |
| 37. | Der Verlauf des Tests zum biologischen Abbau wird grafisch dargestellt (siehe z. B. Abbildung ‚Validität und Interpretation der Ergebnisse‘). Wenn hinreichende Daten vorliegen, werden aus der Kurve die ‚Lag‘-Phase (tL) und der Zeitpunkt berechnet, zu dem seit dem Ende der ‚Lag‘-Phase ein Abbau um 50 % erreicht ist (t50). |
| 38. | Wenn spezifische Analysen durchgeführt werden (optional), ist der prozentuale primäre Abbau als Prozentanteil des Abbaus eines spezifischen Stoffs während der Prüfdauer (bereinigt um Blindproben) anzugeben. |
Prüfbericht | 39. | Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: | Prüfstoff:- —
- physikalischer Zustand und, soweit relevant, physikalisch-chemische Eigenschaften.
- —
- Kenndaten;
|
| Prüfbedingungen:- —
- Lage und Beschreibung des Standorts der Probenahme; Verschmutzungsgrad und Nährstoffgehalt (ggf. Koloniezahl, Nitrat, Ammonium, Phosphat);
- —
- Merkmale der Probe (Datum der Probenahme, Tiefe, Aussehen, Temperatur, Salzgehalt, DOC (optional), Zeitraum zwischen Probenahme und Verwendung im Test;
- —
- verwendete Methode (ggf.) zur Alterung des Meerwassers;
- —
- Methode zur Vorbehandlung (Filtration/Sedimentation) des Meerwassers;
- —
- Methode zur CSB-Bestimmung (wenn durchgeführt);
- —
- Methode für die Sauerstoffmessungen;
- —
- Verfahren zur Dispergierung von unter den Testbedingungen schlecht löslichen Stoffen;
- —
- Methode zur Bestimmung der Anzahl der Heterotrophen im Meerwasser (Plattenzählung oder alternatives Verfahren);
- —
- Methode zur Bestimmung des Meerwasser-DOC (optional);
- —
- Ausrüstung für spezifische Analysen (optional);
- —
- sonstige optionale Methoden zur Beschreibung des Meerwassers (ATP-Messungen usw.).
|
| Ergebnisse:- —
- auf einem Datenblatt eingetragene Analysedaten (beigefügt, Anlage 5);
- —
- der Verlauf des Abbautests wird in einem Diagramm dargestellt, aus dem die ‚Lag‘-Phase (tL), die Steigung und die Dauer (ab dem Ende der ‚Lag‘-Phase) bis zu einem Anteil von 50 % der durch die Oxidation des Prüfstoffes bewirkten endgültigen Sauerstoffzehrung (t50) hervorgehen. Die ‚Lag‘-Phase kann aufgrund der grafischen Darstellung (in der beigefügten Abbildung) abgeschätzt werden oder einfach aufgrund des Zeitbedarfs für einen Abbau um 10 % ermittelt werden;
- —
- prozentualer Abbau, gemessen nach 28 Tagen.
|
| Diskussion der Ergebnisse. |
|
Validität und Interpretation der Ergebnisse | 40. | ⁵⁹⁴⁰Die Sauerstoffzehrung der Blindprobe muss sich auf 30 % des Sauerstoffs in der Testflasche beschränken. ⁵⁹⁴¹Wenn dieses Kriterium mit frisch entnommenem Meerwasser nicht erfüllt werden kann, muss das Meerwasser vor der Verwendung altern (stabilisiert werden). |
| 41. | Zu berücksichtigen ist, dass stickstoffhaltige Stoffe die Ergebnisse beeinträchtigen können. |
| 42. | ⁵⁹⁴³Mit den Referenzstoffen Natriumbenzoat und Anilin ermittelte Ergebnisse müssen mit den Ergebnissen des Ringtests (3) (Nummer 9) vergleichbar sein. ⁵⁹⁴⁴Wenn mit Referenzstoffen untypische Ergebnisse ermittelt werden, ist der Test mit einer anderen Meerwasserprobe zu wiederholen. |
| 43. | Es kann davon ausgegangen werden, dass der Prüfstoff das Bakterienwachstum (bei der verwendeten Konzentration) hemmt, wenn der BSB des Referenzstoffs und des Prüfstoffes geringer ist als die Summe der BSB-Werte der getrennten Lösungen der beiden Stoffe. |
| 44. | ⁵⁹⁴⁶Wegen der verhältnismäßig hohen Prüfkonzentrationen im Vergleich zu den meisten natürlichen Systemen (und entsprechend einem ungünstigen Verhältnis zwischen den Konzentrationen des Prüfstoffes und sonstiger Kohlenstoffquellen) wird diese Methode als Vorversuch betrachtet, mit dem ermittelt werden kann, ob ein Stoff grundsätzlich leicht biologisch abbaubar ist. ⁵⁹⁴⁷Ein niedriges Ergebnis bedeutet entsprechend nicht unbedingt, dass der Prüfstoff in der Meeresumwelt nicht biologisch abbaubar wäre, sondern ist Anzeichen dafür, dass zur Klärung weitere Arbeiten durchgeführt werden müssen.In der folgenden Abbildung ist ein Beispiel zur Ermittlung des theoretischen Abbaus als Möglichkeit zur Abschätzung von tL (Dauer der ‚Lag‘-Phase) und t50 (Zeitdauer ab tL bis zu einem Anteil von 50 % der endgültigen Sauerstoffzehrung infolge der Oxidation des Prüfstoffs) dargestellt:
|
LITERATUR | (1) | de Kreuk J.F., und Hanstveit A.O. (1981). ⁵⁹⁴⁹Determination of the biodegradability of the organic fraction of chemical wastes. ⁵⁹⁵⁰Chemosphere, 10 (6); 561-573. |
| (2) | Kapitel C.4-B in diesem Anhang: Bestimmung der ‚leichten‘ biologischen Abbaubarkeit, Teil III, Modifizierter OECD-Screening-Test. |
| (3) | Nyholm N., und Kristensen P. (1987). ⁵⁹⁵³Screening Test Methods for Assessment of Biodegradability of Chemical Substances in Seawater. ⁵⁹⁵⁴Final Report of the ring test programme 1984-1985, März 1987, Kommission der Europäischen Gemeinschaften. |
| (4) | Kapitel C.11 in diesem Anhang: Biologische Abbaubarkeit — Belebtschlamm-Atmungshemmungstest |
| (5) | Kapitel C.4-E in diesem Anhang: Bestimmung der ‚leichten‘ biologischen Abbaubarkeit, Teil IV: Geschlossener Flaschen-Test. |
Anlage 1Bestimmung des Gehalts an organischem Kohlenstoff in Meerwasser
SCHÜTTELMETHODE
Zur Ermittlung des Anteils an organischem Kohlenstoff in einer Wasserprobe werden die organischen Bestandteile der Probe mit einem der folgenden Verfahren zu Kohlendioxid oxidiert:
- —
- Nassoxidation durch Persulfat/UV-Bestrahlung;
- —
- Nassoxidation durch Persulfat/höhere Temperatur (116-130 °C);
- —
- Verbrennung.
⁵⁹⁵⁷Die Menge des entstandenen CO2 wird durch Infrarotspektrometrie oder Titrimetrie ermittelt. ⁵⁹⁵⁸Alternativ wird das CO2 zu Methan reduziert; dieses wird auf einem Flammenionisations-Detektor (FID) quantifiziert.Die Methode mit Persulfat/UV-Bestrahlung ist bei der Analyse von ‚sauberem‘ Wasser mit geringem Partikelgehalt allgemein üblich. Die beiden letztgenannten Methoden können bei den meisten Wasserproben angewendet werden; die Methode der Oxidation mit Persulfat und einer höheren Temperatur ist besonders für Proben mit niedriger Konzentration geeignet, und die Verbrennung empfiehlt sich für Verfahren mit nicht flüchtigen organischen Kohlenstoffen (NVOC = Non-Volatile Organic Carbon) in einer Konzentration von deutlich über 1 mg C/l.
Störungen
Bei allen drei Verfahren muss in den Proben vorhandener anorganischer Kohlenstoff entfernt oder kompensiert werden. Die für die Entfernung von anorganischem Kohlenstoff am häufigsten verwendete Methode ist die Ausschleusung von CO2, auch wenn dabei flüchtige organische Verbindungen verloren gehen (1). Die vollständige Entfernung oder Kompensation des anorganischen Kohlenstoffs ist für jede einzelne Probenmatrix sicherzustellen; je nach Probentyp muss zusätzlich zum NVOC der Anteil an flüchtigem Kohlenstoff (VOC = Volatile Organic Carbon) bestimmt werden.
⁵⁹⁶¹Bei Verwendung der Persulfat-/UV-Methode (2) führen hohe Chloridkonzentrationen zu einer Verringerung der Oxidationseffizienz. ⁵⁹⁶²Mit einem durch Zusatz von Quecksilber-(II)-nitrat modifizierten Oxidationsreagens kann diese Störung jedoch verhindert werden. ⁵⁹⁶³Es wird empfohlen, dass zur Untersuchung der verschiedenen Typen chloridhaltiger Proben das maximal zulässige Probenvolumen verwendet wird. ⁵⁹⁶⁴Hohe Salzkonzentrationen der mit der Verbrennungsmethode analysierten Proben können zur Bildung einer Salzschicht auf dem Katalysator und zu übermäßiger Korrosion des Verbrennungsrohrs führen. ⁵⁹⁶⁵Daher sind die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen gemäß den Herstelleranweisungen (Handbuch) zu treffen.
Stark getrübte Proben sowie Proben mit Partikelmaterial können mit der Persulfat-/UV-Methode unter Umständen nicht vollständig oxidieren.
Beispiel einer geeigneten Methode
Der Anteil an nicht flüchtigem organischem Kohlenstoff wird durch Oxidation mit Persulfat/UV-Bestrahlung und anschließende Quantifizierung des entstandenen CO2 durch nichtdispersive Infrarotspektronomie ermittelt.
Das Oxidationsreagens wird nach den Vorschlägen in (2) und gemäß den Herstelleranweisungen modifiziert:
- a)
- 8,2 g HgCl2 und 9,6 g Hg(NO3)2.H2O werden in mehreren Hundert Millilitern Reagenzwasser mit niedriger Kohlenstoffkonzentration gelöst.
- b)
- 20 g K2S2O8 werden in Quecksilbersalzlösung gelöst.
- c)
- 5 ml HNO3 (konz.) werden zum Gemisch hinzugegeben.
- d)
- Das Reagens wird auf 1 000 ml verdünnt.
⁵⁹⁷²Die Störung durch das Chlorid wird unterbunden, indem für 10 %iges Chlorid ein Probenvolumen von 40 μl und für 1,9 %iges Chlorid ein Probenvolumen von 200 μl verwendet wird. ⁵⁹⁷³Proben mit hohen Chloridkonzentrationen und/oder größere Probenvolumina können mit dieser Methode analysiert werden, wenn eine Chloridakkumulation im Oxidationsgefäß verhindert wird. ⁵⁹⁷⁴Anschließend kann (wenn für den betreffenden Probentyp von Bedeutung) der Anteil an flüchtigem organischem Kohlenstoff ermittelt werden.LITERATUR
| (1) | ISO, Water quality — determination of total organic carbon. Draft International Standard ISO/DIS 8245, 16. Januar 1986. |
| (2) | American Public Health Association, Standard Methods for the Estimation of Water and Wastewater. American Water Works Association & Water Pollution Control Federation, 16th edition, 1985.Ebenfalls von Interesse (Beschreibung eines automatischen Analysesystems):
|
| (3) | Schreurs W. (1978). An automated colorimetric method for the determination of dissolved organic carbon in seawater by UV destruction. Hydrobiological Bulletin 12, 137-142. |
Anlage 2Biologischer abbau in Meerwasser
SCHÜTTELMETHODE
DATENBLATT
| 3. | PRÜFSTOFF:Name:| Konzentration der Stammlösung: | mg/l als Stoff | | Ausgangskonzentration im Medium, to: | mg/l als Stoff | | : | mg DOC/l |
|
| 4. | MEERWASSER:Herkunft:Entnahmedatum:
Tiefe der Probenahme:
Aussehen zum Entnahmezeitpunkt (z. B. trüb):
| Salzgehalt bei Entnahme: | ‰ | | Temperatur bei Entnahme: | °C | | DOC ‚x‘ Stunden nach der Entnahme: | mg/l |
Vorbehandlung vor dem Test (Filtration, Sedimentation, Alterung usw.):| Mikrobenkoloniezahl | | Kolonien/ml | | | Kolonien/ml | | Sonstige Merkmale: | | |
|
| 5. | ERMITTLUNG DES KOHLENSTOFFGEHALTS:Kohlenstoffanalysator: | Kolben Nr. | | DOC nach n Tagen (mg/l) | | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | | Test: mit Nährstoffen angereichertes Meerwasser mit Prüfstoff | 1 | a1 | | | | | | | a2 | | | | | | | mittlere Ca(t) | | | | | | | 2 | b1 | | | | | | | b2 | | | | | | | mittlere Cb(t) | | | | | | | Blindprobe: mit Nährstoffen angereichertes Meerwasser ohne Prüfstoff | 1 | c1 | | | | | | | c2 | | | | | | | mittlere Cc(t) | | | | | | | 2 | d1 | | | | | | | d2 | | | | | | | mittlere Cd(t) | | | | | | mittlere | | | | | | | | | | |
|
| 6. | EVALUIERUNG DER ROHDATEN:| Kolben Nr. | Berechnung der Ergebnisse: | % Abbau nach n Tagen | | 0 | n1 | n2 | n3 | nx | | 1 |  | 0 | | | | | | 2 |  | 0 | | | | | | Mittelwert |  | 0 | | | | |
| Hinweis: | Ähnliche Formate können bei Durchführung einer spezifischen Analyse sowie für die Referenzstoffe und für Toxizitätskontrollen verwendet werden. |
|
| 7. | ABIOTISCHER ABBAU (optional) | Zeit (Tage) | | 0 | T | | Konzentration DOC (mg/l) in steriler Kontrolle | Cs(o) | Cs(t) |
 |
Anlage 3Berechnung des theoretischen biochemischen Sauerstoffbedarfs
GESCHLOSSENER FLASCHEN-TEST
Der ThSB des Stoffs CcHhClclNnNanaOoPpSs mit der Molekülmasse MW wird wie folgt berechnet:
Diese Berechnung geht davon aus, dass C in CO2, H in H2O, P in P2O5 und Na in Na2O umgewandelt wird. Halogene werden zu Halogenwasserstoff und Stickstoff zu Ammoniak abgebaut.
Beispiel:
Glucose C6H12O6, MW = 180
Die Molekülmassen von Salzen (mit Ausnahme der Alkalimetalle) werden unter der Annahme berechnet, dass die Salze durch Hydrolyse aufgelöst wurden.
Es wird angenommen, dass Schwefel bis auf Stufe +6 oxidiert wurde.
Beispiel:
Natrium n-dodecylbenzolsulfonat C18H29SO3Na, MW = 348
Bei stickstoffhaltigen Stoffen kann der Stickstoff entsprechend dem jeweiligen theoretischen biochemischen Sauerstoffbedarf zu Ammoniak, Nitrit oder Nitrat abgebaut werden.
Annahme: Bei einem sekundären Amin wurde durch Analyse eine vollständige Nitratbildung festgestellt:
(C12H25)2 NH, MW = 353
Anlage 4
 Anlage 5Biologischer Abbau in Meerwasser
GESCHLOSSENER FLASCHEN-TEST
DATENBLATT
| 3. | PRÜFSTOFF:Name:| Konzentration der Stammlösung: | mg/l | | Ausgangskonz. in Meerwassermedium: | mg/l | | ThSB oder CSB: | mg O2/mg Prüfstoff |
|
| 4. | MEERWASSER:Herkunft:Entnahmedatum:
Tiefe der Probenahme:
Aussehen zum Entnahmezeitpunkt (z. B. trüb):
| Salzgehalt bei Entnahme: | ‰ | | Temperatur bei Entnahme: | °C | | DOC ‚x‘ Stunden nach der Entnahme: | mg/l |
Vorbehandlung vor dem Test (Filtration, Sedimentation, Alterung usw.):| Mikrobenkoloniezahl | | Kolonien/ml | | | Kolonien/ml | | Sonstige Merkmale: | | |
|
| 5. | PRÜFMEDIUM:| Temperatur nach Belüftung: | °C | | O2-Konzentration nach Belüftung und Stand vor Beginn des Tests: | mg O2/l |
|
| 6. | BESTIMMUNG DES GELÖSTEN SAUERSTOFFS:Methode: Winkler/Elektrode | Kolben Nr. | | mg O2/l nach n Tagen | | 0 | 5 | 15 | 28 | | Test: Nährstoff angereichertes Meerwasser mit Prüfstoff | 1 | a1 | | | | | | 2 | a2 | | | | | | Mittelwert Blindkontrolle |  | | | | | | Blindprobe: Nährstoff — angereichertes Meerwasser ohne Prüfstoff | 1 | c1 | | | | | | 2 | c2 | | | | | | Mittelwert Test |  | | | | |
Hinweis: Ein ähnliches Format kann für den Referenzstoff und für die Toxizitätskontrollen verwendet werden. |
| 7. | ABBAU DES GELÖSTEN SAUERSTOFFS (DO): PROZENTUALER ABBAU ( % D): | DO-Abbau nach n Tagen | | 5 | 15 | 28 | | mb – mt) | | | |  | | | |
|
C.43. ANAEROBE BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT ORGANISCHER STOFFE IN FAULSCHLAMM: BESTIMMUNG DURCH MESSUNG DER GASPRODUKTIONEINLEITUNG
| 1. | ⁵⁹⁸⁸Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 311 (2006). ⁵⁹⁸⁹Es gibt eine Reihe von Screening-Tests zur Bewertung der aeroben biologischen Abbaubarkeit organischer Stoffe (Prüfmethoden C.4, C.9, C.10 und C.11 (1) und OECD-Prüfrichtlinie TG 302C (2)). ⁵⁹⁹⁰Die Ergebnisse dieser Tests konnten erfolgreich zur Vorhersage des Verhaltens von Chemikalien in der aeroben Umwelt, insbesondere in den aeroben Stufen der Abwasserbehandlung, verwendet werden. ⁵⁹⁹¹Verschiedene Anteile von wasserunlöslichen Chemikalien, sowie jene Stoffanteile, die an Feststoffe gebunden sind, werden aerob umgewandelt. ⁵⁹⁹²Der größere Anteil dieser Stoffe wird jedoch an den primär ausgefällten Schlamm gebunden, der in den Absetzbecken vom Rohabwasser getrennt wird, bevor der abgesetzte Schlamm bzw. der Überstand aerob umgewandelt wird. ⁵⁹⁹³Der Schlamm, der einige der löslichen Stoffe im Porenwasser enthält, wird dann zur anaeroben Umwandlung in die beheizten Faulbehälter geführt. ⁵⁹⁹⁴Bislang gibt es in dieser Reihe noch keine Tests zur Bewertung der anaeroben biologischen Abbaubarkeit in anaeroben Faulbehältern; der hier beschriebene Test soll diese Lücke schließen. ⁵⁹⁹⁵Der Test ist nicht zwangsläufig auf andere, anoxische Umweltkompartimente übertragbar. |
| 2. | ⁵⁹⁹⁶Respirometrische Verfahren zur Messung der Mengen an produzierten Gasen — vorwiegend Methan (CH4) und Kohlendioxid (CO2) unter anaeroben Bedingungen — wurden erfolgreich zur Bewertung der anaeroben biologischen Abbaubarkeit eingesetzt. ⁵⁹⁹⁷Birch et al. ⁵⁹⁹⁸(3) haben diese Verfahren untersucht und bezeichnen die auf früheren Studien (5)(6)(7) beruhende Arbeit von Shelton und Tiedje (4) als die umfassendste Untersuchung. Die von anderen (8) weiterentwickelte Methode (4) hat sich in den USA als Standard etabliert (9)(10); mit dieser Methode wurden die Probleme im Zusammenhang mit den unterschiedlichen Löslichkeiten von CO2 und CH4 im Prüfmedium und in Verbindung mit der Berechnung der theoretischen Gasproduktion eines Prüfstoffs aber nicht gelöst. Im ECETOC-Bericht (3) wurde die zusätzliche Messung des gelösten anorganischen Kohlenstoffs (DIC = Dissolved Inorganic Carbon) im flüssigen Überstand empfohlen; dadurch wurde das Verfahren in größerem Umfang einsetzbar. ⁵⁹⁹⁹Die ECETOC-Methode wurde einer internationalen Kalibrierungsuntersuchung (einem Ringtest) unterzogen und zur ISO-Norm 11734 entwickelt (11). |
| 3. | ⁶⁰⁰⁰Die hier beschriebene Prüfmethode beruht auf ISO 11734 (11) und beschreibt ein Screeningverfahren zur Bewertung der potenziellen anaeroben biologischen Abbaubarkeit organischer Stoffe unter bestimmten Gegebenheiten (d. h. in einem anaeroben Faulbehälter zu einem bestimmten Zeitpunkt und mit verschiedenen Konzentrationen von Mikroorganismen). ⁶⁰⁰¹Da ein verdünnter Schlamm mit verhältnismäßig hoher Konzentration des Prüfstoffes verwendet wird und da die Prüfdauer in der Regel nicht mit der Retentionszeit in anaeroben Faulbehältern übereinstimmt, decken sich die Prüfbedingungen nicht unbedingt mit den Bedingungen in anaeroben Faulbehältern; außerdem kann die Prüfung nicht zur Beurteilung der anaeroben biologischen Abbaubarkeit organischer Stoffe unter verschiedenen Umweltbedingungen verwendet werden. ⁶⁰⁰²Der Schlamm wird dem Prüfstoff bis zu 60 Tage lang ausgesetzt; dieser Zeitraum ist länger als die normale Rententionszeit des Schlamms (25-30 Tage) in anaeroben Faulbehältern; in Industrieanlagen können die Rententionszeiten unter Umständen allerdings erheblich länger sein. ⁶⁰⁰³Die Prognosen aufgrund der Ergebnisse dieser Prüfung sind weniger zuverlässig als beim aeroben biologischen Abbau, denn die Hinweise, die über das Verhalten von Prüfstoffen in Tests zur ‚leichten‘ biologischen Abbaubarkeit und in Simulationstests sowie in der aeroben Umwelt gewonnen wurden, reichen aus, um von einem Zusammenhang ausgehen zu können. ⁶⁰⁰⁴Für die anaeroben Umweltbedingungen liegen wenig vergleichbare Erfahrungen vor. ⁶⁰⁰⁵Ein vollständiger anaerober biologischer Abbau kann als erfolgt betrachtet werden, wenn 75-80 % der theoretischen Gasproduktion erreicht sind. ⁶⁰⁰⁶Aufgrund der hohen Konzentrationen des Prüfstoffs im Vergleich zur Biomasse in diesen Prüfungen kann davon ausgegangen werden, dass ein Stoff, der als aerob abbaubar eingestuft wird, eher auch in einem anaeroben Faulbehälter abgebaut wird. ⁶⁰⁰⁷Wenn Stoffe im Test nicht zu Gas umgewandelt werden, sind diese nicht zwangsläufig auch bei realistischeren Umweltbedingungen (Konzentration Stoff: Biomasse) persistent. ⁶⁰⁰⁸Außerdem kommt es zu weiteren anaeroben Reaktionen, durch die Stoffe mindestens teilweise abgebaut werden können (z. B. durch Dechlorierung); diese Reaktionen werden mit diesem Test aber nicht nachgewiesen. ⁶⁰⁰⁹Mit spezifischen Analysemethoden zum Nachweis des Prüfstoffs kann auch ihr Verschwinden überwacht werden (siehe Nummern 6, 30, 44 und 53). |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 4. | ⁶⁰¹⁰Gewaschener Faulschlamm mit niedrigen (< 10 mg/l) Konzentrationen an anorganischem Kohlenstoff (IC, inorganic carbon) wird etwa zehnfach auf eine Feststoffkonzentration von insgesamt 1-3 g/l verdünnt und bis zu 60 Tage bei 35 °C ± 2 °C in verschlossenen Gefäßen mit dem Prüfstoff in einer Konzentration von 20-100 mg C/l inkubiert. ⁶⁰¹¹Um die Aktivität des Schlamms zu berücksichtigen, werden parallel Blindkontrollen mit einem Schlamm-Inokulum (aber ohne den Prüfstoff) im Medium geprüft. |
| 5. | ⁶⁰¹²Der durch die Kohlendioxid- und Methanproduktion verursachte Druckanstieg im Gasraum (headspace) der Prüfgefäße wird gemessen. Das erzeugte CO2 wird unter Prüfbedingungen zu einem erheblichen Teil in der flüssigen Phase gelöst oder in Karbonat oder Hydrogencarbonat umgewandelt. ⁶⁰¹³Dieser Anteil an anorganischem Kohlenstoff wird am Ende der Prüfung gemessen. |
| 6. | ⁶⁰¹⁴Der Kohlenstoffanteil (anorganisch und Methan) infolge des biologischen Abbaus des Prüfstoffs wird aus der Netto-Gasproduktion und der Netto-Produktion an anorganischem Kohlenstoff in der flüssigen Phase berechnet, die über die Produktion in der Blindkontrolle hinausgeht. ⁶⁰¹⁵Der Umfang des biologischen Abbaus wird aus dem insgesamt produzierten anorganischen Kohlenstoff und dem Methan-C als Prozentanteil des gemessenen oder berechneten Anteils des als Prüfstoff hinzugefügten Kohlenstoffs ermittelt. ⁶⁰¹⁶Der Verlauf des biologischen Abbaus kann durch Zwischenmessungen der Gasproduktion allein gemessen werden. ⁶⁰¹⁷Außerdem kann durch spezifische Analysen zu Beginn und am Ende der Prüfung der biologische Primärabbau ermittelt werden. |
INFORMATIONEN ZUM PRÜFSTOFF | 7. | ⁶⁰¹⁸Die Reinheit, Wasserlöslichkeit, Flüchtigkeit und das Adsorptionsverhalten des Prüfstoffs müssen bekannt sein, damit die Ergebnisse korrekt ausgewertet werden können. ⁶⁰¹⁹Der Gehalt des Prüfstoffs an organischem Kohlenstoff ( % w/w) muss entweder aufgrund ihrer chemischen Struktur oder aus Messungen bekannt sein. ⁶⁰²⁰Bei flüchtigen Prüfstoffen bietet die gemessene oder berechnete Henry-Konstante einen Anhaltspunkt dafür, ob die Prüfung geeignet ist. ⁶⁰²¹Angaben über die Toxizität des Prüfstoffs gegenüber anaeroben Bakterien sind wichtig für die Auswahl einer geeigneten Prüfkonzentration und die Interpretationg der Ergebnisse bei einem geringen Abbau. ⁶⁰²²Es wird empfohlen, eine Hemmkontrolle vorzusehen, außer wenn bekannt ist, dass der Prüfstoff keine Hemmung der Aktivität anaerober Mikroorganismen bewirkt (siehe Nummer 21 und ISO 13641-1 (12)). |
ANWENDBARKEIT DER PRÜFMETHODE | 8. | ⁶⁰²³Die Prüfmethode kann bei wasserlöslichen Stoffen angewendet werden. ⁶⁰²⁴Bei schlecht löslichen und nicht löslichen Stoffen ist sie anwendbar, wenn eine Methode mit exakter Dosierung verwendet wird (siehe z. B. ISO 10634 (13)). ⁶⁰²⁵Generell ist bei flüchtigen Stoffen im Einzelfall zu entscheiden. ⁶⁰²⁶Beispielsweise müssen besondere Schritte eingeleitet werden, damit während der Prüfung kein Gas freigesetzt wird. |
REFERENZSTOFFE | 9. | ⁶⁰²⁷Um das Verfahren zu überprüfen, wird ein Referenzstoff getestet; dazu werden im Rahmen der normalen Testdurchläufe parallel geeignete Gefäße bereitgestellt. ⁶⁰²⁸Beispiele sind etwa Phenol, Natriumbenzoat und Polyethylenglykol 400; bei diesen Stoffen ist innerhalb von 60 Tagen ein Abbau um mehr als 60 % der theoretischen Gasproduktion (d.h. Methan und anorganischer Kohlenstoff) zu erwarten (3)(14). |
REPRODUZIERBARKEIT VON PRÜFERGEBNISSEN | 10. | ⁶⁰²⁹In einem internationalen Ringtest (14) wurde eine gute Reproduzierbarkeit bei den Messungen des Gasdrucks in drei Replikaten festgestellt. ⁶⁰³⁰Die relative Standardabweichung (Variationskoeffizient) lag überwiegend unter 20 %; allerdings stieg dieser Wert in Verbindung mit toxischen Stoffen sowie gegen Ende der 60-tägigen Inkubationsdauer häufig auf über 20 %. ⁶⁰³¹Stärkere Abweichungen wurden auch bei Gefäßen mit einem Fassungsvermögen von < 150 ml festgestellt. ⁶⁰³²Die endgültigen pH-Werte der Prüfmedien lagen zwischen 6,5 und 7,0. |
| 11. | Im Ringtest wurden folgende Ergebnisse ermittelt:| Prüfstoff | Daten insg.n1
| Mittlerer Abbau(bezogen auf die Gesamtdaten)
(%)
| Relative Standardabweichung(bezogen auf die Gesamtdaten)
(%)
| Valide Datenn2
| Mittlerer Abbau(aus validen Daten)
(%)
| Relative Standardabweichung(aus validen Daten)
(%)
| Daten > 60 % Abbau in validen Testsn3
| | Palmitinsäure | 36 | 68,7 + 30,7 | 45 | 27 | 72,2 + 18,8 | 26 | 19 = 70 % | | Polyethylen Glycol 400 | 38 | 79,8 + 28,0 | 35 | 29 | 77,7 + 17,8 | 23 | 24 = 83 % (37) |
|
| 12. | ⁶⁰³⁴Die Variationskoeffizienten des Mittelwerts aller mit Palmitinsäure und Polyethylenglykol 400 ermittelten Werte lagen bei 45 % (n = 36) bzw. 35 % (n = 38). ⁶⁰³⁵Wenn Werte von < 40 % und > 100 % weggelassen werden (wobei erstere auf suboptimale Bedingungen und letztere auf unbekannte Gründe zurückgeführt wurden), reduzierten sich die Variationskoeffizienten auf 26 % bzw. 23 %. ⁶⁰³⁶Die Anteile ‚valider‘ Werte (Abbau von mindestens 60 %) betrugen 70 % bei Palmitinsäure und 83 % bei Polyethylenglykol 400. ⁶⁰³⁷Der prozentuale biologische Abbau, der aus dem Anteil an gelöstem anorganischem Kohlenstoff (DIC) ermittelt wurde, war verhältnismäßig gering, aber variabel. ⁶⁰³⁸Bei Palmitinsäure bewegte der Wert sich zwischen 0-35 % (Mittelwert 12 %) bei einem Variationskoeffizienten von 92 %; für Polyethyleneglykol 400 wurden 0-40 % (Mittelwert 24 %) bei einem Variationskoeffizienten von 54 % ermittelt. |
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODEApparatur
| 13. | Benötigt werden die übliche Laborausrüstung sowie die folgenden Geräte und Hilfsmittel:- a.
- Inkubator — funkensicher und auf 35 °C ± 2 °C geregelt
- b.
- Druckbeständige Glasgefäße mit geeigneter Nenngröße jeweils mit einem gasdichten Septum, das bis zu etwa 2 bar druckbeständig ist; das Volumen des Gasraums (Headspace) muss etwa 10-30 % des Gesamtvolumens betragen. ⁶⁰⁴⁰Wenn regelmäßig Biogas freigesetzt wird, sind ca. ⁶⁰⁴¹10 % Gasraum (Headspace) angemessen. ⁶⁰⁴²Wird das Gas aber erst am Ende des Tests freigesetzt, werden 30 % benötigt. Wenn bei jeder Probenahme der Druck abgebaut wird, sind gläserne Serumflaschen mit einem nominellen Inhalt von 125 ml, einem tatsächlichen Volumen von etwa 160 ml, mit Serumseptum und gepressten Aluminiumringen zu empfehlen;
- c.
- Druckmesser, angepasst zur Messung und zum Ablassen des erzeugten Gases, beispielsweise ein handgeführter Präzisionsdruckmesser, der mit einer geeigneten Spritzennadel verbunden wurde; ein gasdichtes 3-Wege-Ventil erleichtert das Ablassen des überschüssigen Drucks (Anlage 1). Das Innenvolumen der Leitung und des Ventils des Druckaufnehmers muss möglichst gering sein, damit Fehler infolge der Vernachlässigung des Volumens der Ausrüstung nicht erheblich ins Gewicht fallen;Hinweis — Die Druckwerte werden direkt zur Berechnung des erzeugten Kohlenstoffs im Gasraum verwendet (Nummern 42-44). ⁶⁰⁴³Alternativ können aus den angezeigten Druckwerten mithilfe eines Umrechnungsdiagramms die Volumina des (bei 35 °C, Atmosphärendruck) erzeugten Gases ermittelt werden. ⁶⁰⁴⁴Das Diagramm wird ausgehend von Daten erstellt, die nach Injektion bekannter Volumina an Stickstoffgas bei 35 +/- 2 °C in verschiedene Prüfgefäße (z. B. Serumflaschen) nach Stabilisierung der Druckanzeigen ermittelt wurden (siehe Anlage 2). ⁶⁰⁴⁵Die durchzuführende Berechnung wird im Hinweis in Nummer 44 erläutert.
Achtung! — Die Mikroinjektionsspritzen sind vorsichtig zu handhaben, damit es nicht zu Stichverletzungen kommt.
- d.
- Kohlenstoffanalysator, geeignet für die direkte Bestimmung des Gehalts an anorganischem Kohlenstoff im Bereich 1-200 mg/l;
- e.
- Präzisionsspritzen für Gas- und Flüssigproben;
- f.
- Magnetrührer und Rührfische (optional);
- g.
- Gasdichter Handschuhkasten (Glove Box) (empfohlen).
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Reagenzien | 14. | In der gesamten Prüfung sind ausschließlich Reagenzien in Analysequalität zu verwenden. |
Wasser | 15. | Destilliertes oder deionisiertes Wasser (dessen Sauerstoffkonzentration durch Besprühen mit Stickstoffgas auf weniger als 5 μl/l reduziert wurde) mit weniger als 2 mg/l gelöstem organischem Kohlenstoff (DOC). |
Prüfmedium | 16. | Das Verdünnungsmedium wird so vorbereitet, dass die folgenden Bestandteile in den jeweils genannten Anteilen enthalten sind:| Wasserfreies Kaliumdihydrogenorthophosphat (KH2PO4) | 0,27 g | | Dinatriumhydrogenphosphat Dodecahydrat (Na2HPO4·12H2O)) | 1,12 g | | Ammoniumchlorid (NH4Cl) | 0,53 g | | Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2·2H2O) | 0,075 g | | Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2·6H2O) | 0,10 g | | Eisen(II)-Chloridtetrahydrat (FeCl2·4H2O) | 0,02 g | | Resazurin (Sauerstoffindikator) | 0.001 g | | Natriumsulfid-Nonahydrat (Na2S·9H2O) | 0,10 g | | Stammlösung mit Spurenelementen (optional, Nummer 18) | 10 ml. | | Deoxygeniertes Wasser wird hinzugegeben (Nummer 15). | auf 1 l |
Hinweis: Um eine hinreichende Reduktionsfähigkeit zu gewährleisten, ist frisches Natriumsulfid zu verwenden oder das zu verwendende Natriumsulfid vor der Verwendung zu waschen und zu trocknen. ⁶⁰⁵²Der Test kann auch ohne Glove Box durchgeführt werden (siehe Nummer 26). In diesem Fall ist die Endkonzentration im Medium auf 0,20 g Na2S·9H2O/l zu erhöhen. ⁶⁰⁵³Natriumsulfid kann auch aus einer geeigneten anaeroben Stammlösung durch das Septum der verschlossenen Prüfgefäße gegeben werden, da bei diesem Verfahren das Oxidationsrisiko verringert wird. ⁶⁰⁵⁴Statt Natriumsulfid kann Titan-(III)-citrat verwendet werden; der Stoff ist durch das Septum der verschlossenen Prüfgefäße bis zu einer Endkonzentration von 0,8-1,0 mmol/l hinzuzugeben. ⁶⁰⁵⁵Titan-(III)-citrat ist ein hoch wirksames Reduziermittel mit geringer Toxizität, das wie folgt hergestellt wird: 2,94 g Trinatriumcitrat-Dihydrat wird in 50 ml deoxygeniertem Wasser gelöst (bis zu einer Konzentration von 200 mmol/l); anschließend werden 5 ml einer 15 %igen (w/v) Titan-(III)-chlorid-Lösung hinzugegeben. ⁶⁰⁵⁶Mit Natriumcarbonat wird der pH-Wert mit mineralischem Alkali auf 7 ± 0,2 eingestellt; danach wird die Lösung unter einem Stickstoff-Gasstrom in ein geeignetes Gefäß gegeben. ⁶⁰⁵⁷Die Konzentration des Titan-(III)-citrats in dieser Stammlösung beträgt 164 mmol/l. |
| 17. | ⁶⁰⁵⁸Die Bestandteile des Prüfmediums mit Ausnahme des Reduziermittels (Natriumsulfid bzw. Titan-(III)-citrat) werden gemischt; anschließend wird die Lösung unmittelbar vor der Verwendung etwa 20 Minuten lang mit Stickstoffgas besprüht, um den vorhandenen Sauerstoff abzubauen. ⁶⁰⁵⁹Danach wird unmittelbar vor der Verwendung des Mediums eine geeignete Menge an frisch hergestellter Lösung des Reduziermittels (mit deoxygeniertem Wasser zubereitet) hinzugegeben. ⁶⁰⁶⁰Das Medium wird erforderlichenfalls mit verdünnter Mineralsäure oder Lauge auf einen pH-Wert von 7 ± 0,2 eingestellt. |
Stammlösung mit Spurenelementen (optional) | 18. | Das Prüfmedium sollte die folgenden Spurenelemente enthalten, um anaerobe Abbauprozesse insbesondere bei niedrigen Inokulum-Konzentrationen (z. B. 1 g/l) zu unterstützen (11):| Manganchlorid-Tetrahydrat (MnCl2·4H2O) | 50 mg | | Borsäure (H3BO3) | 5 mg | | Zinkchlorid (ZnCl2) | 5 mg | | Kupfer(II)-chlorid (CuCl2) | 3 mg | | Dinatriummolybdat-Dihydrat (Na2MoO4·2H2O) | 1 mg | | Kobaltchlorid-Hexahydrat (CoCl2·6H2O) | 100 mg | | Nickelchlorid-Hexahydrat (NiCl2·6H2O) | 10 mg | | Dinatriumselenit (Na2SeO3) | 5 mg | | Deoxygeniertes Wasser wird hinzugegeben (Nummer 15). | auf 1 l |
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Prüfstoff | 1. | ⁶⁰⁶²Der Prüfstoff wird als Stammlösung, Suspension oder Emulsion oder unmittelbar als Feststoff oder Flüssigkeit oder absorbiert auf Glasfaserfilter bis zu einer Konzentration von höchstens 100 mg/l organischem Kohlenstoff hinzugegeben. ⁶⁰⁶³Wenn Stammlösungen verwendet werden, ist mit Wasser (Nummer 15) (das zuvor durch Besprühen mit Stickstoffgas deoxygeniert wurde) eine geeignete Lösung in einer Konzentration herzustellen, bei der das hinzugefügte Volumen weniger als 5 % des Gesamtvolumens des Reaktionsgemischs ausmacht. ⁶⁰⁶⁴Die Stammlösung kann erforderlichenfalls auf einen pH-Wert von 7 ± 0,2 eingestellt werden. ⁶⁰⁶⁵Bei in Wasser nicht hinreichend löslichen Prüfsubstanzen ist ISO 10634 (13) zu beachten. ⁶⁰⁶⁶Wenn ein Lösungsmittel verwendet wird, muss eine zusätzliche Kontrolle hergestellt werden, bei der ausschließlich das Lösungsmittel zum geimpften Medium hinzugegeben wird. ⁶⁰⁶⁷Organische Lösungsmittel, die erfahrungsgemäß die Methanproduktion hemmen (z. B. Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff), sind zu vermeiden.Achtung! — Toxische Prüfstoffe und Prüfstoffe mit unbekannten Eigenschaften sind mit Vorsicht zu handhaben.
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Referenzstoffe | 20. | ⁶⁰⁶⁹Referenzstoffe wie z. B. Natriumbenzoat, Phenol und Polyethylenglykol 400 sind innerhalb von 60 Tagen zu mehr als 60 % abbaubar und haben sich zur Prüfung des Verfahrens bewährt. ⁶⁰⁷⁰Von dem ausgewählten Referenzstoff wird auf die gleiche Weise wie für den Prüfstoff eine Stammlösung (in deoxygeniertem Wasser) hergestellt; die Stammlösung ist erforderlichenfalls auf einen pH-Wert von 7 ± 0,2 einzustellen. |
Inhibitionskontrolle (bedingt) | 21. | Um Informationen über die Toxizität des Prüfstoffs für anaerobe Mikroorganismen zu erhalten und entsprechend die am besten geeignete Prüfkonzentration zu ermitteln, werden der Prüfstoff und der Referenzprüfstoff in ein Gefäß mit dem Prüfmedium gegeben (siehe Nummer 16); dabei sind jeweils die gleichen Konzentrationen hinzuzufügen (siehe Nummern 19 und 20 und ISO 13641-1 (12)). |
Faulschlamm | 22. | ⁶⁰⁷²Der Faulschlamm wird aus einem Faulbehälter einer Kläranlage entnommen, in der vorwiegend häusliche Abwässer aufbereitet werden. ⁶⁰⁷³Der Schlamm muss vollständig charakterisiert werden; entsprechende Hintergrundinformationen sind zu protokollieren (siehe Nummer 54). ⁶⁰⁷⁴Wenn ein modifiziertes Inokulum verwendet werden soll, kann der Faulschlamm auch aus einer Anlage zur Klärung von Industrieabwässern entnommen werden. ⁶⁰⁷⁵Zur Entnahme des Faulschlamms werden Flaschen mit weitem Hals aus hochdichtem Polyethylen oder ähnlichem dehnbarem Material verwendet. ⁶⁰⁷⁶Der Schlamm wird bis zu einer Höhe von etwa 1 cm unter der Oberkante in die Flaschen gegeben; anschließend werden die Flaschen luftdicht verschlossen — vorzugsweise mit einem Druckventil. ⁶⁰⁷⁷Nach der Beförderung ins Labor kann der entnommene Schlamm entweder sofort verwendet oder in einen Laborkocher gegeben werden. ⁶⁰⁷⁸Überschüssiges Biogas wird unter vorsichtigem Öffnen der Flaschen freigesetzt. ⁶⁰⁷⁹Alternativ kann im Labor gereifter anaerober Schlamm als Inokulum verwendet werden; in diesem Fall kann das Aktivitätsspektrum allerdings beeinträchtigt sein.Achtung! — Faulschlamm erzeugt entzündbare Gase; die Gase können verbrennen oder eine Explosion verursachen. ⁶⁰⁸¹Außerdem enthalten die Gase potenziell pathogene Organismen. ⁶⁰⁸²Daher sind beim Umgang mit Faulschlamm entsprechende Vorsichtsmaßnahmen zu treffen. ⁶⁰⁸³Aus Sicherheitsgründen dürfen zur Entnahme des Schlamms keine Glasgefäße verwendet werden.
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| 23. | ⁶⁰⁸⁴Um die Hintergrundgasproduktion und den Einfluss der Blindkontrollen zu reduzieren, kann eine Vorfaulung des Schlamms in Betracht gezogen werden. ⁶⁰⁸⁵Wenn eine Vorfaulung erforderlich ist, muss die Faulung ohne Zugabe von Nährstoffen oder Substraten über einen Zeitraum von höchstens 7 Tagen bei einer Temperatur von 35 ± 2 °C erfolgen. ⁶⁰⁸⁶Mit einer Vorfaulung von etwa 5 Tagen wird (Erfahrungen mit einer geringen Anzahl an Stoffen zufolge) gewöhnlich eine optimale Reduzierung der Gasproduktion der Blindkontrolle ohne unannehmbare Erhöhung der ‚Lag‘-Phase oder der Inkubationszeiten in der Prüfung und ohne Beeinträchtigung der Aktivität erzielt. |
| 24. | ⁶⁰⁸⁷Bei biologisch nur schwer abbaubaren Prüfsstoffen bzw. bei Prüfstoffen, bei denen davon ausgegangen wird, dass sie biologisch schwer abzubauen sind, kann eine Vorexposition des Schlamms gegenüber dem Prüfstoff vorgenommen werden, um ein besser angepasstes Inokulum zu erhalten. ⁶⁰⁸⁸In diesem Fall ist der Prüfstoff mit einer Konzentration von 5-20 mg/l an organischem Kohlenstoff in den Faulschlamm zu geben und bis zu 2 Wochen zu inkubieren. ⁶⁰⁸⁹Nach dieser Vorexposition ist der Schlamm vor der Verwendung sorgfältig zu waschen (siehe Nummer 25); im Prüfprotokoll werden die Bedingungen der Vorexposition vermerkt. |
Inokulum | 25. | ⁶⁰⁹⁰Unmittelbar vor der Verwendung wird der Schlamm gewaschen (siehe Nummern 22 bis 24), um die Konzentration an anorganischem Kohlenstoff in der endgültigen Testsuspension auf weniger als 10 mg/l zu reduzieren. ⁶⁰⁹¹Der Schlamm wird in verschlossenen Röhrchen zentrifugiert (z. B. 5 Minuten mit 3 000 g); anschließend wird der Überstand entsorgt. ⁶⁰⁹²Das entstandene Pellet wird in deoxygeniertem Medium (Nummern 16 und 17) suspendiert. ⁶⁰⁹³Danach wird die Suspension nochmals zentrifugiert und wiederum die überstehende Flüssigkeit abgegossen. ⁶⁰⁹⁴Wenn der Anteil an anorganischem Kohlenstoff nicht ausreichend verringert wurde, kann der Waschvorgang noch höchstens zweimal wiederholt werden. ⁶⁰⁹⁵Dadurch scheint die Aktivität der Mikroorganismen nicht beeinträchtigt zu werden. ⁶⁰⁹⁶Schließlich wird das Pellet auf das benötigte Volumen des Prüfmediums suspendiert und die Konzentration der Gesamtfeststoffe ermittelt (siehe z. B. ISO 11923 (15)). ⁶⁰⁹⁷Die Endkonzentration der Gesamtfeststoffe in den Prüfgefäßen muss bei 1-3 g/l (oder ca. ⁶⁰⁹⁸10 % der Konzentration des nicht verdünnten Faulschlamms) liegen. ⁶⁰⁹⁹Die vorstehenden Schritte sind so durchzuführen, dass der Schlamm möglichst wenig mit Sauerstoff in Berührung kommt (beispielsweise, indem in einer Stickstoffatmosphäre gearbeitet wird). |
PRÜFVERFAHREN | 26. | ⁶¹⁰⁰Zunächst sind die folgenden Schritte mit Verfahren durchzuführen, bei denen der Faulschlamm möglichst wenig mit Sauerstoff in Berührung kommt. ⁶¹⁰¹Beispielsweise kann die Verwendung einer Glove-Box in einer Stickstoffatmosphäre und/oder eine Stickstoffspülung der Flaschen erforderlich sein (4). |
Vorbereitung der Prüfgefäße und der Kontrollen | 27. | ⁶¹⁰²Es werden jeweils mindestens drei Prüfgefäße (siehe Nummer 13-b) für den Prüfstoff, die Blindkontrollen, den Referenzstoff und die Inhibitionskontrollen (bedingt) sowie Kammern mit Druckregelung (optionales Verfahren) vorbereitet (siehe Nummern 7 und 19-21). ⁶¹⁰³Außerdem können Gefäße zur Prüfung des primären biologischen Abbaus mit für den jeweiligen Prüfstoff spezifischen Analysen vorbereitet werden. ⁶¹⁰⁴Innerhalb einer Prüfung können für mehrere Prüfstoffe dieselben Blindkontrollen verwendet werden, sofern die Gasraumvolumina einheitlich sind. |
| 28. | ⁶¹⁰⁵Das verdünnte Inokulum wird hergestellt und in die Gefäße gegeben (z.B. mit einer Pipette mit großer Öffnung). ⁶¹⁰⁶Aliquote des gut gemischten Inokulums (Nummer 25) werden hinzugegeben, bis in allen Gefäßen die gleiche Konzentration an Gesamtfeststoffen besteht (1-3 g/l). ⁶¹⁰⁷Stammlösungen des Prüfstoffes und des Referenzstoffes werden erforderlichenfalls auf einen pH-Wert von 7 ± 0,2 eingestellt und hinzugefügt. ⁶¹⁰⁸Die Prüfsubstanz und der Referenzstoff sind in der jeweils geeignetsten Weise hinzuzugeben (Nummer 19). |
| 29. | ⁶¹⁰⁹Die Prüfkonzentration an organischem Kohlenstoff sollte üblicherweise zwischen 20 und 100 mg/l (Nummer 4) liegen. ⁶¹¹⁰Wenn der Prüfstoff toxisch ist, muss die Prüfkonzentration auf 20 mg C/l reduziert werden; diese Konzentration kann noch unterschritten werden, wenn mit speziellen Analysen nur der primäre biologische Abbau ermittelt werden soll. ⁶¹¹¹Es gilt zu beachten, dass es bei niedrigeren Prüfkonzentrationen zu größeren Unterschieden zwischen den Prüfergebnissen kommt. |
| 30. | ⁶¹¹²In die Gefäße mit den Blindkontrollen ist anstelle einer Stammlösung, Suspension oder Emulsion eine entsprechende Menge der zur Dosierung des Prüfstoffes verwendeten Trägerlösung hinzuzugeben. ⁶¹¹³Wenn der Prüfstoff absorbiert auf einem Glasfaserfilter oder mit organischen Lösungsmitteln hinzugegeben wurde, ist auch bei den Blindkontrollen ein Filter zu verwenden bzw. eine den verdunsteten Lösungsmitteln entsprechende Menge hinzuzugeben. ⁶¹¹⁴Zur Messung des pH-Werts wird ein zusätzliches Replikat mit dem Prüfstoff hergestellt. ⁶¹¹⁵Das Medium ist erforderlichenfalls mit geringen Mengen an verdünnter Mineralsäure oder Lauge auf einen pH-Wert von 7 ± 0,2 einzustellen. ⁶¹¹⁶In alle Prüfgefäße wird die gleiche Menge an Neutralisierungsmitteln gegeben. ⁶¹¹⁷Diese Zugaben dürften allerdings nicht erforderlich sein, weil der pH-Wert der Stammlösungen des Prüfstoffes und des Referenzstoffes bereits eingestellt wurde (siehe Nummern 19 und 20). ⁶¹¹⁸Wenn der biologische Primärabbau gemessen werden soll, ist eine geeignete Probe aus dem Gefäß zur pH-Kontrolle oder aus einem zusätzlichen Prüfgefäß zu entnehmen; die Konzentration des Prüfstoffes ist dann mit spezifischen Analysen zu messen. ⁶¹¹⁹In alle Gefäße können beschichtete Magnetrührstäbchen gegeben werden, wenn die Reaktionsgemische umgerührt werden sollen (optional). |
| 31. | ⁶¹²⁰Das Gesamtvolumen der Flüssigkeit V1 und das Volumen des Gasraums Vh müssen in allen Gefäßen gleich sein. Die Werte für V1 und Vh sind zu messen und zu protokollieren. ⁶¹²¹Die Gefäße werden mit gasdichten Septa verschlossen und in der Glove-Box (siehe Nummer 26) in den Inkubator gestellt (siehe Nummer 13-a). |
Nicht lösliche Prüfstoffe | 32. | ⁶¹²²Wenn Stoffe in Wasser schwer löslich sind, werden die betreffenden Mengen direkt in die vorbereiteten Gefäße eingewogen. ⁶¹²³Muss ein Lösungsmittel verwendet werden (siehe Nummer 19), wird die Lösung oder Suspension mit dem Prüfstoff in die leeren Gefäße gegeben. ⁶¹²⁴Wenn möglich, wird das Lösungsmittel verdampft, indem Stickstoffgas durch die Gefäße geleitet wird; anschließend werden die anderen Bestandteile (verdünnter Klärschlamm (Nummer 25) und — nach Bedarf — deoxygeniertes Wasser) hinzugegeben. ⁶¹²⁵Außerdem wird eine zusätzliche Lösungsmittelkontrolle hergestellt (siehe Nummer 19). ⁶¹²⁶Bezüglich anderer Methoden zur Zugabe unlöslicher Stoffe wird auf ISO 10634 (13) verwiesen. ⁶¹²⁷Flüssige Prüfstoffe können mit einer Spritze in die entsprechend vorbereiteten und verschlossenen Gefäße injiziert werden, wenn davon ausgegangen wird, dass der pH-Ausgangswert bei 7 ± 1 liegt; ansonsten ist die Dosierung vorzunehmen, wie oben beschrieben (siehe Nummer 19). |
Inkubation und Gasdruckmessungen | 33. | ⁶¹²⁸Die vorbereiteten Gefäße werden etwa 1 Stunde bei 35 ± 2 °C inkubiert, um die Gleichgewichtseinstellung zu ermöglichen. ⁶¹²⁹Um die Freisetzung von überschüssigem Gas in die Umgebungsluft zu ermöglichen, kann beispielsweise wie folgt verfahren werden: Die Gefäße werden nacheinander geschüttelt; die Nadel des Druckmessers (Nummer 13-c) wird durch den Verschluss gestochen und das Ventil geöffnet, bis der Druckmesser auf 0 steht. ⁶¹³⁰Wenn bei diesem Schritt oder bei Zwischenmessungen der Druck im Gasraum unter den Atmosphärendruck fällt, sollte Stickstoffgas zugeführt werden, um den Atmosphärendruck wiederherzustellen. ⁶¹³¹Das Ventil wird geschlossen (siehe Nummer 13-c); danach wird die Inkubation im Dunkeln fortgesetzt. ⁶¹³²Dabei ist sicherzustellen, dass in allen Bereichen der Gefäße die nötige Faultemperatur aufrechterhalten wird. ⁶¹³³Nach einer Inkubationsdauer von 24-48 h Stunden werden die Gefäße kontrolliert. ⁶¹³⁴Gefäße, bei denen die überstehende Flüssigkeit deutlich rosa gefärbt ist, sind zu verwerfen. ⁶¹³⁵(Wenn sich das Resazurin (siehe Nummer 16) verfärbt hat, ist Sauerstoff vorhanden (siehe Nummer 50)). ⁶¹³⁶Im System sind kleine Mengen an Sauerstoff annehmbar; höhere Konzentrationen können den anaeroben biologischen Abbau aber erheblich hemmen. ⁶¹³⁷Die Verwerfung einzelner Gefäße (von jeweils drei gleichen Gefäßen) ist annehmbar. ⁶¹³⁸Wenn jedoch mehr Gefäße verworfen werden müssen, sind die Versuchsverfahren zu prüfen; außerdem muss der betreffende Test wiederholt werden. |
| 34. | ⁶¹³⁹Der Inhalt der einzelnen Gefäße wird sorgfältig gemischt, indem der Inhalt der Gefäße mindestens 2- oder 3-mal wöchentlich sowie kurz vor den Druckmessungen einige Minuten gerührt oder geschüttelt wird. ⁶¹⁴⁰Beim Schütteln wird das Inokulum neu suspendiert, und das erforderliche Gleichgewicht der Gase hergestellt. ⁶¹⁴¹Alle Druckmessungen sind rasch vorzunehmen, da die Messergebnisse infolge der sinkenden Temperatur der Prüfgefäße beeinträchtigt werden könnten. ⁶¹⁴²Bei den Druckmessungen muss im gesamten Prüfgefäß (einschließlich des Gasraums) die Faultemperatur aufrechterhalten werden. ⁶¹⁴³Der Gasdruck wird gemessen, indem beispielsweise die mit dem Druckmesser verbundene Spritzennadel durch das Septum gestochen wird (Nummer 13-c). ⁶¹⁴⁴Dabei ist darauf zu achten, dass kein Wasser in die Spritzennadel gelangt. ⁶¹⁴⁵Ansonsten müssen die feuchten Teile getrocknet und eine frische Nadel verwendet werden. ⁶¹⁴⁶Der Druck ist in Millibar zu messen (siehe Nummer 42). ⁶¹⁴⁷Der Gasdruck in den Gefäßen kann regelmäßig (z. B. wöchentlich) gemessen werden; das überschüssige Gas kann in die Umgebungsluft freigesetzt werden. ⁶¹⁴⁸Alternativ wird der Gasdruck erst am Ende der Prüfung gemessen, um die Menge des erzeugten Biogases zu ermitteln. |
| 35. | Zwischenmessungen des Gasdrucks sind zu empfehlen, da ein Druckanstieg einen Anhaltspunkt dafür bietet, wann die Prüfung beendet werden kann; außerdem kann die Kinetik der Prüfung überwacht werden (siehe Nummer 6). |
| 36. | ⁶¹⁵⁰Normalerweise wird die Prüfung nach einer Inkubationsdauer von 60 Tagen beendet, wenn die aufgrund der Druckmessungen erstellte Kurve des biologischen Abbaus nicht bereits vorher ein Plateau erreicht hat. ⁶¹⁵¹Dann ist der maximale Abbaugrad erreicht, und die Abbaukurve flacht ab. ⁶¹⁵²Wird ein Plateau bei weniger als 60 % erreicht, ist die Bewertung schwierig, weil davon auszugehen ist, dass die vorhandenen Moleküle nur teilweise mineralisiert wurden oder bei der Durchführung des Versuchs ein Fehler gemacht wurde. ⁶¹⁵³Wenn am Ende der normalen Inkubationsdauer Gas erzeugt wird, aber offensichtlich kein Plateau erreicht wurde, ist eine Verlängerung der Prüfung in Betracht zu ziehen, um zu prüfen, ob sich vielleicht doch noch ein Plateau (> 60 %) einstellt. |
Messung des anorganischen Kohlenstoffs | 37. | ⁶¹⁵⁴Am Ende des Tests nach der letzten Messung des Gasdrucks wird abgewartet, bis der Faulschlamm sich gesetzt hat. ⁶¹⁵⁵Die Gefäße werden nacheinander geöffnet; anschließend wird umgehend eine Probe zur Bestimmung der Konzentration an anorganischem Kohlenstoff in der überstehenden Flüssigkeit (in mg/l) entnommen. ⁶¹⁵⁶Die überstehende Flüssigkeit ist weder zu zentrifugieren noch zu filtern; ansonsten würde es zu einem inakzeptablen Verlust an gelöstem Kohlendioxid kommen. ⁶¹⁵⁷Wenn eine Analyse der Flüssigkeit unmittelbar nach der Probenahme nicht möglich ist, ist die Flüssigkeit bei etwa 4 °C bis zu 2 Tage in einem gedichteten Probengefäß ohne Gasraum aufzubewahren. ⁶¹⁵⁸Nach der Messung der Konzentration an anorganischem Kohlenstoff wird der pH-Wert bestimmt und protokolliert. |
| 38. | ⁶¹⁵⁹Alternativ kann die Konzentration des anorganischen Kohlenstoffs auch unmittelbar bestimmt werden; dazu wird der gelöste anorganische Kohlenstoff als Kohlendioxid freigesetzt und dann im Gasraum gemessen. ⁶¹⁶⁰Nach der letzten Messung des Gasdrucks wird in den einzelnen Prüfgefäßen der Atmosphärendruck hergestellt. Der Inhalt der einzelnen Gefäße wird etwa auf den pH-Wert 1 eingestellt, indem durch das Septum der verschlossenen Gefäße konzentrierte Mineralsäure (z. B. H2SO4) hinzugegeben wird. ⁶¹⁶¹Die geschüttelten Gefäße werden etwa 24 Stunden bei 35 ± 2 °C inkubiert. ⁶¹⁶²Anschließend wird der durch die Freisetzung von Kohlendioxid entstandene Gasdruck mit dem Druckmesser ermittelt. |
| 39. | Für die entsprechende Blindkontrolle sowie für den Referenzstoff und (soweit vorhanden) für die Gefäße zur Inhibitionskontrolle werden ähnliche Messungen vorgenommen (siehe Nummer 21). |
| 40. | ⁶¹⁶⁴Manchmal, insbesondere wenn für mehrere Prüfstoffe dieselben Kontrollgefäße verwendet werden, können Zwischenmessungen der Konzentrationen an anorganischem Kohlenstoff in den Gefäßen mit dem Prüfstoff und mit den Kontrollen in Betracht gezogen werden. ⁶¹⁶⁵In diesem Fall ist eine hinreichende Anzahl an Gefäßen für alle vorgesehenen Zwischenmessungen vorzubereiten. ⁶¹⁶⁶Dieses Verfahren wird gegenüber der Entnahme sämtlicher Proben aus einem einzigen Gefäß bevorzugt. ⁶¹⁶⁷Letzteres kommt nur dann in Betracht, wenn für die Analyse des gelösten anorganischen Kohlenstoffs kein allzu großes Volumen benötigt wird. Die Messung der Konzentration des gelösten anorganischen Kohlenstoffs ist nach der Messung des Gasdrucks, ohne das Ablassen von überschüssigem Gas, wie im Folgenden beschrieben vorzunehmen:- —
- Mit einer durch das Septum gestochenen Spritze wird eine möglichst geringe Menge des Überstands entnommen, ohne die Gefäße zu öffnen; anschließend wird die Konzentration des anorganischen Kohlenstoffs in der Probe ermittelt;
- —
- nach der Probenahme kann das überschüssige Gas freigesetzt werden;
- —
- selbst bei einer geringen Reduzierung der Menge des Überstands (z. B. um etwa 1 %) kann sich das Gasvolumen im Gasraum (Vh) beträchtlich erhöhen;
- —
- die Gleichungen (siehe Nummer 44) werden gegebenenfalls korrigiert, indem in Gleichung 3 der Wert für Vh erhöht wird.
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Spezifische Analysen | 41. | ⁶¹⁶⁸Wenn der primäre anaerobe Abbau (siehe Nummer 30) bestimmt werden soll, wird am Anfang und am Ende der Prüfung aus den Gefäßen mit dem Prüfstoff eine geeignete Menge der Probe für spezifische Analysen entnommen. Dadurch ändern sich die Volumina des Gasraums (Vh) und der Flüssigkeit (Vl). ⁶¹⁶⁹Dies ist bei der Berechnung der Gasproduktion zu berücksichtigen. ⁶¹⁷⁰Alternativ können Proben für spezifische Analysen auch aus zusätzlichen Gemischen entnommen werden, die zuvor für diesen Zweck hergestellt wurden (Nummer 30). |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 42. | Aus praktischen Gründen werden der Gasdruck in Millibar (1 mbar = 1h Pa = 102 Pa; 1 Pa = 1 N/m2), das Volumen in Litern und die Temperatur in Grad Celsius gemessen. |
Kohlstoff im Gasraum | 43. | Da 1 mol Methan und 1 mol Kohlendioxid jeweils 12 g Kohlenstoff enthalten, kann die Masse des Kohlenstoffs in einem bestimmten Volumen eines entstandenen Gases wie folgt ausgedrückt werden:| m= 12 × 103×n | Gleichung [1] |
Dabei sind:| m | = | Masse des Kohlenstoffs (mg) in einem bestimmten Volumen des entwickelten Gases; | | 12 | = | relative Atommasse des Kohlenstoffs; | | n | = | Molzahl des Gases in einem bestimmten Volumen. |
Wenn ein anderes Gas als Methan oder Kohlendioxid) (z. B. N2O) in erheblichen Mengen entsteht, ist die Formel [1] entsprechend abzuändern, um mögliche Effekte der enstehenden Gase abzubilden. |
| 44. | Nach den Gasgesetzen kann n ausgedrückt werden als: | Gleichung [2] |
Dabei sind:| p | = | Gasdruck (Pascal); | | V | = | Gasvolumen (m3); | | R | = | molare Gaskonstante [8,314 J/(mol K)]; | | T | = | Inkubationstemperatur (Kelvin). |
Durch Kombination der Gleichungen [1] und [2] und durch Rationalmachen ergibt sich für die Berechnung der Gasproduktion der Blindkontrolle: | Gleichung [3] |
Dabei sind:| mh | = | Nettomasse des im Gasraum erzeugten gasförmigen Kohlenstoffs (mg); | | Δp | = | Mittelwert des Unterschieds zwischen Ausgangs- und Enddruck in den Prüfgefäßen abzüglich des entsprechenden Mittelwerts der Blindgefäße (Millibar); | | Vh | = | Gasraumvolumen (l); | | 0,1 | = | Umrechnung Newton/m2 in Millibar und m3 in l. |
Gleichung [4] ist für die normale Inkubationstemperatur von 35 °C (308 K) zu verwenden:| mh= 0,468(Δp·Vh) | Gleichung [4] |
Hinweis: Alternative Volumenberechnung: Aus den auf dem Druckmesser angezeigten Werten wird anhand der erstellten Standardkurve (injiziertes Volumen (ml) vs. ⁶¹⁷⁶angezeigter Messwert) in ml das produzierte Gasvolumen berechnet (Anlage 2). ⁶¹⁷⁷Die Molzahl (n) des Gases im Gasraum der einzelnen Gefäße wird berechnet, indem die gesamte Gasproduktion (ml) durch 25 286 ml/mol geteilt wird. (Dies ist das von einem mol des Gases bei einer Temperatur von 35 °C und dem normalen Atmosphärendruck beanspruchte Volumen.) Da 1 mol CH4 und 1 mol CO2 jeweils 12 g Kohlenstoff enthalten, kann die Menge des Kohlenstoffs (mg) im Gasraum (mh) mit der folgenden Gleichung [5] ermittelt werden:| mh= 12 × 103×n | Gleichung [5] |
Durch Rationalmachen wird die Gasproduktion in der Blindkontrolle berechnet | Gleichung [6] |
Dabei sind:| mh | = | Nettomasse des im Gasraum erzeugten gasförmigen Kohlenstoffs (mg); | | ΔV | = | Mittelwert des Unterschieds zwischen dem Volumen des im Gasraum der Prüfgefäße und der Gefäße mit den Blindkontrollen erzeugten Gases; | | 25 286 | = | von 1 mol Gas bei 35 °C, 1 atm beanspruchtes Volumen. |
|
| 45. | ⁶¹⁷⁸Der biologische Abbau kann verfolgt werden, indem der kumulierte Druckanstieg Δp (millibar), ggf. ⁶¹⁷⁹zeitbezogen, grafisch dargestellt wird. ⁶¹⁸⁰Aus der entsprechenden Kurve kann die lag-Phase (in Tagen) ermittelt und protokolliert werden. ⁶¹⁸¹Als lag-Phase wird der Zeitraum vom Beginn der Prüfung bis zum Einsetzen eines signifikanten Abbaus bezeichnet (siehe z. B. Anlage 3). ⁶¹⁸²Wenn Zwischenproben des Überstands genommen und analysiert wurden (siehe Nummern 40, 46 und 47), kann anstelle des bloßen Gesamtdrucks auch die Summe des erzeugten Kohlenstoffs (gasförmig und flüssig) dargestellt werden. |
Kohlstoff im Gasraum | 46. | Die Menge des Methans in der Flüssigkeit ist unerheblich, da sich Methan in Wasser sehr schlecht löst. Mit der folgenden Gleichung [7] wird die Masse des anorganischen Kohlenstoffs in der Flüssigkeit der Prüfgefäße ermittelt:Dabei sind:| ml | = | Masse des anorganischen Kohlenstoffs in der Flüssigkeit (mg); | | Cnet | = | Konzentration des anorganischen Kohlenstoffs in den Prüfgefäßen abzüglich des organischen Kohlenstoffs in den Kontrollgefäßen am Ende des Tests (mg/l); | | Vl | = | Volumen der Flüssigkeit im Gefäß (l). |
|
Gasförmiger Kohlenstoff insgesamt | 47. | Die Gesamtmasse des gasförmigen Kohlenstoffs im Gefäß wird mit der folgenden Gleichung [8] berechnet:Dabei sind: | mt = Gesamtmasse des gasförmigen Kohlenstoffs (mg); |
| mh und ml wie oben angegeben. |
|
Kohlstoff im Prüfstoff | 48. | Mit der folgenden Gleichung [9] wird die Masse des Kohlenstoffs in den Prüfgefäßen ermittelt, die sich aus dem hinzugegebenen Prüfstoff ableitet:Dabei sind:| mv | = | Masse des Kohlenstoffs im Prüfstoff (mg); | | Cc | = | Konzentration des im Prüfstoff enthaltenen Kohlenstoffs im Prüfgefäß (mg/l) | | Vl | = | Volumen der Flüssigkeit im Prüfgefäß (l). |
|
Umfang des biologischen Abbaus | 49. | Der prozentuale biologische Abbau, ermittelt anhand des Gases im Gasraum, wird mit der folgenden Gleichung [10] berechnet; mit Gleichung [11] wird die prozentuale Gesamtsumme für den biologischen Abbau ermittelt:| Dh= (mh/mv) × 100 | Gleichung [10] | | Dt= (mt/mv) × 100 | Gleichung [11] |
Dabei sind: | Dh = biologischer Abbau anhand des Gases im Gasraum ( %); |
| Dt = Gesamtsumme biologischer Abbau ( %); |
| mh, mv und mt wie oben angegeben. |
Der Umfang des primären biologischen Abbaus wird mit der folgenden Gleichung [12] aus den (optionalen) Messungen der Konzentration des Prüfstoffs zu Beginn und am Ende der Inkubationsdauer berechnet:| Dp= (1 –Se/Si) × 100 | Gleichung [12] |
Dabei sind:| Dp | = | primärer Abbau des Prüfstoffs ( %); | | Si | = | Ausgangskonzentration des Prüfstoffs (mg/l); | | Se | = | Konzentration des Prüfstoffs am Ende der Inkubationsdauer (mg/l). |
Wenn die Analysemethode ergibt, dass sich im unbehandelten anaeroben Schlamm-Inokulum erhebliche Konzentrationen des Prüfstoffs befinden, ist Gleichung [13] zu verwenden:| Dp1= [1 – (Se–Seb)/(Si–Sib)] × 100 | Gleichung [13] |
Dabei sind:| Dp1 | = | korrigierter primärer Abbau des Prüfstoffs ( %); | | Sib | = | ‚scheinbare‘ Ausgangskonzentration des Prüfstoffs in den Blindkontrollen (mg/l); | | Seb | = | ‚scheinbare‘ Konzentration des Prüfstoffs in den Blindkontrollen am Ende (mg/l). |
|
Gültigkeit der Ergebnisse | 50. | ⁶¹⁸⁹Angezeigte Druckwerte sind nur von den Gefäßen zu berücksichtigen, die sich nicht rosa verfärbt haben (siehe Nummer 33). ⁶¹⁹⁰Die Kontamination durch Sauerstoff wird durch die Verwendung geeigneter Verfahren zur anaeroben Handhabung minimiert. |
| 51. | Ein Test ist dann als gültig zu betrachten, wenn die Kurve des Referenzstoffes ein Plateau erreicht, das einem biologischen Abbau von mehr als 60 % entspricht. |
| 52. | Wenn der pH-Wert am Ende der Prüfung nicht mehr im Bereich 7 ± 1 liegt und kein ausreichender biologischer Abbau erfolgt ist, wird die Pufferkapazität des Mediums erhöht und der Test wiederholt. |
Hemmung des Abbaus | 53. | ⁶¹⁹²In den Gefäßen, die sowohl den Prüfstoff als auch den Referenzstoff enthalten, muss mindestens die gleiche Menge an Gas produziert werden wie in den Gefäßen ausschließlich mit dem Referenzstoff. ⁶¹⁹³Ansonsten ist eine Inhibition der Gasproduktion festzustellen. ⁶¹⁹⁴Manchmal ist die Gasproduktion in Gefäßen mit dem Prüfstoff ohne den Referenzstoff geringer als in den Blindkontrollen; auch in diesem Fall ist eine hemmende Wirkung des Prüfstoffs festzustellen. |
Prüfbericht | 54. | Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: | Prüfstoff:- —
- Trivialname, chemische Bezeichnung, CAS-Nummer, Strukturformel und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;
- —
- Reinheit (Verunreinigungen) des Prüfstoffs.
|
| Prüfbedingungen:- —
- Volumina der verdünnten Flüssigkeit (Vl) und des Gasraums (Vh) im Gefäß;
- —
- Beschreibung der Prüfgefäße, der wesentlichen Merkmale der Biogasmessung (z. B. Druckmessertyp) und des Geräts zur Analyse des Gehalts an anorganischem Kohlenstoff;
- —
- Applikation der Prüf- und der Referenzsubstanz in das Prüfsystem: verwendete Prüfkonzentration und Verwendung von Lösungsmitteln;
- —
- nähere Angaben zum verwendeten Inokulum: Name der Kläranlage, Angaben zur Herkunft des behandelten Abwassers (Betriebstemperatur, Verweilzeit des Abwassers in der Kläranlge, vorwiegend häusliche Abwässer usw.), Konzentration, erforderliche Belege für diese Angaben und Informationen zu Vorbehandlungen des Inokulums (Vorfaulung, Vorexposition usw.);
- —
- Inkubationstemperatur;
- —
- Anzahl der Replikate.
|
| Ergebnisse:- —
- pH-Werte und Konzentration des anorganischen Kohlenstoffs am Ende des Tests;
- —
- Konzentration des Prüfstoffs zu Beginn und am Ende des Tests, wenn eine spezifische Messung vorgenommen wurde;
- —
- alle gemessenen Daten zu den Prüfgefäßen und Blindgefäßen sowie zu den Gefäßen mit dem Referenzstoff und den Inhibitionskontrollen (soweit verwendet) (z. B. Druck in Millibar und Konzentration des anorganischen Kohlenstoffs (mg/l)) in tabellarischer Form (unter getrennter Angabe der Messwerte für den Gasraum und für die Flüssigkeit);
- —
- statistische Aufbereitung der Daten, Prüfdauer und grafische Darstellung des biologischen Abbaus (Prüfstoff, Referenzstoff und Inhibitionskontrolle);
- —
- prozentualer biologischer Abbau des Prüfstoffs und des Referenzstoffs;
- —
- Angabe von Gründen, falls die Prüfergebnisse verworfen werden;
- —
- Diskussion der Ergebnisse.
|
|
LITERATUR | (1) | Die folgenden Kapital in diesem Anhang: | C.4, Bestimmung leichter biologischer Abbaubarkeit; |
| C.9, Biologische Abbaubarkeit — Zahn-Wellens-Test; |
| C.10, Simulationstest — Aerobe Abwasserbehandlung:A: Belebtschlamm-Anlagen, B: Biofilme
|
| C.11, Biologische Abbaubarkeit — Belebtschlamm-Atmungshemmungstest |
|
| (2) | OECD (2009) Inherent Biodegradability: Modified MITI Test (II), OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 302C, OECD, Paris |
| (3) | Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga,U., Steber, J., Reust, H., und Bontinck, W.J. (1989) Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550. (veröffentlicht auch als ECETOC Technical Report Nr. 28, Juni 1988). |
| (4) | Shelton, D.R., und Tiedje, J.M. (1984) General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Environ. Mircobiology, 47, 850-857. |
| (5) | Owen, W.F., Stuckey, D.C., Healy, J.B., Jr, Young, L.Y., und McCarty, P.L. (1979) Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity. Water Res. 13, 485-492. |
| (6) | Healy, J.B. Jr., und Young, L.Y. (1979) Anaerobic biodegradation of eleven aromatic compounds to methane. Appl. Environ. Microbiol. 38, 84-89. |
| (7) | Gledhill, W.E. (1979) Proposed standard practice for the determination of the anaerobic biodegradation of organic chemicals. ⁶²⁰⁸Working document. ⁶²⁰⁹Draft 2 no.35.24. ⁶²¹⁰American Society for Testing Materials, Philadelphia. |
| (8) | Battersby, N.S., und Wilson, V. (1988) Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegradability of organic chemicals under methanogenic conditions. Chemosphere, 17, 2441-2460. |
| (9) | E1192-92. ⁶²¹³Standard Test Method for Determining the Anaerobic Biodegradation Potential of Organic Chemicals. ⁶²¹⁴ASTM, Philadelphia. |
| (10) | US-EPA (1998) Fate, Transport and Transformation Test Guidelines OPPTS 835.3400 Anaerobic Biodegradability of Organic Chemicals. |
| (11) | Internationale Organisation für Normung (1995) ISO 11734 Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der vollständigen anaerobischen Abbaubarkeit organischer Verbindungen in Belebtschlamm — Verfahren durch Messung der Biogasproduktion |
| (12) | Internationale Organisation für Normung (2003) ISO 13 641-1 Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der Hemmwirkung der Gasproduktion auf anaerobe Bakterien — Teil 1: Allgemeiner Test. |
| (13) | Internationale Organisation für Normung (1995) ISO 10634, Wasserbeschaffenheit — Anleitung für die Vorbereitung und Behandlung von in Wasser schwer löslichen organischen Verbindungen für die nachfolgende Bestimmung ihrer biologischen Abbaubarkeit in einem wässrigen Medium. |
| (14) | Pagga, U., und Beimborn, D.B., (1993) Anaerobic biodegradation test for organic compounds. Chemosphere, 27, 1499-1509. |
| (15) | Internationale Organisation für Normung (1997) ISO 11 923 Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der Schwebstoffe mittels Filtration durch ein Glasfaserfilter. |
Anlage 1Beispiel einer Apparatur zur Messung der Biogasproduktion anhand des Gasdrucks
 Legende:| 1 | — | Druckmesser | | 2 | — | Gasdichtes 3-Wege-Ventil | | 3 | — | Spritzennadel | | 4 | — | Gasdichter Verschluss (gepresster Deckel und Septum) | | 5 | — | Gasraum (Headspace) (Vh) | | 6 | — | Faulschlamm-Inokulum, Volumen der Flüssigkeit (Vl) |
Inkubation der Prüfgefäße bei einer Temperatur von 35 °C ± 2 °CAnlage 2
Umrechnung der Messwerte des Druckmessers
Anhand einer Standardkurve, die nach Injektion bekannter Luftvolumina bei einer Temperatur von mindestens 35 ± 2 °C in Serumflaschen mit einem Wasseranteil entsprechend dem Reaktionsgemisch (VR) erstellt wurde, können die angezeigten Druckwerte Gasvolumina zugeordnet werden:
- —
- Auf 35 ± 2 °C temperierte Wasseraliquote mit einem Volumen von VR ml werden in fünf Serumflaschen gegeben. Die Flaschen werden verschlossen und 1 Stunde zum Ausgleichen in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 35 °C gestellt;
- —
- der Druckmesser wird eingeschaltet, und nach der Stabilisierung der Anzeige wird das Gerät auf null gestellt;
- —
- die Spritzennadel wird durch den Verschluss in eine der Flaschen gestochen, und das Ventil wird geöffnet; wenn der Druckmesser den Wert null anzeigt, wird das Ventil wieder geschlossen;
- —
- dieses Verfahren ist mit den übrigen Flaschen zu wiederholen;
- —
- In jede Flasche wird 1 ml Luft mit einer Temperatur von 35 ± 2 °C injiziert. ⁶²²²Die Nadel (am Druckmesser) wird durch den Verschluss einer Flasche gestochen; danach muss abgewartet werden, bis sich die Druckanzeige stabilisiert hat. ⁶²²³Nachdem der Druckwert protokolliert wurde, wird das Ventil geöffnet, bis die Anzeige wieder auf null steht. Danach wird das Ventil geschlossen;
- —
- dieses Verfahren ist mit den übrigen Flaschen zu wiederholen;
- —
- anschließend wird das gesamte Verfahren mit 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml und 50 ml Luft wiederholt;
- —
- die Kurve der umgerechneten Druckwerte (Pa) wird bezogen auf das injizierte Gasvolumen Vb (ml) grafisch dargestellt. Das Messgerät reagiert im Bereich von 0-70 000 Pa und bei einer Gasproduktion von 0-50 ml linear.
Anlage 3Beispiel einer Abbaukurve (Kumulativer Netto-Druckanstieg)
 Anlage 4Datenblätter zur Prüfung der anaeroben biologischen Abbaubarkeit (Beispiel) — Datenblatt zum Prüfstoff
| Labor: … | Prüfstoff: … | Test Nr.: … | | Prüftemperatur: (°C): … | Volumen des Gasraums (Vh): …(l) | Volumen der Flüssigkeit (Vl): …(l) | | Kohlenstoff im Prüfstoff Cc,v: …(mg/l) | mv: …(mg) | | | Tag | p1 (Test)(mbar)
| p2 (Test)(mbar)
| p3 (Test)(mbar)
| p (Test)Mittelwert
(mbar)
| p4 (Blind)(mbar)
| p5 (Blind)(mbar)
| p6 (Blind)(mbar)
| p (Blind)Mittelwert
(mbar)
| p (Netto)Test — Blindkontrolle
Mittelwert (mbar)
| Δp (Netto)Kumulativ
(mbar)
| mhKohlenstoff im Gasraum, C
(mg)
| DhBiologischer Abbau
(%)
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CIC, 1Prüfung
(mg)
| CIC, 2Prüfung
(mg)
| CIC, 3Prüfung
(mg)
| CICMittelwert Prüfung
(mg)
| CIC, 4Blindkontrolle
(mg)
| CIC, 5Blindkontrolle
(mg)
| CIC, 6Blindkontrolle
(mg)
| CICMittelwert Blindkontrolle
(mg)
| CIC, netTest — Blindkontrolle
Mittelwert
(mg)
| mlFlüssiger Kohlenstoff
(mg)
| MTKohlenstoff insgesamt
(mg)
| DtBiologischer Abbau
(%)
| | Anorganischer Kohlenstoff (Ende) | | | | | | | | | | | | | | pH-Wert (Ende) | | | | | | | | | | | | |
| Labor: … | Referenzstoff: … | Test Nr.: … | | Testtemperatur: (°C): … | Volumen des Gasraums (Vh): …(l) | Volumen der Flüssigkeit (Vl) (l): … | | Kohlenstoff im Prüfstoff Cc,v (mg/l): … | mv (mg): | | | Tag | p1 (Ref.)(mbar)
| p2 (Ref.)(mbar)
| p3 (Ref.)(mbar)
| p (Ref.)Mittelwert
(mbar)
| p4 (Inhib.)(mbar)
| p5 (Inhib.)(mbar)
| p6 (Inhib.)(mbar)
| p (Inhib.)Mittelwert
(mbar)
| p (Ref.)Ref. — Blind
(mbar)
| Δp (Ref.)Kumulativ
(mbar)
| MHKohlenstoff im Gasraum, C
(mg)
| DhBiologischer Abbau
(%)
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CIC, 1Ref.
(mg)
| CIC, 2Ref.
(mg)
| CIC, 3Ref.
(mg)
| CICMittelwerte Ref.
(mg)
| CIC, 4Inhib.
(mg)
| CIC, 5Inhib.
(mg)
| CIC, 6Inhib.
(mg)
| CICMittelwerte Inhib.
(mg)
| CIC, netRef. — Inhib.
(mg)
| mlFlüssiger Kohlenstoff
(mg)
| MTKohlenstoff insgesamt
(mg)
| DtBiologischer Abbau
(%)
| | Anorganischer Kohlenstoff (Ende) | | | | | | | | | | | | | | pH-Wert (Ende) | | | | | | | | | | | | |
C.44. VERSICKERUNG IN BODENSÄULENEINLEITUNG
| 1. | ⁶²²⁷Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 312 (2004). ⁶²²⁸Synthetisch hergestellte Chemikalien können durch bewusste Ausbringung (z. B. Agrochemikalien) oder über indirekte Wege (z. B. Abwasser → Klärschlamm → Boden oder Luft → feuchte/trockene Deposition) in den Boden gelangen. ⁶²²⁹Für eine Bewertung des mit diesen Chemikalien verbundenen Risikos müssen das Potenzial der Chemikalien zur Transformation und zur Verlagerung in tiefere Bodenschichten sowie eventuell das Eindringen in das Grundwasser ermittelt werden. |
| 2. | Das Versickerungspotenzial von Chemikalien im Boden kann unter kontrollierten Laborbedingungen mit verschiedenen Verfahren ermittelt werden (Dünnschichtchromatographie, Dickschichtchromatographie, Bodensäulenchromatographie und Adsorptions-/Desorptionsmessungen) (1)(2). Bei nicht ionisierten Chemikalien ermöglicht der n-Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (Pow) eine frühzeitige Abschätzung des Adsorptionsverhaltens und des Versickerungspotenzials (3)(4)(5). |
| 3. | ⁶²³¹Das in dieser Prüfmethode beschriebene Verfahren beruht auf der Bodensäulenchromatographie mit gestörten Böden (zur Begriffsbestimmung siehe Anlage 1). Das Versickerungspotenzial (i) des Prüfstoffs und (ii) von Transformationsprodukten (Untersuchung mit gealterten Rückständen) von Böden unter kontrollieren Laborbedingungen wurde mit zwei Testtypen ermittelt. ⁶²³²Die Prüfmethode beruht auf bestehenden Methoden (6)(7)(8)(9)(10)(11). |
| 4. | ⁶²³³In einem OECD-Workshop zur Auswahl von Böden/Sedimenten, der 1995 in Belgirate, Italien (12) stattfand, wurde eine Einigung über Anzahl und Typ der für diese Prüfmethode zu verwendenden Böden erzielt. ⁶²³⁴Außerdem wurden Empfehlungen bezüglich der Entnahme, Handhabung und Lagerung von Bodenproben für Versickerungstests formuliert. |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 5. | ⁶²³⁵Säulen aus geeignetem inertem Material (Glas, Edelstahl, Aluminium, Teflon, PVC usw.) werden mit Bodenmaterial gepackt. ⁶²³⁶Anschließend wird die Packung mit einer künstlichen Regenlösung (Begriffsbestimmung siehe Anlage 1) gesättigt und äquilibriert bis ein Gleichgewicht hergestellt und die überschüssige Flüssigkeit abgelaufen ist. ⁶²³⁷Danach wird die Oberfläche der Bodensäulen jeweils mit der Prüfchemikalie und/oder mit gealterten Rückständen der Prüfchemikalie behandelt. ⁶²³⁸Die Bodensäulen werden künstlich beregnet, und das Sickerwasser wird aufgefangen. ⁶²³⁹Nach dem Versickerungsprozess wird der Boden aus den Säulen entnommen und je nach den zu untersuchenden Merkmalen in eine geeignete Anzahl an Bodensegmenten geteilt. ⁶²⁴⁰Diese Bodensegmente und das Sickerwasser werden auf Rückstände der Prüfchemikalie sowie gegebenenfalls auf Transformationsprodukte oder sonstige relevante Chemikalien untersucht. |
ANWENDBARKEIT DER PRÜFMETHODE | 6. | ⁶²⁴¹Die Prüfmethode kann bei (nicht markierten oder radioaktiv (etwa mit 14C) markierten) Prüfchemikalien verwendet werden, für die eine hinreichend genaue und empfindliche Analysemethode verfügbar ist. ⁶²⁴²Für Chemikalien, die sich aus dem Boden und aus Wasser verflüchtigen und somit unter den Bedingungen dieser Prüfmethode nicht im Boden und/oder im Sickerwasser verbleiben, ist die Methode nicht geeignet. |
INFORMATIONEN ZUR PRÜFCHEMIKALIE | 7. | ⁶²⁴³Zur Messung des Versickerungsverhaltens in Bodensäulen können nicht markierte oder radioaktiv markierte Prüfchemikalien verwendet werden. ⁶²⁴⁴Um das Versickerungsverhalten von Transformationsprodukten (gealterten Rückständen des Prüfstoffs) zu untersuchen und um die Massenbilanz zu ermitteln, wird radioaktiv markiertes Material benötigt. Die Markierung mit 14C wird empfohlen; es können aber auch andere Isotope (z. B. 13C, 15N, 3H oder 32P) verwendet werden. ⁶²⁴⁵Nach Möglichkeit ist die Markierung im stabilsten Teil (in den stabilsten Teilen) des jeweiligen Moleküls zu setzen. ⁶²⁴⁶Die Prüfchemikalie muss eine Reinheit von mindestens 95 % haben. |
| 8. | ⁶²⁴⁷Die meisten Chemikalien sollten in reiner Form appliziert werden. ⁶²⁴⁸Nur bei Wirkstoffen von Pflanzenschutzmitteln können die fertigen Produkte zur Untersuchung des Versickerungsverhaltens des Ausgangsprüfstoffes verwendet werden. ⁶²⁴⁹Dies ist besonders dann empfehlenswert, wenn das jeweilige Produkt die Freisetzungsrate des zu untersuchenden Prüfstoffs beeinflussen kann (z. B. Granulate oder Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung). ⁶²⁵⁰Bezüglich der für die betreffende Formulierung spezifischen Anforderungen an das jeweilige Prüfprotokoll kann es hilfreich sein, sich vor Durchführung einer Prüfung bei der zuständigen Behörde zu erkundigen. ⁶²⁵¹Bei Versickerungstests mit gealterten Rückständen ist der Ausgangsprüfstoff in reiner Form zu verwenden. |
| 9. | Vor der Durchführung von Versickerungstests mit Bodensäulen sollten die folgenden Informationen zur Prüfchemikalie verfügbar sein:| (1) | Löslichkeit in Wasser [Prüfmethode A.6] (13); |
| (2) | Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln; |
| (3) | Dampfdruck [Prüfmethode A.4] (13) und Henry-Konstante; |
| (4) | n-Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient [Prüfmethoden A.8 und A.24] (13); |
| (5) | Adsorptionskoeffizient (Kd, Kf oder KOC) [Prüfmethoden C.18 und/oder C.19] (13); |
| (6) | Hydrolyse [Prüfmethode C.7] (13); |
| (7) | Dissoziationskonstante (pKa) [OECD-Prüfrichtlinie 112] (25); |
| (8) | aerobe und anaerobe Transformation im Boden [Prüfmethode C.23] (13). |
Hinweis: Die Temperatur, bei der diese Messungen vorgenommen wurden, ist in den jeweiligen Prüfprotokollen zu vermerken. |
| 10. | ⁶²⁵⁴Die Prüfchemikalie ist in hinreichender Menge in die Bodensäulen einzubringen, um in den einzelnen Segmenten mindestens 0,5 % der eingebrachten Dosierung nachweisen zu können. ⁶²⁵⁵Bei Wirkstoffen in Pflanzenschutzmitteln kann die Menge der eingebrachten Prüfchemikalie der für die Verwendung des Produktes empfohlenen maximalen Aufwandmenge entsprechen (einmalige Applikation). |
| 11. | ⁶²⁵⁶Zur Quantifizierung der Prüfchemikalie sowie gegebenenfalls ihrer Transformationsprodukte im Boden und im Sickerwasser muss eine geeignete Analysemethode mit bekannter Genauigkeit, Präzision und Empfindlichkeit verfügbar sein. ⁶²⁵⁷Die analytische Nachweisgrenze für die Prüfchemikalie und ihrer wesentlichen Transformationsprodukte (im Allgemeinen mindestens alle Transformationsprodukte, die in Konzentrationen von ≥ 10 % der applizierten Aufwandmenge in Abbaustudien nachgewiesen wurden, vorzugsweise aber alle relevanten Transformationsprodukte) sollten bekannt sein (siehe Nummer 17). |
REFERENZCHEMIKALIEN | 12. | ⁶²⁵⁸Zur Bewertung der relativen Mobilität der Prüfchemikalie im Boden werden Referenzchemikalien mit bekanntem Versickerungsverhalten (z. B. Atrazin oder Monuron) verwendet, von denen aus praktischen Erfahrungen bekannt ist, dass sie in mäßigem Umfang versickern (1)(8)(11). ⁶²⁵⁹Eine nicht sorbierende und nicht abbaubare polare Referenzchemikalie (z. B. Tritium, Bromid, Fluoreszein oder Eosin) zur Nachverfolgung des Wassertransports in der Säule kann hilfreich sein, um die hydrodynamischen Eigenschaften der Bodensäule zu ermitteln. |
| 13. | Chemikalien in Analysequalität können verwendet werden, um durch Chromatographie, Spektroskopie oder sonstige geeignete Verfahren Transformationsprodukte zu beschreiben und/oder zu identifizieren, die in den Bodensegmenten und im Sickerwasser enthalten sind. |
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN UND EINHEITENQUALITÄTSKRITERIENWiederfindung
| 15. | ⁶²⁶¹Im Versickerungstest ist die Summe der Prozentanteile der Prüfchemikalie, die nach der Versickerung in den Bodensegmenten und im Sickerwasser der Säulen nachgewiesen wird, als Wiederfindungsrate zu betrachten. ⁶²⁶²Die Wiederfindungsraten müssen bei radioaktiv markierten Substanzen bei 90-110 % (11) und bei nicht markierten Substanzen bei 70-110 % liegen (8). |
Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der Analysemethode | 16. | Die Wiederholbarkeit der Analysemethode zur Quantifizierung der Prüfchemikalie und der Transformationsprodukte kann durch erneute Analyse desselben Extrakts eines Bodensegments oder des betreffenden Sickerwassers geprüft werden (siehe Nummer 11). |
| 17. | ⁶²⁶⁴Die Nachweisgrenze (LOD) der Methode zur Analyse der Prüfchemikalie und der Transformationsprodukte muss bei den einzelnen Bodensegmenten und im Sickerwasser (als Prüfchemikalie) jeweils mindestens 0,01 mg · kg– 1 oder 0,5 % der in die einzelnen Segmente eingebrachten Dosis betragen; maßgeblich ist der jeweils niedrigere Wert. ⁶²⁶⁵Der Quantifizierungsgrenze (LOQ) ist ebenfalls zu bestimmen. |
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODEPrüfsystem
| 18. | ⁶²⁶⁶Für die Prüfung werden Bodensäulen (teilbar und unteilbar) aus geeignetem inertem Material (Glas, Edelstahl, Aluminium, Teflon, PVC usw.) mit einem Innendurchmesser von mindestens 4 cm und einer Mindesthöhe von 35 cm verwendet. ⁶²⁶⁷Das Säulenmaterial ist auf potenzielle Wechselwirkungen mit der Prüfchemikalie und/oder mit Transformationsprodukten der Prüfchemikalie zu testen. ⁶²⁶⁸In Anlage 2 werden einige geeignete teilbare und nicht teilbare Säulen beschrieben. |
| 19. | Zum Füllen und Packen der Bodensäulen sind Löffel, Kolben und Vibrationsvorrichtungen zu verwenden. |
| 20. | Zur Einbringung der künstlichen Beregnung in die Bodensäulen können Kolbenpumpen, peristaltische Pumpen, Brauseköpfe, Mariottesche Flaschen oder einfache Tropftrichter verwendet werden. |
Laborausrüstung und Chemikalien | 21. | Es wird die übliche Laborausrüstung insbesondere mit folgenden Bestandteilen benötigt:| (1) | Analysegeräte (u. a. GLC-, HPLC- und TLC-Ausrüstung) einschließlich geeigneter Nachweissysteme zur Analyse markierter oder nicht markierter Chemikalien oder zur Analyse mit der inversen Isotopenverdünnungsmethode; |
| (2) | Bestimmungsgeräte (MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR usw.); |
| (3) | Flüssigszintillationszähler für nicht radioaktiv markierte Prüfchemikalien; |
| (4) | Oxidationsmittel zur Verbrennung von markiertem Material; |
| (5) | Extraktionsgerät (z. B. Zentrifugenröhrchen zur Kaltextraktion und Soxhlet-Apparat zur kontinuierlichen Extraktion unter Rückfluss); |
| (6) | Geräte zur Konzentration von Lösungen und Extrakten (z. B. Rotationsverdampfer). |
|
| 22. | Folgende Chemikalien werden verwendet: organische Lösungsmittel in Analysequalität (Aceton, Methanol usw.); Szintillationsflüssigkeit: 0,01 M CaCl2-Lösung in destilliertem oder entionisiertem Wasser (= ‚künstlicher Regen‘). |
Prüfchemikalie | 23. | ⁶²⁷³Um die Prüfchemikalie in die Bodensäule einzubringen, wird der Stoff in (destilliertem oder entionisiertem) Wasser gelöst. ⁶²⁷⁴Wenn die Prüfchemikalie in Wasser schlecht löslich ist, kann sie entweder als fertige Formulierung (erforderlichenfalls nach Suspension oder Emulgierung in Wasser) aufgebracht werden, oder die Applikation kann in einem beliebigen organischen Lösungsmittel erfolgen. ⁶²⁷⁵Soweit überhaupt verwendet, sind organische Lösungsmittel auf ein Minimum zu begrenzen und vor Beginn des Versickerungsprozesses von der Oberfläche des Bodenmaterials zu verdampfen. ⁶²⁷⁶Feste Zubereitungen (z. B. Granulate) werden in fester Form ohne Wasser in die Säulen gegeben. ⁶²⁷⁷Um die Verteilung der Materialien über die Oberfläche der Bodensäule zu unterstützen, können die formulierten Produkte vor der Applikation mit einem geringen Anteil an Quarzsand (z. B. 1 g) gemischt werden. |
| 24. | Die Prüfchemikalie ist in hinreichender Menge in die Bodensäulen einzubringen, um mindestens 0,5 % der applizierten Dosis in den einzelnen Segmenten nachweisen zu können. Bei Wirkstoffen von Pflanzenschutzmitteln kann die applizierte Dosis auf Basis der empfohlenen maximalen Aufwandmenge (Einzelapplikation) erfolgen und sowohl für den Wirkstoff als auch für gealterte Wirkstoffe sollte sich die applizierte Menge auf die Oberfläche der verwendeten Bodensäule beziehen. |
Referenzchemikalie | 25. | ⁶²⁷⁹In den Versickerungsstests ist eine Referenzchemikalie zu verwenden (siehe Nummer 12). ⁶²⁸⁰Die Referenzchemikalie ist in ähnlicher Weise wie die Prüfchemikalie auf die Oberfläche der Bodensäule aufzubringen und in ausreichender Menge, um eine angemessene Nachweisgenauigkeit entweder als interner Standard zusammen mit der Prüfchemikalie in derselben Bodensäule oder separat in einer eigenen Bodensäule zu gewährleisten. ⁶²⁸¹Vorzugsweise werden beide Chemikalien gemeinsam in derselben Säule zur Versickerung gebracht, außer wenn beide Chemikalien ähnlich markiert wurden. |
BödenAuswahl der Böden
| 26. | ⁶²⁸²Für die Versickerungsuntersuchungen mit der Ausgangsprüfchemikalie werden 3 bis 4 Böden mit unterschiedlichen pH-Werten, Anteilen an organischen Kohlenstoffen und Texturen verwendet (12). ⁶²⁸³Die folgende Tabelle 1 enthält Leitlinien zur Auswahl von Böden für Versickerungsstudien. ⁶²⁸⁴Bei ionisierbaren Prüfchemikalien müssen die ausgewählten Böden ein breites Spektrum an pH-Werten abdecken, damit die Mobilität der Chemikalien in ionisierter und in nicht ionisierter Form beurteilt werden kann. ⁶²⁸⁵Mindestens 3 Böden müssen einen pH-Wert aufweisen, bei dem die Prüfchemikalie in mobiler Form vorliegt.Tabelle 1
Leitlinien zur Auswahl von Böden für Versickerungsstudien
| Boden Nr. | pH-Wert | Organischer Kohlenstoff%
| Tonanteil%
| Textur | | 1 | > 7,5 | 3,5 - 5,0 | 20 - 40 | lehmiger Tonboden | | 2 | 5,5 - 7,0 | 1,5 - 3,0 | 15 - 25 | lehmiger Schluff | | 3 | 4,0 - 5,5 | 3,0 - 4,0 | 15 - 30 | Lehm | | 4 | < 4,0 - 6,0 | < 0,5 - 1,5 (57) | < 10 - 15 (57) | lehmiger Sand | | 5 | < 4,5 | > 10 | < 10 | lehmiger Sand/Sand |
|
| 27. | ⁶²⁸⁶Manchmal sind andere Bodentypen erforderlich, wenn die Gegebenheiten in kühleren, gemäßigten oder tropischen Regionen nachgebildet werden sollen. ⁶²⁸⁷Wenn andere Bodentypen bevorzugt werden, müssen diese daher denselben Parametern entsprechen und sollten sich in ihren Merkmalen in ähnlicher Weise unterscheiden wie die in den Leitlinien zur Auswahl von Böden für Versickerungsstudien (siehe vorstehende Tabelle 1) beschriebenen Böden. ⁶²⁸⁸Dies gilt auch dann, wenn die betreffenden Kriterien nicht genau erfüllt werden. |
| 28. | ⁶²⁸⁹Bei Versickerungstests mit ‚gealterten Rückständen‘ ist eine Bodenprobe (12) mit einem Sandanteil von > 70 % und einem Anteil von 0,5-1,5 % an organischen Kohlenstoffen zu verwenden (z. B. Boden Nr. 4 in Tabelle 1). ⁶²⁹⁰Wenn Daten zu den Transformationsprodukten hohe Bedeutung zukommt, müssen unter Umständen mehr Bodentypen verwendet werden. |
| 29. | ⁶²⁹¹Alle Böden sind mindestens hinsichtlich ihrer Textur ( % Sand, % Schluff, % Ton nach FAO- und USDA-Klassifizierung (14)), des pH-Werts, der Kationenaustauschkapazität, des Anteils an organischen Kohlenstoffen, der Schüttdichte (bei gestörten Böden) und der Wasserrückhaltefähigkeit zu beschreiben. ⁶²⁹²Die mikrobielle Biomasse muss nur für die Böden bestimmt werden, die während der Alterungs-/Inkubationsphase vor dem Versickerungstest mit den gealterten Rückständen verwendet werden. ⁶²⁹³Angaben zu weiteren Eigenschaften der Böden (z. B. Klassifizierung, Tonmineralogie, spezifische Oberfläche) können bei der Interpretation der Prüfergebnisse hilfreich sein. ⁶²⁹⁴Zur Bestimmung der Bodenbeschaffenheit können die in den Quellen (15)(16)(17)(18)(19) empfohlenen Methoden verwendet werden. |
Entnahme und Lagerung der Böden | 30. | ⁶²⁹⁵Die Böden sind aus der oberen Schicht (A-Horizont) bis zu einer Tiefe von höchstens 20 cm zu entnehmen. ⁶²⁹⁶Pflanzenrückstände, Makrofauna und Steine sind zu entfernen. ⁶²⁹⁷Die Böden (mit Ausnahme der zur Alterung der Prüfchemikalie verwendeten Böden) werden bei Raumtemperatur (vorzugsweise 20-25 °C) an der Luft getrocknet. ⁶²⁹⁸Die Zerkleinerung des Materials ist unter möglichst geringem Kraftaufwand vorzunehmen, damit die ursprüngliche Textur des Bodens möglichst wenig verändert wird. ⁶²⁹⁹Die Böden werden mit einem Sieb mit einer Maschenweite von ≤ 2 mm gesiebt. ⁶³⁰⁰Eine sorgfältige Homogenisierung ist zu empfehlen, da dadurch die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse verbessert wird. ⁶³⁰¹Vor der Verwendung können die Böden bei Raumtemperatur und lufttrocken aufbewahrt werden; (12). ⁶³⁰²Zur Lagerfähigkeit werden keine Empfehlungen abgegeben; Böden, die aber länger als drei Jahre gelagert wurden, sollten vor der Verwendung nochmals auf ihren Gehalt an organischen Kohlenstoffen und auf ihren pH-Wert untersucht werden. |
| 31. | ⁶³⁰³Zur Historie der Feldstandorte, an denen die Prüfböden entnommen wurden, sollten detaillierte Informationen verfügbar sein. ⁶³⁰⁴Zu diesen Informationen zählen die genaue Lage (exakt definiert durch UTM (Universale Transversale Mercator-Projektion/European Horizontal Datum) oder geografische Koordinaten) sowie Bewuchs, Behandlungen mit Pestiziden, Behandlungen mit organischen und anorganischen Düngemitteln, biologische Anlagerungen oder unfallbedingte Verschmutzungen (12). ⁶³⁰⁵Böden, die in den letzten vier Jahren mit der Prüfchemikalie oder mit strukturell analogen Stoffen behandelt wurden, dürfen für Versickerungsstudien nicht verwendet werden. |
Prüfbedingungen | 32. | ⁶³⁰⁶Während der Prüfung werden die Versickerungssäulen bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt; wichtig ist, dass eine konstante Raumtemperatur (± 2 °C) besteht. ⁶³⁰⁷Zu empfehlen sind Temperaturen zwischen 18 und 25 °C. |
| 33. | ⁶³⁰⁸Die Oberfläche der Bodensäulen ist kontinuierlich mit künstlichem Regen (0,01 M CaCl2, 200 mm innerhalb von 48 Stunden) zu beregnen; diese Beregnungsmenge entspricht einem Niederschlag von 251 ml bei einer Wassersäule mit einem Innendurchmesser von 4 cm. ⁶³⁰⁹Wenn für die Prüfung benötigt, kann die künstliche Beregnung modifiziert und die Dauer der Beregnung erhöht werden. |
PrüfverfahrenVersickerung mit der Ausgangsprüfchemikalie
| 34. | ⁶³¹⁰Mindestens zwei Bodensäulen werden bis zu einer Höhe von etwa 30 cm mit unbehandeltem, luftgetrockneten und (mit einer Maschenweite von < 2 mm) gesiebtem Bodenmaterial gefüllt. ⁶³¹¹Um eine einheitliche Packung herzustellen, wird der Boden in kleinen Anteilen mit einem Löffel in die Säulen gegeben und mit einem Kolben unter leichtem Vibrieren der Säule verdichtet, bis die Bodensäule nicht mehr weiter nachgibt. ⁶³¹²Diese einheitliche Packung wird benötigt, um mit den Bodensäulen reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. ⁶³¹³Nähere Informationen zu Verfahren zum Packen der Säulen sind den Quellen (20), (21) und (22) zu entnehmen. Um die Reproduzierbarkeit des Packungsvorgangs kontrollieren zu können, wird das Gesamtgewicht der in die Säulen gepackten Böden ermittelt. ⁶³¹⁴Die beiden verwendeten Säulen müssen ein ähnliches Gewicht haben. |
| 35. | ⁶³¹⁵Nach dem Packen werden die Bodensäulen mit künstlichem Regen (0,01 M CaCl2) von unten nach oben gesättigt, um in den Bodenporen vorhandene Luft durch Wasser zu verdrängen. ⁶³¹⁶Anschließend wird gewartet, bis die Säulen im Gleichgewicht sind und das überschüssige Wasser abgelaufen ist. ⁶³¹⁷Methoden zur Sättigung der Säulen werden in (23) erläutert. |
| 36. | ⁶³¹⁸Anschließend werden die Prüfchemikalie und/oder die Referenzchemikalie in die Bodensäulen gegeben (siehe auch Nummern 23-25). ⁶³¹⁹Um eine homogene Verteilung zu erreichen, werden die Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen der Prüfchemikalie und/oder der Referenzchemikalie gleichmäßig auf die Oberfläche der Bodensäulen aufgebracht. ⁶³²⁰Wenn eine Einarbeitung in den Boden empfohlen wird, ist die Prüfchemikalie zunächst in eine geringe Menge (z. B. 20 g) des Bodens zu mischen und auf die Oberfläche der Bodensäule zu bringen. |
| 37. | ⁶³²¹Danach werden die Oberflächen der Bodensäulen mit einer Glassinterplatte, Glasperlen, Glasfaserfiltern oder einem runden Filterpapier bedeckt, damit der künstliche Regen gleichmäßig über die gesamte Fläche verteilt und die Oberfläche des Bodens nicht durch die Beregnungstropfen gestört wird. ⁶³²²Je größer der Durchmesser der Säule, desto sorgfältiger ist bei der künstlichen Beregnung der Bodensäulen vorzugehen, um eine gleichmäßige Verteilung des künstlichen Regens über die gesamte Bodenfläche sicherzustellen. ⁶³²³Der künstliche Regen wird danach mit einer Kolbenpumpe, einer peristaltischen Pumpe oder einem Tropftrichter auf die Bodensäulen getropft. Das Sickerwasser ist vorzugsweise in Fraktionen aufzufangen; die jeweiligen Mengen sind zu protokollieren. |
| 38. | ⁶³²⁴Nach der Versickerung und dem Abtropfen der Säulen werden die Bodensäulen je nach den gemäß der Studie benötigten Informationen in eine geeignete Anzahl an Segmenten geteilt; die Segmente werden mit geeigneten Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen extrahiert und auf die Prüfchemikalie sowie ggf. ⁶³²⁵auf Transformationsprodukte, die Gesamt-Radioaktivität und die Referenzchemikalie analysiert. ⁶³²⁶Das Sickerwasser bzw. die Sickerwasserfraktionen werden unmittelbar nach der Extraktion auf die genannten Produkte untersucht. ⁶³²⁷Wenn radioaktiv markierte Prüfchemikalien verwendet werden, sind alle Fraktionen mit ≥ 10 % der eingebrachten Radioaktivität zu ermitteln. |
Auswaschen bei gealterten Rückständen | 39. | ⁶³²⁸Frischer Boden (nicht zuvor luftgetrocknet) wird mit einer der Oberfläche der Bodensäulen angepassten Menge der radioaktiv markierten Prüfchemikalie (siehe Nummer 24) behandelt und unter aeroben Bedingungen gemäß Prüfmethode C.23 inkubiert (13). Die Inkubationsdauer (Alterungsdauer) muss so lang sein, dass erhebliche Mengen an Transformationsprodukten entstehen können; zu empfehlen ist eine Alterung über die Halbwertszeit der jeweiligen Prüfchemikalie; eine Dauer von 120 Tagen sollte aber nicht überschritten werden. ⁶³²⁹Vor der Versickerung wird der gealterte Boden auf die Prüfchemikalie und ihre Transformationsprodukte analysiert. |
| 40. | ⁶³³⁰Die Versickerungssäulen werden bis zu einer Höhe von 28 cm mit dem gleichen Boden (allerdings luftgetrocknet) wie im Alterungstest (siehe Nummer 34) gepackt; anschließend wird das Gesamtgewicht der gepackten Bodensäulen bestimmt. ⁶³³¹Danach werden die Bodensäulen vorgefeuchtet, wie in Nummer 35 erläutert. |
| 41. | ⁶³³²Die Prüfchemikalie und ihre Transformationsprodukte werden in Form von gealterten Bodenrückständen (siehe Nummer 39) als 2 cm starkes Bodensegment auf die Oberfläche der Bodensäulen gebracht. ⁶³³³Die Gesamthöhe der Bodensäulen (unbehandelter Boden + gealterter Boden) sollte nicht mehr als 30 cm betragen (siehe Nummer 34). |
| 42. | Die Versickerung wird vorgenommen, wie in Nummer 37 beschrieben. |
| 43. | ⁶³³⁵Nach der Versickerung werden die Bodensegmente und das Sickerwasser auf die Prüfchemikalie, ihre Transformationsprodukte und nicht extrahierte Radioaktivität untersucht, wie in Nummer 38 erläutert. ⁶³³⁶Um zu ermitteln, welcher Anteil der gealterten Rückstände in der obersten 2 cm starken Bodenschicht nach der Versickerung noch vorhanden ist, wird dieses Segment getrennt analysiert. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 44. | ⁶³³⁷Die Anteile der Prüfchemikalie, der Transformationsprodukte und der nicht extrahierbaren radioaktiven Bestandteile sowie — wenn vorhanden — der Referenzchemikalie werden in Prozent bezogen auf die Ausgangsdosis der einzelnen Bodensegmente und der Sickerwasserfraktion angegeben. ⁶³³⁸Für jede Säule werden die ermittelten Prozentanteile bezogen auf die jeweilige Bodentiefe grafisch dargestellt. |
| 45. | ⁶³³⁹Wenn bei den Versickerungstests eine Referenzchemikalie verwendet wurde, kann die Versickerung der Referenzchemikalie auf einer relativen Skala anhand von relativen Mobilitätsfaktoren (RMF; Begriffsbestimmung siehe Anlage 3) bestimmt werden (1)(11); die RMF ermöglichen einen Vergleich der Versickerungsdaten verschiedener Chemikalien bei unterschiedlichen Bodentypen. ⁶³⁴⁰Anlage 3 enthält Beispiele für RMF-Werte verschiedener Wirkstoffe in Pflanzenschutzmitteln. |
| 46. | ⁶³⁴¹Ungefähre Werte für Koc (auf organischen Kohlenstoff normalisierter Adsorptionskoeffizient) und Kom (auf organische Bestandteile normalisierter Verteilungskoeffizient) können ebenfalls aus den Ergebnissen des Versickerungstests abgeleitet werden; Ausgangsparameter sind die durchschnittliche Versickerungsstrecke oder festgestellte Korrelationen zwischen dem RMF und Kom bzw. Koc (4); alternativ kann von allgemeinen theoretischen Prinzipien der Chromatographie ausgegangen werden (24). ⁶³⁴²Der letztgenannte Ansatz ist jedoch mit Vorsicht zu bewerten, insbesondere wenn das verwendete System während der Versickerung eher nicht gesättigt war. |
Interpretation der Ergebnisse | 47. | ⁶³⁴³Die bei dieser Methode beschriebenen Versickerungstests mit Bodensäulen ermöglichen die Ermittlung des Versickerungs- oder des Mobilitätspotenzials der Prüfchemikalie (bei Versickerungstests mit Ausgangsstoffen) und/oder bei ihren Transformationsprodukten (bei Versickerungstests mit gealterten Rückständen) aus bzw. in Böden. ⁶³⁴⁴Aufgrund dieser Prüfungen können keine quantitativen Aussagen über das Versickerungsverhalten in der Natur getroffen werden; die Prüfungen können aber einen Maßstab für den Vergleich des ‚Versickerungsverhaltens‘ eines Stoffs mit anderen Stoffen bieten, deren Versickerungsverhalten vielleicht bereits bekannt ist (24). ⁶³⁴⁵Ebenso kann nicht ermittelt werden, welcher Prozentanteil des zugeführten Stoffs in das Grundwasser gelangen könnte (11). ⁶³⁴⁶Die Ergebnisse der Versickerungstests mit Bodensäulen können aber einen Anhaltspunkt dafür bieten, ob bei Chemikalien mit hohem Mobilitätspotenzial in Labortests weitere Halbfreiland- und Freilandstudien durchgeführt werden müssen. |
Prüfbericht | 48. | Der Prüfbericht enthält die folgenden Angaben: | Prüfchemikalie und Referenzchemikalie (sofern verwendet):- —
- Trivialname, chemische Bezeichnung (IUPAC- und CAS-Name), CAS-Nummer, chemische Struktur (Position der Markierung, wenn radioaktiv markiertes Material verwendet wurde) und maßgebliche physikalisch-chemische Merkmale;
- —
- Reinheit (Verunreinigungen) der Prüfchemikalie;
- —
- radiochemische Reinheit markierter Chemikalien und (ggf.) spezifische Aktivität.
|
| Im Test verwendete Böden:- —
- Beschreibung des Entnahmestandorts;
- —
- Merkmale des Bodens (pH-Wert, Gehalt an organischen Kohlenstoffen und an Ton, Textur und Schüttdichte (bei gestörten Böden));
- —
- mikrobiologische Aktivität (nur für Böden, die für die Alterung der Prüfchemikalie verwendet wurden);
- —
- Dauer der Lagerung des Bodens und Lagerbedingungen.
|
| Prüfbedingungen:- —
- Daten der Durchführung der Prüfungen;
- —
- Länge und Durchmesser der Versickerungssäulen;
- —
- Gesamtgewicht des Bodens in den Bodensäulen;
- —
- Menge der Prüfchemikalie und ggf. der Referenzchemikalie;
- —
- Umfang, Häufigkeit und Dauer der künstlichen Beregnung;
- —
- Temperatur des Versuchsaufbaus;
- —
- Anzahl der Replikate (mindestens zwei);
- —
- Methoden zur Analyse der Prüfchemikalie, der Transformationsprodukte und ggf. der Referenzchemikalie in den verschiedenen Bodensegmenten und Sickerwasserproben;
- —
- Methoden zur Beschreibung und Identifizierung von Transformationsprodukten in den Bodensegmenten und im Sickerwasser.
|
| Prüfergebnisse:- —
- Tabellen mit den Testergebnissen, ausgedrückt als Konzentrationen und als Prozentanteile der zugeführten Dosis für Bodensegmente und Sickerwasser;
- —
- Massenbilanz (ggf.);
- —
- Sickerwasservolumen;
- —
- Versickerungsstrecke und ggf. relative Mobilitätsfaktoren;
- —
- grafische Darstellung der ermittelten Prozentanteile in den Bodensegmenten bezogen auf die Tiefe der Bodensegmente;
- —
- Diskussion und Interpretation der Ergebnisse.
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|
LITERATUR | (1) | Guth, J.A., Burkhard, N., und Eberle, D.O. (1976). ⁶³⁵⁵Experimental Models for Studying the Persistence of Pesticides in Soil. Proc. ⁶³⁵⁶BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides. |
| (2) | Russel, M.H. (1995). ⁶³⁵⁸Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil. ⁶³⁵⁹In progress in Pesticide Biochemistry and Toxicology, Vol. ⁶³⁶⁰9 (Environmental Behaviour of Agrochemicals — T.R. Roberts and P.C. Kearney, Hrsg.). J. ⁶³⁶¹Wiley & Sons. |
| (3) | Briggs, G.G. (1981). ⁶³⁶³Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficient, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J.Agric. ⁶³⁶⁴Food Chem. ⁶³⁶⁵29, 1050-1059. |
| (4) | Chiou, C.T., Porter, P.E., und Schmedding, D.W. (1983). ⁶³⁶⁷Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol. ⁶³⁶⁸17, 227-231. |
| (5) | Guth, J.A. (1983). ⁶³⁷⁰Untersuchungen zum Verhalten von Pflanzenschutzmitteln im Boden. Bull. ⁶³⁷¹Bodenkundliche Gesellschaft Schweiz 7, 26-33. |
| (6) | US-Environmental Protection Agency (1982). ⁶³⁷³Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. ⁶³⁷⁴Chemistry: Environmental Fate. |
| (7) | Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada. |
| (9) | Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). ⁶³⁷⁸Application for registration of a pesticide. ⁶³⁷⁹Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. |
| (10) | BBA (1986). ⁶³⁸¹Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-2. ⁶³⁸²Versickerungsverhalten von Pflanzenschutzmitteln. |
| (11) | SETAC (1995). ⁶³⁸⁴Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. ⁶³⁸⁵Lynch, Ed. |
| (12) | OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italien, 18.-20. Januar 1995. |
| (13) | Die folgenden Kapital in diesem Anhang: | Kapitel A.6, Wasserlöslichkeit |
| Kapitel A.8, Verteilungskoeffizient, Schüttelmethode |
| Kapitel A.24, Verteilungskoeffizient, HPLC-Methode |
| Kapitel C.7, Abbaubarkeit — abiotischer Abbau: Hydrolyse in Abhängigkeit vom pH |
| Kapitel C.18, Adsorption/Desorption nach einer Schüttelmethode |
| Kapitel C.23, Aerobe und anaerobe Transformation im Boden |
|
| (14) | Soil Texture Classification (US and FAO systems). ⁶³⁸⁸Weed Science, 33, Suppl. ⁶³⁸⁹1 (1985) und Soil Sci. Soc. Amer. Proc. ⁶³⁹⁰26, 305 (1962). |
| (15) | Methods of Soil Analysis (19821986). ⁶³⁹²Part 2, Chemical1, Physical and Microbiological PropertiesMineralogical Methods (A.L. Page, R.H. Miller und D.R. Kelney, Eds Klute, Ed.). ⁶³⁹³Agronomy Series No. ⁶³⁹⁴9, 2nd Edition. |
| (16) | Methods of Soil Analysis (1982). ⁶³⁹⁶Part 2, Chemical and Microbiological Properties (A.L. Page, R.H. Miller und D.R. Kelney, Hrsg.). ⁶³⁹⁷Agronomy Series No. ⁶³⁹⁸9, 2nd Edition. |
| (17) | ISO Standard Compendium Environment (1994). ⁶⁴⁰⁰Soil Quality — General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. ⁶⁴⁰¹First Edition. |
| (18) | Mückenhausen, E. (1975). ⁶⁴⁰³Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. ⁶⁴⁰⁴DLG-Verlag, Frankfurt/Main. |
| (19) | Scheffer, F., und Schachtschabel, P. (1998). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. |
| (20) | Weber, J.B., und Peeper, T.F. (1977). ⁶⁴⁰⁸In Research Methods in Weed Science, 2nd Edition (B. ⁶⁴⁰⁹Truelove, Ed.). Soc. ⁶⁴¹⁰Weed Sci., Auburn, Alabama, 73-78. |
| (21) | Weber, J.B., Swain, L.R., Strek, H.J., und Sartori, J.L. (1986). ⁶⁴¹²In Research Methods in Weed Science, 3rd Edition (N.D. Camper, Ed.). Soc. ⁶⁴¹³Weed Sci., Champaign, IL, 190-200. |
| (22) | Oliveira, et al. (1996). ⁶⁴¹⁵Packing of sands for the production of homogeneous porous media. Soil Sci. Soc. ⁶⁴¹⁶Amer. J. 60(1): 49-53. |
| (23) | Shackelford, C. D. (1991). ⁶⁴¹⁸Laboratory diffusion testing for waste disposal. ⁶⁴¹⁹— A review. J. Contam. Hydrol. ⁶⁴²⁰7, 177-217. |
| (24) | Hamaker, J.W. (1975). ⁶⁴²²Interpretation of soil leaching experiments. ⁶⁴²³In Environmental Dynamics of Pesticides (R. ⁶⁴²⁴Haque, V.H. Freed, Hrsg.), 115-133. ⁶⁴²⁵Plenum Press, New York. |
| (25) | OECD (1981). ⁶⁴²⁷Dissociation constants in water. ⁶⁴²⁸OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. ⁶⁴²⁹4112, OECD, Paris |
Anlage 1Begriffsbestimmungen und Einheiten
Gealterte Bodenrückstände: Prüfchemikalie und Transformationsprodukte, die nach der Applikation und nach einem hinreichend langen Zeitraum für Transport-, Adsorptions-, Stoffwechsel- und Ableitungsprozesse zur Änderung der Verteilung und der chemischen Beschaffenheit eines Anteils des zugeführten Stoffs noch im Boden vorhanden sind (1).
Künstlicher Regen: 0,01 M CaCl2-Lösung in destilliertem oder entionisiertem Wasser.
Durchschnittliche Versickerungsstrecke (leaching distance): [normaler Versickerungstest] unterste Schicht des Bodensegments, in der die Summe des wiedergefundenen Stoffs 50 % der insgesamt wiedergefundenen Prüfchemikalie entspricht, oder: [Versickerungstest mit gealterten Rückständen] unterste Schicht des Bodensegments, in der die Summe der wiedergefundenen Chemikalie 50 % der insgesamt wiedergefundenen Prüfchemikalie entspricht — (Höhe der Schicht mit den gealterten Rückständen) / 2).
Chemikalie: ein Stoff oder ein Gemisch
Sickerwasser: wässrige Phase, die durch ein Bodenprofil oder eine Bodensäule gesickert ist (1).
Versickerung: Prozess, bei dem sich ein Stoff abwärts durch ein Bodenprofil oder eine Bodensäule bewegt (1).
Versickerungsstrecke: Unterstes Bodensegment, in dem nach der Versickerung eine Konzentration von ≥ 0,5 % der zugeführten Prüfchemikalie oder der gealterten Rückstände ermittelt wurde (entspricht der Eindringtiefe).
Nachweisgrenze (LOD = Limit of Detection) und Quantifizierungsgrenze (LOQ = Limit of Quantification): Als Nachweisgrenze (LOD) wird die Konzentration einer Chemikalie bezeichnet, unter der die Chemikalie nicht mehr von analytischen Artefakten unterschieden werden kann. Als Quantifizierungsgrenze (LOQ) gilt die Konzentration einer Chemikalie, unter der die Konzentration nicht mehr mit annehmbarer Genauigkeit bestimmt werden kann.
RMF, relativer Mobilitätsfaktor: (Versickerungsstrecke der Prüfchemikalie (cm)) / (Versickerungsstrecke der Referenzchemikalie (cm))
Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode getestet wird.
Transformationsprodukt: alle aus biotischen und abiotischen Transformationsreaktionen der Prüfchemikalie entstandenen Chemikalien einschließlich CO2 und der an Rückstände gebundenen Produkte.
Boden: ein Gemisch mineralischer und organisch-chemischer Bestandteile, wobei letztere Verbindungen mit hohem Kohlenstoff- und Stickstoffgehalt sowie einem hohen Molekulargewicht enthalten und mit kleinen (zumeist Mikro-)Organismen belebt sind; Boden kann in zwei Zustandsformen vorliegen:
- —
- nicht gestört, d. h. so, wie sie sich im Laufe der Zeit entwickelt haben, mit charakteristischen Schichten einer Vielzahl von Bodentypen;
- —
- gestört, d. h. so, wie die Böden gewöhnlich in bewirtschafteten Flächen vorkommen oder wie sie zur Verwendung bei dieser Prüfmethode durch Graben entnommen werden (2).
| (1) | Holland, P.T. (1996). ⁶⁴⁴¹Glossary of Terms Relating to Pesticides. ⁶⁴⁴²IUPAC Reports on Pesticide (36). ⁶⁴⁴³Pure & Appl. Chem. ⁶⁴⁴⁴68, 1167-1193. |
| (2) | OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (angenommen am 12. Mai 1981). |
Anlage 2Abbildung 1
Nicht teilbare Versickerungssäulen aus Glas (Beispiel);
Länge 35 cm, Innendurchmesser 5 cm (1)
 | (1) | Drescher, N. (1985). ⁶⁴⁴⁷Moderner Acker- und Pflanzenbau aus Sicht der Pflanzenschutzmittelindustrie. ⁶⁴⁴⁸In Unser Boden — 70 Jahre Agrarforschung der BASF AG, 225-236. ⁶⁴⁴⁹Verlag Wissenschaft und Politik, Köln. |
Abbildung 2Teilbare Metallsäule mit 4 cm Innendurchmesser (Beispiel) (1)
 | (1) | Burkhard, N., Eberle D.O., und Guth, J.A. (1975). ⁶⁴⁵¹Model systems for studying the environmental behaviour of pesticides. ⁶⁴⁵²Environmental Quality and Safety, Suppl. Vol. III, 203-213 |
Anlage 3Relative Mobilitätsfaktoren(RMF) der Chemikalien einiger Pflanzenschutzmittel (Beispiele) (1)(2) und entsprechende Mobilitätsklassen
| RMF-Bereich | Chemikalie (RMF) | Mobilitätsklasse | | ≤ 0,15 | Parathion (< 0,15), Flurodifen (0,15) | Iimmobil
| | 0,15 - 0,8 | Profenophos (0,18), Propiconazol (0,23), Diazinon (0,28), Diuron (0,38), Terbuthylazin (0,52), Methidathion (0,56), Prometryn (0,59), Propazin (0,64), Alachlor (0,66), Metolachlor (0,68) | IIleicht mobil
| | w 0,8 - 1,3 | Monuron (1,00), Atrazin (1,03), Simazin (1,04), Fluometuron (1,18) | IIImäßig mobil
| | 1,3 - 2,5 | Prometon (1,67), Cyanazin (1,85), Bromacil (1,91), Karbutilat (1,98) | IVverhältnismäßig mobil
| | 2,5 - 5,0 | Carbofuran (3,00), Dioxacarb (4,33) | Vmobil
| | > 5,0 | Monocrotophos (> 5,0), Dicrotophos (> 5,0) | VIsehr mobil
|
| (1) | Guth, J.A. (1985). ⁶⁴⁵³Adsorption/desorption. ⁶⁴⁵⁴In Joint International Symposium ‚Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment‘. Canterbury, UK, 1.-3. Juli 1985. |
| (2) | Guth, J.A., und Hörmann, W.D. (1987). ⁶⁴⁵⁵Problematik und Relevanz von Pflanzenschutzmittel-Spuren im Grund (Trink-) Wasser. ⁶⁴⁵⁶Schr.Reihe Verein WaBoLu, 68, 91-106. |
| (3) | Harris, C.I. (1967). ⁶⁴⁵⁸Movement of herbicides in soil. ⁶⁴⁵⁹Weeds 15, 214-216. |
| (4) | Helling, C.S. (1971). ⁶⁴⁶¹Pesticide mobility in soils. Soil Sci. ⁶⁴⁶²Soc. Am. Proc. ⁶⁴⁶³35, 743-748. |
| (5) | McCall, P.J., Laskowski, D.A., Swann, R.L., und Dishburger, H.J. (1981). ⁶⁴⁶⁵Measurements of sorption coefficients of organic chemicals and their use in environmental fate analysis. ⁶⁴⁶⁶In Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington D.C. |
| (6) | Hollis, J.M. (1991). ⁶⁴⁶⁷Mapping the vulnerability of aquifers and surface waters to pesticide contamination at the national/regional scale. ⁶⁴⁶⁸BCPC Monograph No. ⁶⁴⁶⁹47 Pesticides in Soil and and Water, 165-174. |
C.45. ABSCHÄTZUNG DER EMISSIONEN VON MIT HOLZSCHUTZMITTELN BEHANDELTEM HOLZ IN DIE UMWELT: LABORMETHODE FÜR UNBESCHICHTETE HOLZPRODUKTE, DIE MIT SÜSSWASSER ODER MIT MEERWASSER IN BERÜHRUNG KOMMENEINLEITUNG
| 1. | ⁶⁴⁷⁰Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 313 (2007). ⁶⁴⁷¹Die Emissionen aus mit Holzschutzmitteln behandeltem Holz in die Umwelt müssen quantifiziert werden, um das mit behandeltem Holz verbundene Umweltrisiko bewerten zu können. Diese Prüfmethode beschreibt eine Labormethode zur Abschätzung der Emissionen aus mit Holzschutzmitteln behandeltem Holz in zwei Situationen, bei denen Emissionen in die Umwelt gelangen könnten:- —
- Emissionen aus behandeltem Holz, das mit Süßwasser in Berührung kommt, und Emissionen, die bei behandeltem Holz von der Oberfläche in Wasser gelangen könnten;
- —
- Emissionen aus behandeltem Holz, das mit Salzwasser in Berührung kommt, und Emissionen, die bei behandeltem Holz von der Oberfläche in Meerwasser gelangen könnten.
|
| 2. | ⁶⁴⁷²Diese Prüfmethode ist zur Ermittlung der Emissionen aus Hölzern und Holzprodukten vorgesehen, die nicht abgedeckt sind und mit Süßwasser oder mit Meerwasser in Berührung kommen. ⁶⁴⁷³International werden Gebrauchsklassen verwendet, um die biologische Gefährdung zu beschreiben, der behandelte Holzprodukte ausgesetzt sind. ⁶⁴⁷⁴Außerdem beschreiben die Klassen die Verwendungssituation der behandelten Produkte und die Umweltbereiche (Luft, Wasser, Boden), die potenziell durch das mit Holzschutzmitteln behandelte Holz gefährdet sein könnten. |
| 3. | ⁶⁴⁷⁵Die Prüfmethode besteht in einem Laborverfahren zur Gewinnung von Proben (Eluaten) aus dem Wasser, in die das behandelte Holz untergetaucht wurde; die Probenahme erfolgt nach zunehmenden Expositionsintervallen. Die Menge der Emissionen im Eluat hängt von der Oberfläche des Holzes und von der Expositionsdauer ab; zu ermitteln ist die Emissionsrate in mg/m2/Tag. ⁶⁴⁷⁶Auf diese Weise kann die Emissionsrate (die Auswaschungsrate) bei zunehmender Expositionsdauer abgeschätzt werden. |
| 4. | Die Menge der Emissionen kann als Parameter in Bewertungen des Umweltrisikos von behandeltem Holz verwendet werden. |
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN | 5. | ⁶⁴⁷⁸Das Auswaschverhalten der Holzoberfläche mit Süßwasser wird hinsichtlich der Art und des Umfangs der Auswaschung nicht als gleichwertig mit dem Auswaschverhalten einer Holzoberfläche durch Meerwasser betrachtet. ⁶⁴⁷⁹Für Holzschutzmittel oder entsprechende Gemische zur Behandlung von Holz, das mit Meerwasser in Berührung kommt, muss ein Auswaschungstest mit Meerwasser durchgeführt werden. |
| 6. | ⁶⁴⁸⁰Mit einem Holzschutzmittel behandeltes Holz muss für das im Handel angebotene Holz repräsentativ sein. ⁶⁴⁸¹Es muss entsprechend den Anweisungen des Holzschutzmittelherstellers sowie unter Berücksichtigung der geltenden Normen und Spezifikationen behandelt worden sein. ⁶⁴⁸²Parameter einer Nachbehandlung des Holzes zur Konditionierung vor Testbeginn sind zu spezifizieren. |
| 7. | Die verwendeten Holzproben müssen für die verwendeten Erzeugnisse repräsentativ sein (bezüglich der jeweiligen Art, der Dichte und sonstiger Merkmale). |
| 8. | Die Prüfung kann in Verbindung mit einer Druckimprägnierung (Penetrationsverfahren) oder einer Oberflächlenbehandlung sowie mit Holz durchgeführt werden, das eine zusätzliche obligatorische Oberflächenbehandlung erhält (z. B. eine Lackierung als Voraussetzung für die wirtschaftliche Nutzung). |
| 9. | Zusammensetzung, Menge, pH-Wert und physikalische Beschaffenheit des Wassers sind für die Bestimmung des Umfangs, der Art und der Beschaffenheit der von dem Holz ausgehenden Emissionen von Bedeutung. |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 10. | ⁶⁴⁸⁶Proben von mit Holzschutzmitteln behandeltem Holz werden in Wasser eingetaucht. ⁶⁴⁸⁷Von dem Wasser (Eluat) werden im Laufe des Expositionszeitraumes hinreichend oft Proben entnommen und analysiert, um statistische Berechnungen vornehmen zu können. Aus den Ergebnissen der Analysen werden die Emissionsraten in mg/m2/Tag berechnet. ⁶⁴⁸⁸Die Zeitintervalle der Probenahmen sind zu protokollieren. ⁶⁴⁸⁹Prüfungen mit unbehandelten Proben können abgebrochen werden, wenn für die ersten drei Datenpunkte keine Hintergrundkonzentration festgestellt wurde. |
| 11. | Die Berücksichtigung unbehandelter Holzproben ermöglicht die Bestimmung von Hintergrundkonzentrationen der Eluate aus dem Holz, die nicht auf das verwendete Holzschutzmittel zurückzuführen sind. |
QUALITÄTSKRITERIENGenauigkeit
| 12. | Die Genauigkeit der Prüfmethode zur Abschätzung der Emissionen hängt von der Repräsentativität der in der Prüfung verwendeten Proben für das handelsübliche Holz, der Repräsentativität des Wassers für natürliches Wasser und von der Repräsentativität des Expositionsschemas für die natürlichen Gegebenheiten ab. |
| 13. | Die Genauigkeit, die Präzision und die Wiederholbarkeit der Analysemethode sind vor Beginn der Prüfung zu ermitteln. |
Reproduzierbarkeit | 14. | ⁶⁴⁹³Drei Wasserproben werden entnommen und analysiert; der Mittelwert der Proben ist als Emissionswert anzunehmen. ⁶⁴⁹⁴Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse innerhalb eines Labors und zwischen den verschiedenen Labors hängt vom Tauchprotokoll und von den verwendeten Holzproben ab. |
Annehmbare Wertebereiche | 15. | Ein Ergebnisspektrum, bei dem die oberen und die unteren Werte um weniger als eine Größenordnung voneinander entfernt sind, ist bei dieser Prüfung annehmbar. |
PRÜFBEDINGUNGENWasser
| 16. | ⁶⁴⁹⁶Szenarien für die Auswaschung in Süßwasser: Für den Auswaschungstest wird demineralisiertes Wasser (z. B. ASTM D 1193 Typ II) empfohlen, wenn das zu bewertende Holz Süßwasser ausgesetzt wird. ⁶⁴⁹⁷Die Wassertemperatur muss bei 20 +/- 2 °C liegen; der gemessene pH-Wert und die Wassertemperatur sind im Prüfbericht zu vermerken. ⁶⁴⁹⁸Mittels einer Analyse der Wasserproben, die vor dem Tauchen der behandelten Proben entnommen wurden, kann der Anteil der zu untersuchenden Stoffe im Wasser abgeschätzt werden. ⁶⁴⁹⁹Auf diese Weise können die Hintergrundkonzentrationen von Chemikalien ermittelt werden, welche anschließend einer chemischen Analyse unterzogen werden. |
| 17. | ⁶⁵⁰⁰Szenarien für die Auswaschung in Meerwasser: Für den Auswaschungstest wird künstliches Meerwasser (z. B. ASTM D 1141, künstliches Meerwasser ohne Schwermetalle) empfohlen, wenn das zu bewertende Holz Meerwasser ausgesetzt wird. ⁶⁵⁰¹Die Wassertemperatur muss bei 20 +/- 2 °C liegen; der gemessene pH-Wert und die Wassertemperatur sind im Prüfbericht zu vermerken. ⁶⁵⁰²Mittels einer Analyse der Wasserproben, die vor dem Tauchen der behandelten Proben entnommen wurden, kann der Anteil der zu untersuchenden Chemikalien im Wasser abgeschätzt werden. ⁶⁵⁰³Diese Kontrolle ist für die Analyse der Hintergrundkonzentrationen relevanter Chemikalien von Bedeutung. |
Im Test zu verwendende Holzproben | 18. | ⁶⁵⁰⁴Die Holzproben müssen typisch für die tatsächlich zur Prüfung der Wirksamkeit von Holzschutzmitteln verwendete Holzart sein. Empfohlene Arten sind Pinus sylvestris L. (Waldkiefer), Pinus resinosa Ait. ⁶⁵⁰⁵(Rotkiefer) und Pinus spp (Südkiefer). ⁶⁵⁰⁶Mit anderen Arten können weitere Prüfungen durchgeführt werden. |
| 19. | ⁶⁵⁰⁷Für die Prüfungen ist geradfaseriges astfreies Holz zu verwenden. ⁶⁵⁰⁸Harziges Material ist zu vermeiden. ⁶⁵⁰⁹Das Holz muss von typischer handelsüblicher Beschaffenheit sein. ⁶⁵¹⁰Herkunft, Dichte und Anzahl der Jahresringe sind jeweils bezogen auf eine Breite von 10 mm zu protokollieren. |
| 20. | ⁶⁵¹¹Zu empfehlen sind immer jeweils fünf Holzproben in Form von Klötzen gemäß EN 113 (25 mm × 50 mm × 15 mm), deren Längsseiten parallel zur Faser verlaufen; es können aber auch andere Abmessungen (z. B. 50 mm × 150 mm × 10 mm) verwendet werden. ⁶⁵¹²Die Holzproben sollten vollständig von Wasser bedeckt sein. ⁶⁵¹³Sie müssen vollständig aus Splintholz bestehen. ⁶⁵¹⁴Die Proben werden jeweils individuell gekennzeichnet, damit sie während des gesamten Tests identifiziert werden können. |
| 21. | Alle Proben werden gehobelt oder flach gesägt; die Oberflächen dürfen nicht geschmirgelt werden. |
| 22. | ⁶⁵¹⁶Für jede Analyse sind mindestens fünf Gruppen von Holzproben zu verwenden: Drei Gruppen werden mit einem Holzschutzmittel behandelt, eine Gruppe wird nicht behandelt und eine Gruppe wird zur Ermittlung des Feuchtegehalts der unbehandelten Proben nach der Ofentrocknung verwendet. ⁶⁵¹⁷Es werden hinreichend viele Proben hergestellt, damit drei Probengruppen ausgewählt werden können, bei denen die Werte für die Aufnahme des Holzschutzmittels im Bereich von +/- 5 % um die mittleren Aufnahmewerte aller Proben liegen. |
| 23. | ⁶⁵¹⁸Alle Proben werden auf der Stirnseite mit einer Chemikalie versiegelt, die das Eindringen des Holzschutzmittels in die Stirnseite und die Auswaschung über die Stirnseite verhindert. ⁶⁵¹⁹Beim Aufbringen der Versiegelung ist zwischen Proben zur Prüfung einer Oberflächenbehandlung und Proben zur Prüfung einer Druckimprägnierung zu unterscheiden. ⁶⁵²⁰Die Aufbringung der Versiegelung auf der Stirnseite muss nur bei der oberflächlichen Applikation vor der Behandlung erfolgen. |
| 24. | ⁶⁵²¹Bei einer Druckimprägnierung muss die Stirnseite für die Holzschutzmittel durchlässig sein. ⁶⁵²²Daher müssen die Proben am Ende der Vorbehandlung versiegelt werden. ⁶⁵²³Die Emissionen sind ausschließlich für die Fläche auf der Längsseite zu bestimmen. ⁶⁵²⁴Die Versiegelungen sind zu prüfen und gegebenenfalls zu erneuern, bevor mit der Auswaschung begonnen wird. ⁶⁵²⁵Nach Beginn der Auswaschung darf die Versiegelung nicht noch einmal aufgetragen werden. |
Tauchbehältnis | 25. | Das Behältnis besteht aus inertem Material und ist groß genug zur Aufnahme von fünf Holzproben nach EN113 in 500 ml Wasser bei einem Oberflächen-Wasservolumen-Verhältnis von 0,4 cm2/ml. |
Versuchsaufbau (Proben) | 26. | Die Proben werden so aufgebaut, dass alle exponierten Flächen der Proben mit Wasser in Berührung kommen. |
SCHUTZBEHANDLUNGVorbereitung der behandelten Proben
| 27. | Die Holzproben, die mit dem zu untersuchenden Holzschutzmittel behandelt werden sollen, werden nach dem für das jeweilige Holzschutzmittel beschriebenen Verfahren behandelt; in Betracht kommen eine Druckimprägnierung sowie eine Oberflächlichenapplikation (etwa durch Tauchen, Sprühen oder Streichen). |
Schutzmittel die mit einer Druckimprägnierung eingebracht werden | 28. | ⁶⁵²⁸Von dem zu prüfenden Holzschutzmittel wird eine Lösung so hergestellt, dass die spezifizierte Aufnahme oder Retention erreicht wird, wenn das Mittel mit einer Druckimprägnierung eingebracht wird. ⁶⁵²⁹Die Holzprobe wird gewogen und gemessen. ⁶⁵³⁰Das Verfahren zur Druckimprägnierung ist durchzuführen, wie für die Applikation des Holzschutzmittels für Holz zur Verwendung gemäß den Gebrauchsklassen 4 oder 5 vorgesehen. Nach der Behandlung wird die Probe nochmals gewogen und mit der folgenden Gleichung die Retention des Holzschutzmittels (kg/m3) berechnet:
|
| 29. | ⁶⁵³¹Für diesen Test kann in einer Industrieanlage (z. B. durch Vakuumdruckimprägnierung) behandeltes Holz verwendet werden. ⁶⁵³²Die Aufnahmewerte des auf diese Weise behandelten Materials werden ermittelt und sind ebenso wie die verwendeten Verfahren zu protokollieren. |
Durch Oberflächlichenapplikation aufzubringende Holzschutzmittel | 30. | Die Oberflächlichenapplikation kann u. a. durch Tauchen, Sprühen oder Streichen der Holzproben erfolgen. Das Verfahren und die Dosis des Holzschutzmittels (z. B. in l/m2) richten sich nach den Spezifikationen für die oberflächliche Aufbringung des jeweiligen Mittels. |
| 31. | ⁶⁵³⁴Auch in diesem Fall kann in einer Industrieanlage behandeltes Holz für den Test verwendet werden. ⁶⁵³⁵Die Retentionswerte des auf diese Weise behandelten Materials werden ermittelt und sind ebenso wie die verwendeten Verfahren zu protokollieren. |
Weitere Konditionierung der Proben nach der Behandlung | 32. | Nach der Behandlung werden die behandelten Proben gemäß den Empfehlungen des Holzschutzmittelherstellers auf dem Etikett des Holzschutzmittels bzw. gemäß den bei gewerblicher Verwendung üblichen Verfahren oder nach der Norm EN 252 weiter konditioniert. |
Konditionierung und Auswahl der Proben | 33. | Im Anschluss an die Nachbehandlung wird die mittlere Retention der jeweiligen Probengruppe berechnet, und drei repräsentative Probengruppen mit Retentionswerten im Bereich von +/- 5 % um den Mittelwert der Gruppe werden zufällig für die Auswaschungsmessungen ausgewählt. |
MESSUNG DER VON DEN HOLZSCHUTZMITTELN AUSGEHENDEN EMISSIONENTauchverfahren
| 34. | ⁶⁵³⁸Die Proben werden gewogen und anschließend vollständig in Wasser getaucht; Datum und Uhrzeit werden protokolliert. ⁶⁵³⁹Um die Verdunstung zu reduzieren, werden die Behältnisse abgedeckt. |
| 35. | ⁶⁵⁴⁰Das Wasser wird in folgenden Intervallen gewechselt: nach 6 Stunden, 1 Tag, 2 Tagen, 4 Tagen, 8 Tagen, 15 Tagen, 22 Tagen, 29 Tagen. ⁶⁵⁴¹(Hinweis: Dies sind Zeiträume und keine Zeitpunkte.) Zeitpunkt und Datum der Wasserwechsel und die Masse des aus den Behältnissen entnommenen Wassers sind zu protokollieren. |
| 36. | Nach jedem Wasserwechsel wird eine Probe des Wassers, in das die Holzproben eingetaucht waren, zur anschließenden chemischen Analyse aufbewahrt. |
| 37. | ⁶⁵⁴³Das Probenahmeverfahren ermöglicht die zeitbezogenen Berechnung des Profils der Emissionsmengen. ⁶⁵⁴⁴Die Proben sind unter Bedingungen aufzubewahren, bei denen der Analyt nicht beeinträchtigt wird (z. B. in einem Kühlschrank und vor Lichteinfall geschützt, um die Entwicklung von Mikroorganismen in der Probe vor der Analyse zu reduzieren). |
EMISSIONSMESSUNGENBehandelte Proben
| 38. | Das entnommene Wasser wird chemisch auf den Wirkstoff und/oder — so weit von Bedeutung — auf relevante Abbau-/Transformationsprodukte untersucht. |
Unbehandelte Proben | 39. | ⁶⁵⁴⁶Die Entnahme des Wassers (Eluat) bei diesem System und die anschließende Analyse der aus den unbehandelten Holzproben ausgewaschenen Chemikalien ermöglichen die Abschätzung der potenziellen Emissionsrate des Holzschutzmittels bei dem unbehandelten Holz. ⁶⁵⁴⁷Wenn das Eluat nach jeweils längeren Expositionszeiträumen entnommen und analysiert wird, kann die Geschwindigkeit abgeschätzt werden, mit der sich die Emissionsrate im Laufe der Zeit ändert. ⁶⁵⁴⁸Dieses Kontrollverfahren dient zur Ermittlung von Hintergrundkonzentrationen der Prüfchemikalie bei unbehandeltem Holz und soll sicherstellen, dass die verwendeten Holzproben tatsächlich nicht vorher mit dem Holzschutzmittel behandelt wurden. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGChemische Analysen
| 40. | Das entnommene Wasser wird chemisch analysiert, und die Ergebnisse der Analyse werden in geeigneten Einheiten angegeben (z. B. in μg/l). |
Datenerfassung | 41. | ⁶⁵⁵⁰Alle Ergebnisse werden protokolliert. ⁶⁵⁵¹In der Anlage sind ein Berichtsformular für eine Gruppe behandelter Proben und die Übersichtstabelle zur Berechnung der mittleren Emissionswerte für die jeweiligen Expositionszeiträume dargestellt. |
| 42. | Die tägliche Emissionsrate in mg/m2/Tag wird berechnet, indem der Mittelwert der drei Messungen der drei Replikate durch die Anzahl der Tage im Tauchbad geteilt wird. |
Prüfbericht | 43. | Der Prüfbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten:- —
- Name des Herstellers des zu untersuchenden Holzschutzmittels;
- —
- spezifischer und individueller Name oder Code des zu untersuchenden Holzschutzmittels;
- —
- Handelsname oder Trivialname der Wirkstoffe mit einer allgemeinen Beschreibung der Beistoffe (z. B. zweites Lösungsmittel, Harz) und Angabe der Anteile der verschiedenen Inhaltsstoffe in % m/m;
- —
- für Holz mit Wasserkontakt angegebene relevante Retention oder Aufnahmemasse (in kg/m3 bzw. l/m2);
- —
- verwendete Holzart mit Angabe der Dichte und der Wachstumsrate in Ringen je 10 mm;
- —
- Aufnahmemasse oder Retention des getesteten Holzschutzmittels und verwendete Formel zur Berechnung der Retention (in l/m2 bzw. kg/m3);
- —
- das Verfahren zur Applikation des Holzschutzmittels unter Angabe des Behandlungsprotokolls bei Druckimprägnierung bzw. des Applikationsverfahrens bei Oberflächlichenbehandlung;
- —
- Datum der Applikation des Holzschutzmittels und Bestimmung des Feuchtegehalts der Proben in Prozent;
- —
- durchgeführte Vorbehandlung (Typ, Bedingungen und Dauer);
- —
- Angaben zur verwendeten Versiegelung der Stirnseite und Anzahl der Behandlungen;
- —
- Angaben zu anschließenden Behandlungen des Holzes (z. B. Hersteller, Typ, Merkmale und Schichtdicke einer Lackierung);
- —
- Zeitpunkt und Datum der Tauchvorgänge, jeweils verwendete Wassermenge beim Eintauchen der Proben und Volumen des im Tauchbad vom Holz aufgenommenen Wassers;
- —
- jegliche Abweichungen von dem beschriebenen Verfahren und sämtliche Faktoren, die sich auf die Ergebnisse ausgewirkt haben könnten.
|
LITERATUR | (1) | Europäische Norm, EN 84 — 1997. Holzschutzmittel — Beschleunigte Alterung von behandeltem Holz vor biologischen Prüfungen — Auswaschbeanspruchung. |
| (2) | Europäische Norm, EN 113/A1 — 2004. Holzschutzmittel — Prüfverfahren zur Bestimmung der vorbeugenden Wirksamkeit gegen holzzerstörende Basidiomyceten — Bestimmung der Grenze der Wirksamkeit. |
| (3) | Europäische Norm, EN 252 — 1989; Holzschutzmittel; Freiland-Prüfverfahren zur Bestimmung der relativen Schutzwirkung eines Holzschutzmittels im Erdkontakt. |
| (4) | Europäische Norm, EN 335 — Teil 1: 2006. Dauerhaftigkeit von Holz und Holzprodukten — Definition der Gebrauchsklassen — Teil 1: Allgemeines. |
| (5) | American Society for Testing and Materials Standards, ASTM D 1141 — 1998. Standard Practice for the Preparation of Substitute Ocean Water, Without Heavy Metals. Annual Book of ASTM Standards, Volume 11.02. |
| (6) | American Society for Testing and Materials Standards, ASTM D 1193-77 Type II — 1983. Specifications for Reagent Water. Annual Book of ASTM Standards, Volume 11.01. |
Anlage 1Berichtsformular für das Prüfverfahren
Abschätzung der Emissionen von mit Holzschutzmitteln behandeltem Holz in die Umwelt: Labormethode für unbeschichtete Holzprodukte, die mit Süßwasser oder mit Meerwasser in Berührung kommen
| Prüfinstitut | | | Holzschutzmittel | | Hersteller des Holzschutzmittels | | | spezifischer und individueller Name oder Code des Holzschutzmittels | | | Handelsname oder Trivialname des Holzschutzmittels | | | Beistoffe | | | Relevante Retention (Schutzmittelaufnahme) des Holzes, das mit Wasser in Berührung kommt | | | Anwendung | | Applikationsverfahren | | | Datum der Applikation | | | Formel zur Berechnung der Retention: | | | Vorbehandlungsverfahren | | | Dauer der Vorbehandlung | | | Mittel zur Versiegelung der Stirnseite / Anzahl der Behandlungen | | | Folgebehandlung | (gegebenenfalls) | | Proben | | Holzart | | | Dichte des Holzes | (Mindestwert … Mittelwert … Höchstwert) | | Wachstumsrate (Ringe je 10 mm) | (Mindestwert … Mittelwert … Höchstwert) | | Feuchtegehalt | | | Versuchsaufbau | Retention (z. B. kg/m3) | | Behandelt: ‚x‘ | Mittelwert und Standardabweichung oder Bereich bei 5 Proben | | Behandelt: ‚y‘ | Mittelwert und Standardabweichung oder Bereich bei 5 Proben | | Behandelt: ‚z‘ | Mittelwert und Standardabweichung oder Bereich bei 5 Proben | | Unbehandelt | | | Variable Prüfparameter | (z. B. Wasserqualität oder Abmessungen der Proben) |
| Zeit | Wasseraustausch | Probenmasse | Wasseraufnahme | Wasserprobe | | Behandelt (Mittelwert) | Unbehandelt | Behandelt (Mittelwert) | Unbehandelt | | Testwasser | X | y | Z | | Datum | g | g | g | g | Nr. | pH-Wert | pH-Wert | pH-Wert | pH-Wert | | Start | | | | | | | | | | | | | | | | | 6 h | | | | | | 1 | | | | | | 24 h | | | | | | 2 | | | | | | 2 d | | | | | | 3 | | | | | | 4 d | | | | | | 4 | | | | | | 8 d | | | | | | 5 | | | | | | 15 d | | | | | | 6 | | | | | | 22 d | | | | | | 7 | | | | | | 29 d | | | | | | 8 | | | | | | | |
Für jeden Wirkstoff sind eigene Tabellen zu erstellen.| Zeit | Wasseraustausch | Analyseergebnisse | | Unbehandelte Proben | Behandelte Proben | Wirkstoffkonzentration in Wassermg/l
| Abgegebene Mengemg/m2
| Emissionsratemg/m2/d
| Wirkstoffkonzentration in Wasser | Abgegebene Menge | Emissionsrate | | x | y | z | Mittelwert | x | y | z | Mittelwert | x | y | z | Mittelwert | | Datum | mg/l | mg/l | mg/l | mg/l | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d | | 6 h | | | | | | | | | | | | | | | | | | 24 h | | | | | | | | | | | | | | | | | | 2 d | | | | | | | | | | | | | | | | | | 4 d | | | | | | | | | | | | | | | | | | 8 d | | | | | | | | | | | | | | | | | | 15 d | | | | | | | | | | | | | | | | | | 22 d | | | | | | | | | | | | | | | | | | 29 d | | | | | | | | | | | | | | | | |
Hinweis: Da die Emissionsraten behandelter Proben unter Umständen anhand der Ergebnisse unbehandelter Proben korrigiert werden müssen, sind zunächst die Ergebnisse der unbehandelten Proben anzugeben; alle Werte der behandelten Proben sind dann ‚berichtigte Werte‘. Außerdem muss unter Umständen eine Berichtigung der ursprünglichen Wasseranalyse vorgenommen werden.Anlage 2
Begriffsbestimmungen
Chemikalie: ein Stoff oder ein Gemisch
Prüfchemikalie: Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode getestet wird.
C.46. BIOAKKUMULATION IN SEDIMENTBEWOHNENDEN BENTHISCHEN OLIGOCHAETEN
EINLEITUNG
| 1. | ⁶⁵⁶⁹Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 315 (2008). ⁶⁵⁷⁰Sedimentfressende endobenthische Tiere können den in den Sedimenten gebundenen Stoffen ausgesetzt sein (1). ⁶⁵⁷¹Unter diesen sedimentfressenden Tieren kommt den aquatischen Oligochaeten große Bedeutung für die Sedimente aquatischer Systeme zu. ⁶⁵⁷²Aquatische Oligochaeten leben in den Sedimenten und sind häufig die am meisten verbreitete Art, insbesondere in Lebensräumen mit für andere Tiere ungünstigen Umweltbedingungen. ⁶⁵⁷³Durch Bioturbation der Sedimente und als Beutetiere haben sie erheblichen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit dieser Stoffe für andere Organismen (z. B. benthivore Fischarten). ⁶⁵⁷⁴Im Gegensatz zu epibenthischen Organismen graben sich endobenthische aquatische Oligochaeten in die Sedimente ein und nehmen unter der Oberfläche der Sedimente befindliche Partikel auf. ⁶⁵⁷⁵Daher sind diese Organismen über viele Expositionspfade vorhandenen Stoffen ausgesetzt (u. a. durch direkten Kontakt und durch Aufnahme von kontaminierten Sedimentpartikeln, Porenwasser und Überstandswasser). ⁶⁵⁷⁶In Anlage 6 sind einige Arten benthischer Oligochaeten beschrieben, die gegenwärtig in ökotoxikologischen Untersuchungen verwendet werden. |
| 2. | Zu den charakteristischen Parametern der Bioakkumulation eines Stoffs gehören an erster Stelle der Bioakkumulationsfaktor (BAF), die Konstante der Sedimentaufnahme (ks) und die Eliminationskonstante (ke). Ausführliche Definitionen dieser Parameter sind Anlage 1 zu entnehmen. |
| 3. | Um das Bioakkumulationspotenzial von Stoffen im Allgemeinen zu beurteilen und um die Bioakkumulation von Stoffen zu untersuchen, die dazu neigen, sich in oder auf Sedimente zu verteilen, wird eine für diesen Umweltbereich spezifische Prüfmethode benötigt (1)(2)(3)(4). |
| 4. | ⁶⁵⁷⁹Mit dieser Prüfmethode soll die Bioakkumulation sedimentgebundener Stoffe in endobenthischen Oligochaeten ermittelt werden. ⁶⁵⁸⁰Der Prüfstoff wird in das Sediment dotiert. ⁶⁵⁸¹Durch die Verwendung eines dotierten Sediments soll ein kontaminiertes Sediment simuliert werden. |
| 5. | ⁶⁵⁸²Diese Prüfmethode beruht auf bestehenden Methoden zur Prüfung der Toxizität von Sedimenten und zur Ermittlung der Bioakkumulation (1)(4)(5)(6)(7)(8)(9). ⁶⁵⁸³Ebenfalls hilfreich sind die in einem internationalen Workshop (11) geführten Diskussionen und die dort erzielten Ergebnisse sowie das Ergebnis eines internationalen Ringtests (12). |
| 6. | ⁶⁵⁸⁴Diese Prüfung bezieht sich auf stabile, neutrale organische Stoffe, die sich leicht an Sedimente binden. ⁶⁵⁸⁵Die Bioakkumulation sedimentgebundener, stabiler metall-organischer Verbindungen kann mit dieser Methode ebenfalls gemessen werden (12). ⁶⁵⁸⁶Für Metalle und sonstige Spurenelemente ist diese Methode nicht geeignet (11), wenn nicht vorher das Prüfprotokoll hinsichtlich des Substrats und der Wasservolumina sowie möglicherweise der Größe der Gewebeproben modifiziert wird. |
VORAUSSETZUNGEN UND INFORMATIONEN ZUM PRÜFSTOFF | 7. | ⁶⁵⁸⁷Zurzeit gibt es nur wenige allgemein anerkannte QSARs (Quantitative Structure-Activity Relationships = quantitative Struktur-Aktivitätsbeziehungen) für Bioakkumulationsprozesse (14). ⁶⁵⁸⁸Die am weitesten verbreitete Beziehung ist die Korrelation zwischen der Bioakkumulation und der Biokonzentration stabiler organischer Stoffe und ihrer jeweiligen Lipophilität (ausgedrückt als Logarithmus des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (log Kow); Begriffsbestimmung siehe Anlage 1); diese Korrelation wurde entwickelt, um die Verteilung eines Stoffs zwischen Fischen und dem umgebenden Wasser zu beschreiben. ⁶⁵⁸⁹Aufgrund dieser Beziehung wurden Korrelationen auch für den Sedimentbereich ermittelt (15)(16)(17)(18). Die Korrelation zwischen log Kow und log BCF als wichtiger QSAR kann für eine erste vorläufige Abschätzung des Bioakkumulationspotenzials sedimentgebundener Stoffe hilfreich sein. ⁶⁵⁹⁰Der BAF (Bioakkumulationsfaktor) kann jedoch vom Lipidgehalt der Testorganismen und vom Anteil an organischen Kohlenstoffen im Sediment abhängen. Daher kann auch der Koeffizient für die Verteilung organischer Kohlenstoff/Wasser (Koc) als wichtige Determinante der Bioakkumulation sedimentgebundener organischer Stoffe dienen. |
| 8. | Diese Prüfung ist geeignet für:- —
- stabile organische Stoffe mit log-Kow-Werten zwischen 3,0 und 6,0 (5)(19) und für superlipophile Stoffe mit einem log-Kow-Wert von über 6,0 (5);
- —
- Stoffe, die zu einer Klasse organischer Stoffe gehören, die für ihr Bioakkumulationspotenzial in lebenden Organismen bekannt sind (z. B. Tenside oder hoch adsorptive Stoffe (z. B. mit hohen Koc-Werten).
|
| 9. | ⁶⁵⁹¹Vor der Untersuchung sind Informationen zum Prüfstoff (z. B. Sicherheitsvorkehrungen, geeignete Lagerbedingungen/Stabilität und Analysemethoden) zu beschaffen. ⁶⁵⁹²Weitere Hinweise zu Prüfstoffen mit physikalisch-chemischen Merkmalen, welche die Durchführung des Tests erschweren, sind den Quellen (20) und (21) zu entnehmen. Vor der Durchführung eines Bioakkumulationstests bei aquatischen Oligochaeten sollte Folgendes über den Prüfstoff bekannt sein:- —
- Trivialname, chemische Bezeichnung (vorzugsweise IUPAC-Name), Strukturformel, CAS-Registernummer, Reinheit;
- —
- Löslichkeit in Wasser (Prüfmethode A.6 (22));
- —
- Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient, Kow (Prüfmethoden A.8, A.24 (22));
- —
- Sediment- Wasser-Verteilungskoeffizient, ausgedrückt als Kd oder Koc (Prüfmethode C.19 (22));
- —
- Hydrolyse (Prüfmethode C.7 (22));
- —
- Fototransformation in Wasser (23);
- —
- Dampfdruck (Prüfmethode A.4 (22));
- —
- leichte biologische Abbaubarkeit (Prüfmethoden C.4 und C.29 (22));
- —
- Oberflächenspannung (Prüfmethode A.5 (22));
- —
- kritische Micellenkonzentration (24).
Außerdem sind — soweit verfügbar — folgende Informationen von Interesse:- —
- biologischer Abbau in aquatischer Umgebung (Prüfmethoden C.24 und C.25 (22));
- —
- Henry-Konstante.
|
| 10. | ⁶⁵⁹⁴Radioaktiv markierte Prüfstoffe können die Analyse von Wasser, Sedimenten und biologischen Proben erleichtern; außerdem kann anhand radioaktiv markierter Prüfstoffe festgestellt werden, ob Abbauprodukte identifiziert und quantifiziert werden müssen. Die hier beschriebene Methode wurde in einem internationalen Ringtest (12) mit Stoffen validiert, die mit 14C markiert wurden. ⁶⁵⁹⁵Wenn die Summe radioaktiver Rückstände gemessen wird, beruht der BAF (Bioakkumulationsfaktor) auf dem Ausgangsstoff einschließlich gebundener Abbauprodukte. ⁶⁵⁹⁶Außerdem kann eine Untersuchung des Stoffwechsels mit einem Bioakkumulationstest kombiniert werden, indem der Prozentanteil des Ausgangsstoffs und seiner Abbauprodukte in Proben ermittelt wird, die am Ende der Aufnahmephase oder zum Zeitpunkt der maximalen Bioakkumulation entnommen wurden. ⁶⁵⁹⁷In jedem Fall wird empfohlen, bei der Berechnung des BAF von der Konzentration des Ausgangsstoffs in den Organismen und nicht allein von der Summe der radioaktiven Rückstände auszugehen. |
| 11. | ⁶⁵⁹⁸Zusätzlich zu den Merkmalen des Prüfstoffs werden Informationen über die Toxizität für die im Test zu verwendende Oligochaetenart benötigt (z. B. der Medianwert der letalen Konzentration (LC50) in der Aufnahmephase, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Expositionskonzentrationen deutlich unter den toxischen Konzentrationen liegen. Nach Möglichkeit sind Toxizitätswerte zu verwenden, die in Langzeituntersuchungen subletaler Endpunkte (EC50) ermittelt wurden. ⁶⁵⁹⁹Wenn derartige Daten nicht verfügbar sind, können Daten aus einem Test zur akuten Toxizität unter den Bedingungen des Bioakkumulationstests oder Toxizitätsdaten zu stellvertretenden Arten hilfreich sein. |
| 12. | ⁶⁶⁰⁰Eine geeignete Analysemethode von bekannter Genauigkeit, Präzision und Empfindlichkeit sollte für die Quantifizierung des Prüfstoffs in den Testlösungen, im Sediment und im biologischen Material ebenso verfügbar sein wie Einzelheiten zur Probenvorbereitung und -aufbewahrung und Sicherheitsdatenblätter. ⁶⁶⁰¹Auch die analytischen Nachweisgrenzen des Prüfstoffs in Wasser, Sedimenten und Wurmgewebe sollten bekannt sein. Wenn ein radioaktiv markierter Prüfstoff verwendet wird, müssen auch die spezifische Radioaktivität (in Bq mol– 1), die Position des radioaktiv markierten Atoms und der Prozentanteil der an Verunreinigungen gebundenen Radioaktivität bekannt sein. ⁶⁶⁰²Die spezifische Radioaktivität des Prüfstoffs sollte möglichst hoch sein, damit möglichst niedrige Prüfkonzentrationen nachgewiesen werden können (11). |
| 13. | Informationen zu Merkmalen des zu verwendenden Sediments (Herkunft oder Bestandteile des Sediments, pH-Wert und Ammoniakkonzentration des Porenwassers (Feldsedimente), Gehalt an organischen Kohlenstoffen (TOC), Partikelgrößenverteilung (Prozentanteile an Sand, Schluff und Ton), Trockenmasse in Prozent usw.) sollten verfügbar sein (6). |
PRINZIP DER PRÜFMETHODE | 14. | ⁶⁶⁰⁴Der Test besteht aus zwei Phasen: der Aufnahme-(Expositions-)Phase und der Eliminations-(Post-Expositions-)Phase. ⁶⁶⁰⁵In der Aufnahmephase werden die Würmer dem mit dem Prüfstoff dotierten Sediment ausgesetzt; das Sediment ist mit rekonstituiertem Wasser bedeckt, gegebenenfalls muss abgewartet werden, bis sich ein Gleichgewicht eingestellt hat (11). ⁶⁶⁰⁶Gruppen mit Kontrollwürmern werden unter identischen Bedingungen, aber ohne den Prüfstoff kultiviert. |
| 15. | ⁶⁶⁰⁷Für die Eliminationsphase werden die Würmer in ein prüfstofffreies Sediment-Wasser-System umgesetzt. ⁶⁶⁰⁸Um Informationen über die Geschwindigkeit zu erhalten, mit der der Prüfstoff durch die Testorganismen ausgeschieden wird, ist eine Eliminationsphase grundsätzlich erforderlich (19)(25). ⁶⁶⁰⁹Die Eliminationsphase ist nur dann verzichtbar, wenn der Prüfstoff in der Expositionsphase nur in unerheblichem Umfang aufgenommen wurde (d. h., wenn beispielsweise kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Konzentration des Prüfstoffs in den Würmern der Prüf- und Kontrollansätze besteht). Wenn in der Aufnahmephase kein Gleichgewichtszustand erreicht wurde, kann aufgrund der Ergebnisse in der Eliminationsphase die Kinetik — BAFk, und die Konstante(n) der Aufnahme- und der Eliminationsrate — bestimmt werden. ⁶⁶¹⁰Die Konzentration des Prüfstoffs in/an den Würmern wird während der beiden Phasen durchgehend auf Veränderungen überwacht. |
| 16. | ⁶⁶¹¹In der Aufnahmephase werden Messungen vorgenommen, bis der BAF ein Plateau oder einen Gleichgewichtszustand erreicht hat. ⁶⁶¹²Die Aufnahmephase beträgt in der Regel 28 Tage. ⁶⁶¹³Praktische Erfahrungen haben gezeigt, dass bei verschiedenen stabilen, neutralen organischen Stoffen bereits in einer Aufnahmephase von 12-14 Tagen ein Gleichgewichtszustand erreicht wird (6)(8)(9). |
| 17. | ⁶⁶¹⁴Wenn auch nach 28 Tagen kein Gleichgewichtszustand erreicht wird, beginnt die Eliminationsphase, indem die exponierten Oligochaeten in Gefäße mit demselben Medium, aber ohne den Prüfstoff umgesetzt werden. ⁶⁶¹⁵Die Eliminationsphase wird beendet, wenn entweder 10 % der an Tag 28 der Aufnahmephase in den Würmern gemessenen Konzentration erreicht ist oder nachdem maximal 10 Tage vergangen sind. ⁶⁶¹⁶Die Rückstandskonzentrationen in den Würmern am Ende der Eliminationsphase werden als zusätzlicher Endpunkt protokolliert (z. B. als NER (nicht eliminierte Rückstände)). Der Bioakkumulationsfaktor (BAFss) wird vorzugsweise sowohl als Verhältnis der Konzentration in den Würmern (Ca) und im Sediment (Cs) nach Erreichen eines offensichtlichen Gleichgewichtszustands als auch als kinetischer Bioakkumulationsfaktor (BAFK), ausgedrückt als Verhältnis der Konstante der Aufnahmerate (Aufnahme aus dem Sediment) (ks) zur Konstante der Eliminationsrate (ke) bei angenommener Kinetik erster Ordnung, berechnet. ⁶⁶¹⁷Wenn in 28 Tagen kein Gleichgewichtszustand erreicht wird, ist BAFK aus den Konstanten der Aufnahmerate und der Eliminationsrate zu ermitteln. ⁶⁶¹⁸Das Berechnungsverfahren wird in Anlage 2 erläutert. ⁶⁶¹⁹Wenn nicht von einer Kinetik erster Ordnung ausgegangen werden kann, sind komplexere Modelle zu verwenden (Anlage 2 und Quelle (25)). |
| 18. | ⁶⁶²⁰Wenn in 28 Tagen kein Gleichgewichtszustand erreicht wird, kann die Aufnahmephase auch verlängert werden, indem Gruppen exponierter Würmer — soweit verfügbar — weiteren Messungen unterzogen werden, bis der Gleichgewichtszustand gegeben ist. ⁶⁶²¹Die Eliminationsphase beginnt jedoch trotzdem parallel an Tag 28 der Aufnahmephase. |
| 19. | ⁶⁶²²Die Aufnahmekonstante, die Eliminationskonstante (oder Konstanten, wenn komplexere Modelle verwendet werden), der kinetische Bioakkumulationsfaktor (BAFK) und, wenn möglich, die Konfidenzgrenzen eines jeden dieser Parameter werden anhand computergestützter Modellgleichungen berechnet (Modelle siehe Anlage 2). ⁶⁶²³Die Anpassungsgüte eines Modells lässt sich z. B. anhand des Korrelationskoeffizienten oder des Bestimmungskoeffizienten feststellen. (Koeffizienten nahe an 1 deuten auf eine gute Anpassung hin.) |
| 20. | ⁶⁶²⁴Um Schwankungen der Testergebnisse bei organischen Stoffen mit hoher Lipophilität zu reduzieren, sind die Bioakkumulationsfaktoren außerdem bezogen auf den Lipidgehalt der Testorganismen und auf den Gehalt des Sediments an organischen Kohlenstoffen (TOC) (Biota-Sediment-Akkumulationsfaktor oder BSAF in kg TOC Sediment kg– 1 Lipidgehalt der Würmer) auszudrücken. ⁶⁶²⁵Dieser Ansatz beruht auf Erfahrungen und theoretischen Korrelationen des aquatischen Kompartiments, wenn — bei einigen Chemikalienklassen — eine eindeutige Beziehung zwischen dem Bioakkumulationspotenzial eines Stoffs und seiner Lipophilität besteht, die für Fische als Modellorganismen gut dokumentiert wurde (14)(25)(27). ⁶⁶²⁶Außerdem besteht ein Zusammenhang zwischen dem Lipidgehalt der Testfische und der festgestellten Bioakkumulation solcher Stoffe. ⁶⁶²⁷Für benthische Organismen wurden ähnliche Korrelationen festgestellt (15)(16)(17)(18). ⁶⁶²⁸Wenn genügend Wurmgewebe zur Verfügung steht, kann der Lipidgehalt der Testtiere mit dem biologischen Material bestimmt werden, das auch für die Bestimmung der Prüfstoffkonzentration verwendet wurde. ⁶⁶²⁹Aus praktischen Gründen sollten akklimatisierte Kontrolltiere zumindest zu Beginn oder — vorzugsweise — am Ende der Aufnahmephase verwendet werden, um den Lipidgehalt zu messen; dieser kann dann zur Normalisierung der BAF-Werte verwendet werden. |
VALIDITÄT DES TESTS | 21. | Der Test ist gültig, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind:- —
- Die kumulative Mortalität der Würmer (Kontrollen und Behandlungen) bis Ende des Tests darf sich höchstens auf 20 % der ursprünglichen Anzahl belaufen.
- —
- Außerdem ist nachzuweisen, dass sich die Würmer in das Sediment eingraben, damit eine größtmögliche Exposition gegeben ist (siehe Nummer 28).
|
BESCHREIBUNG DER METHODEPrüfspezies
| 22. | ⁶⁶³²Für den Test können verschiedene Arten aquatischer Oligochaeten verwendet werden. ⁶⁶³³In Anlage 6 werden die gebräuchlichsten Arten genannt. |
| 23. | ⁶⁶³⁴In regelmäßigen Intervallen (z. B. einmal monatlich) werden Toxizitätstests (96 h, nur in Wasser) mit einem Referenzgiftstoff wie z. B. Kaliumchlorid (KCl) oder Kupfersulfat (CuSO4) durchgeführt (1), um Aufschluss über den Gesundheitszustand der Testtiere zu erhalten (1)(6). ⁶⁶³⁵Wenn nicht regelmäßig Referenz-Toxizitätstests durchgeführt werden, ist die Charge der in einem Sediment-Bioakkumulationstest zu verwendenden Organismen anhand eines Referenzgiftstoffs zu prüfen. ⁶⁶³⁶Auch aufgrund von Messungen des Lipidgehalts können Rückschlüsse auf den Zustand der Tiere gezogen werden. |
Kultivierung der Testorganismen | 24. | ⁶⁶³⁷Damit eine ausreichende Anzahl an Würmern für die Sediment-Bioakkumulationstests verfügbar ist, müssen die Würmer unter Umständen in einer Dauerkultur mit einer Einzel-Spezies vorrätig gehalten werden. ⁶⁶³⁸Labormethoden zur Kultivierung der für den Test ausgewählten Arten werden in Anlage 6 beschrieben. ⁶⁶³⁹Nähere Informationen sind den folgenden Quellen zu entnehmen: (8)(9)(10)(18)(28)(29)(30)(31)(32). |
Apparatur | 25. | ⁶⁶⁴⁰Die Verwendung von Materialien, die sich auflösen können, die Prüfstoffe absorbieren oder andere chemische Stoffe auslaugen bzw. schädigende Auswirkungen auf die Testtiere haben können, sollte für alle verwendeten Teile unbedingt vermieden werden. ⁶⁶⁴¹Es können rechteckige oder zylindrische Standardkammern aus chemisch inertem Material, die ein der Besatzdichte (Anzahl der Testwürmer) entsprechendes Fassungsvermögen haben, verwendet werden. ⁶⁶⁴²Die Verwendung weicher Kunststoffschläuche zur Zuführung von Wasser oder Luft ist zu vermeiden. ⁶⁶⁴³Geräte, die mit dem Prüfmedium in Berührung kommen, können aus Polytetrafluorethylen, rostfreiem Stahl und/oder Glas bestehen. ⁶⁶⁴⁴Bei Stoffen mit hohen Adsorptionskoeffizienten, wie z. B. synthetischen Pyrethroiden, kann die Verwendung von silanisiertem Glas nötig sein. ⁶⁶⁴⁵In solchen Fällen muss die Apparatur/Anlage nach der Benutzung entsorgt werden (5). ⁶⁶⁴⁶Bei radioaktiv markierten Prüfstoffen und bei flüchtigen Stoffen ist darauf zu achten, dass es nicht zu einem Stripping und zum Austreten des gestrippten Prüfstoffs kommt. ⁶⁶⁴⁷Dazu sind Abscheider (z. B. Gaswaschflaschen aus Glas) mit geeigneten Absorberstoffen zu verwenden, um etwaige Rückstände aufzufangen, die aus den Prüfgefäßen verdunsten könnten (11). |
Wasser | 26. | ⁶⁶⁴⁸Die Qualität des Überstandswassers sollte so beschaffen sein, dass die im Test verwendete Art während der Akklimatisierungs- und Testphasen überleben kann, ohne ein abnormales Aussehen oder Verhalten zu entwickeln. ⁶⁶⁴⁹Als Überstandswasser für die Tests und für die Laborkulturen der Würmer wird rekonstituiertes Wasser gemäß der Prüfmethode C.1 (25) empfohlen. ⁶⁶⁵⁰Es wurde nachgewiesen, dass mehrere für den Test geeignete Arten in diesem Wassertyp überleben, wachsen und sich vermehren (8); außerdem ist eine größtmögliche Standardisierung der Testbedingungen und der Kulturbedingungen gewährleistet. ⁶⁶⁵¹Das Wasser ist mindestens unter Angabe des pH-Werts, der Leitfähigkeit und der Härte zu beschreiben. ⁶⁶⁵²Mit Wasseranalysen auf Mikroverunreinigungen vor der Verwendung können hilfreiche Informationen ermittelt werden (Anlage 4). |
| 27. | ⁶⁶⁵³Während der gesamten Testdauer muss eine konstante Wasserqualität aufrechterhalten werden. ⁶⁶⁵⁴Der pH-Wert des Überstandswassers muss zwischen 6 und 9 liegen. Die Gesamthärte liegt zu Beginn des Tests bei 90-400 mg CaCO3 pro Liter (7). ⁶⁶⁵⁵In der Prüfmethode C.1 (25) werden die pH- und Härtebereiche des rekonstituierten Wassers festgelegt. ⁶⁶⁵⁶Wenn eine Wechselwirkung zwischen den Härte-Ionen und dem Prüfstoff zu erwarten ist, muss Wasser geringerer Härte verwendet werden. ⁶⁶⁵⁷Anlage 4 gibt einen Überblick über die zusätzlichen Kriterien für annehmbares Verdünnungswasser entsprechend der OECD-Prüfrichtlinie 210 (34). |
Sediment | 28. | ⁶⁶⁵⁸Die Qualität des Sediments sollte so beschaffen sein, dass die Testorganismen während der Akklimatisierungs- und Testphasen überleben und sich möglichst vermehren können, ohne ein abnormales Aussehen oder Verhalten zu zeigen. ⁶⁶⁵⁹Die Würmer sollten sich in das Sediment eingraben. ⁶⁶⁶⁰Ob sich die Würmer eingraben, kann Einfluss auf die Exposition und entsprechend auf den BAF haben. ⁶⁶⁶¹Daher ist — soweit die Trübheit des Überstandswassers dies zulässt — zu protokollieren, ob die Prüforganismen das Sediment verlassen oder sich in das Sediment eingraben. ⁶⁶⁶²Die Würmer (Kontrollen und Proben mit den Prüfstoffen) müssen sich innerhalb von 24 h nach dem Einsetzen in die Prüfgefäße in das Sediment eingegraben haben. ⁶⁶⁶³Wenn beobachtet wird, dass die Würmer sich nicht eingraben oder ständig (z. B. mehr als 20 % über mehr als die Hälfte der Aufnahmephase) das Sediment verlassen, deutet dies darauf hin, dass entweder die Prüfbedingungen nicht angemessen sind oder dass die Testorganismen nicht gesund sind oder dass dieses Verhalten auf die Konzentration des Prüfstoffs zurückzuführen ist. ⁶⁶⁶⁴In diesem Fall muss der Test gestoppt und unter günstigeren Bedingungen wiederholt werden. ⁶⁶⁶⁵Weitere Informationen über die Sedimentaufnahme sind mit den in (35) und (36) beschriebenen Methoden zu beschaffen, mit denen die Sedimentaufnahme und die Partikelauswahl durch die Testorganismen bestimmt werden können. ⁶⁶⁶⁶So weit feststellbar ist zumindest das Vorkommen bzw. Fehlen von Kotbällchen auf der Oberfläche des Sediments als Maßstab für die Sedimentaufnahme durch die Würmer zu protokollieren; dieser Parameter kann für die Interpretation der Testergebnisse im Hinblick auf die Expositionspfade von Bedeutung sein. |
| 29. | ⁶⁶⁶⁷Sowohl für die Tests als auch für die Laborkulturen der Würmer (Anlage 5) wird ein künstliches Sediment empfohlen, welches auf dem im Zusammenhang mit Prüfmethode C.8 (40) beschriebenen künstlichen Boden beruht, da natürliche Sedimente geeigneter Qualität unter Umständen nicht ganzjährig verfügbar sind. ⁶⁶⁶⁸Außerdem können in natürlichen Sedimenten vorkommende einheimische Organismen sowie eventuell vorhandene Mikroverunreinigungen die Testergebnisse beeinflussen. ⁶⁶⁶⁹Mehrere in den Tests zu verwendende Arten überleben, wachsen und vermehren sich in künstlichem Sediment (8). |
| 30. | ⁶⁶⁷⁰Das künstliche Sediment muss mindestens durch die Herkunft seiner Bestandteile, die Korngrößenverteilung (Prozent Sand, Schluff und Ton), den organisch gebundenen Kohlenstoff (TOC), den Wassergehalt und den pH-Wert beschrieben werden. ⁶⁶⁷¹Außerdem kann das Redoxpotenzial gemessen werden. ⁶⁶⁷²Natürliche Sedimente von nicht kontaminierten Standorten können ebenfalls als Prüf- und/oder Anzuchtsedimente dienen (1). ⁶⁶⁷³Zur Charakterisierung von natürlichen Sedimenten sind zumindest die Herkunft (Entnahmestandort), der pH-Wert und der Ammoniakgehalt des Porenwassers, der Gehalt an organischem Kohlenstoff, die Korngrößenverteilung (Anteil an Sand, Schluff und Lehm) und der prozentuale Wassergehalt anzugeben (6). ⁶⁶⁷⁴Ferner wird empfohlen, natürliches Sediment vor dem Spiken mit dem Prüfstoff für sieben Tage unter denselben Bedingungen wie im anschließenden Test zu konditionieren, wenn die Bildung von Ammoniak zu erwarten ist. ⁶⁶⁷⁵Nach dieser Konditionierung ist das Überstandswasser zu entfernen und zu entsorgen. ⁶⁶⁷⁶Eine vor Gebrauch durchgeführte Analyse des Sediments oder seiner Bestandteile auf Mikroschadstoffe könnte nützliche Informationen liefern. |
Zubereitung | 31. | ⁶⁶⁷⁷Die Handhabung natürlicher Sedimente vor der Verwendung im Labor wird in den Quellen (1)(6)(44) beschrieben. ⁶⁶⁷⁸Wie das künstliche Sediment vorzubereiten ist, wird in Anlage 5 erläutert. |
Lagerung | 32. | ⁶⁶⁷⁹Natürliche Sedimente sollten im Labor so kurz wie möglich gelagert werden. ⁶⁶⁸⁰Nach Empfehlungen der US-amerikanischen EPA (6) beträgt die Haltbarkeit bei Lagerung im Dunkeln bei einer Temperatur von 4 ± 2 °C maximal 8 Wochen. ⁶⁶⁸¹Über dem Sediment darf sich in den Vorratsbehältnissen kein Luftraum mehr befinden. ⁶⁶⁸²Empfehlungen für die Lagerung künstlicher Sedimente sind Anlage 5 zu entnehmen. |
Applikation des Prüfstoffs: | 33. | ⁶⁶⁸³Der Prüfstoff wird in das Sediment dotiert. ⁶⁶⁸⁴Zur Dotierung werden ein oder mehrere Bestandteile des Sediments mit dem Prüfstoff behandelt. ⁶⁶⁸⁵So kann z. B. der Quarzsand (oder ein Teil davon, beispielsweise 10 g je Prüfgefäß) mit einer Lösung des Prüfstoffs in einem geeigneten Lösungsmittel durchtränkt werden; das Lösungsmittel wird anschließend durch Trocknen abgedampft. ⁶⁶⁸⁶Die beschichtete Quarzsandfraktion wird sodann mit dem befeuchteten Sediment vermischt. ⁶⁶⁸⁷Bei der Zubereitung des Sediments ist die im Gemisch aus Prüfstoff und Sand enthaltene Sandmenge zu berücksichtigen (d. h. das Sediment sollte mit weniger Sand zubereitet werden) (6). |
| 34. | ⁶⁶⁸⁸Bei natürlichen Sedimenten kann der Prüfstoff, wie oben für das künstliche Sediment beschrieben, durch Dotieren eines luftgetrockneten Teils des Bodens oder durch Einrühren des Prüfstoffs in den feuchten Boden mit anschließendem Abdampfen im Falle der Verwendung eines Lösungsmittels hinzugefügt werden. ⁶⁶⁸⁹Geeignete Lösungsmittel zum Dotieren feuchter Sedimente sind Ethanol, Methanol, Ethylenglycolmonomethylether, Ethylenglycoldimethylether, Dimethylformamid und Triethylenglycol (5)(34). ⁶⁶⁹⁰Hauptkriterien für die Wahl eines geeigneten Lösungsvermittlers sollten die Toxizität und Flüchtigkeit des Lösungsmittels und die Löslichkeit des Prüfstoffs in dem gewählten Lösungsmittel sein. Weitere Hinweise zu Dotierungsverfahren sind Environment Canada (1995) zu entnehmen (41). ⁶⁶⁹¹Es ist darauf zu achten, dass der Prüfstoff gut mit dem Sediment gemischt wird, damit er in dem Sediment homogen verteilt ist. ⁶⁶⁹²Unterproben (mit Replikaten) des dotierten Sediments werden analysiert, um die Konzentrationen des Prüfstoffs im Sediment und die Homogenität der Verteilung des Prüfstoffs zu ermitteln. |
| 35. | ⁶⁶⁹³Nach Fertigstellung des dotierten Sediments mit dem überschichteten Wasser ist abzuwarten, bis sich der Prüfstoff zwischen dem Sediment und der wässrigen Phase verteilt hat. ⁶⁶⁹⁴Dies sollte bevorzugt unter denselben Temperatur- und Belüftungsbedingungen wie im Versuch erfolgen. ⁶⁶⁹⁵Die erforderliche Zeit für die Einstellung des Gleichgewichts hängt vom Sediment und der Chemikalie ab. ⁶⁶⁹⁶In einigen Fällen reichen ein paar Stunden oder Tage, in seltenen Fällen können sogar mehrere Wochen (4-5 Wochen) erforderlich sein (28)(42)). ⁶⁶⁹⁷Bei diesem Test wird eine Gleichgewichtseinstellung nicht abgewartet; es wird jedoch eine Wartezeit von 48 Stunden bis 7 Tagen empfohlen. ⁶⁶⁹⁸Je nach Zweck der Untersuchung (z. B. Nachbildung von Umweltbedingungen) kann ein Gleichgewicht des dotierten Sediments eingestellt oder das Sediment auch über einen längeren Zeitraum stehen gelassen werden (11). |
DURCHFÜHRUNG DER PRÜFUNGVorversuch
| 36. | ⁶⁶⁹⁹Die Durchführung eines Vorversuchs kann hilfreich sein, um die Prüfbedingungen des definitiven Tests zu optimieren (beispielsweise hinsichtlich der Festlegung der Prüfstoffkonzentration(en) und der Dauer der Aufnahme- und der Eliminationsphase). ⁶⁷⁰⁰Verhaltensweisen der Würmer (z. B. das Hervorkommen aus dem Sediment), die auf den Prüfstoff und/oder das Sediment an sich zurückzuführen sein könnten, sind in einem Vorversuch zu erfassen und zu protokollieren. ⁶⁷⁰¹Das Verlassen des Sediments kann in einem Vorversuch zur Abschätzung der Prüfstoffkonzentration(en) für einen Bioakkumulationstest auch als subletaler Parameter verwendet werden. |
ExpositionsbedingungenDauer der Aufnahmephase
| 37. | ⁶⁷⁰²Die Testorganismen werden während der Aufnahmephase gegenüber dem Prüfstoff exponiert. ⁶⁷⁰³Die erste Probe wird 4-24 h nach Beginn der Aufnahmephase genommen. ⁶⁷⁰⁴Die Aufnahmephase kann bis zu 28 Tage dauern (1)(6)(11), wenn nicht nachgewiesen wurde, dass ein Gleichgewicht bereits vorher erreicht ist. ⁶⁷⁰⁵Der Gleichgewichtszustand ist gegeben, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind: (i) Die Kurve der Bioakkumulationsfaktoren zu den verschiedenen Zeitpunkten der Probenahme verläuft parallel zur Zeitachse, (ii) drei aufeinanderfolgende Analysen der BAF an Proben, die im Abstand von mindestens zwei Tagen genommen wurden, unterscheiden sich um höchstens ± 20 %,und (iii) es bestehen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zeiträumen der drei Probenahmen (statistischen Vergleichen beispielsweise anhand von Varianz- und Regressionsanalysen zufolge). Wenn in 28 Tagen kein Gleichgewichtszustand erreicht wurde, kann die Aufnahmephase durch Einleitung der Eliminationsphase beendet werden; danach kann aus den Konstanten der Aufnahme- und der Eliminationsrate der BAFK berechnet werden (siehe auch Nummern 16-18). |
Dauer der Eliminationsphase | 38. | ⁶⁷⁰⁶Die erste Probe ist 4-24 h nach Beginn der Eliminationsphase zu nehmen, da in der Anfangsphase rasche Änderungen hinsichtlich der Rückstände in Geweben auftreten können. ⁶⁷⁰⁷Es wird empfohlen, die Eliminationsphase entweder wenn die Konzentration des Prüfstoffs weniger als 10 % der Gleichgewichtskonzentration beträgt oder spätestens nach 10 Tagen zu beenden. ⁶⁷⁰⁸Die Rückstandswerte der Würmer am Ende der Eliminationsphase werden als ein weiterer Endpunkt protokolliert. ⁶⁷⁰⁹Die Dauer der Phase kann jedoch von dem Zeitraum abhängen, über den die Konzentration des Prüfstoffs in den Würmern oberhalb der analytischen Nachweisgrenze bleibt. |
TestorganismenAnzahl der Testwürmer
| 39. | ⁶⁷¹⁰Die in einer Probe enthaltenen Würmer müssen so viel Wurmgewebe ergeben, dass die Masse des Prüfstoffs pro Probe zu Beginn der Aufnahmephase und am Ende der Eliminationsphase erheblich über der Nachweisgrenze des Prüfstoffs in biologischem Material liegt. ⁶⁷¹¹In den genannten Stadien der Aufnahme- und der Eliminationsphase ist die Konzentration in den Testtieren gewöhnlich verhältnismäßig gering (6)(8)(18). Da das individuelle Gewicht bei vielen Arten aquatischer Oligochaeten sehr gering ist (5-10 mg Feuchtmasse pro Tier bei Lumbriculus variegatus und Tubifex tubifex), können die Würmer einer Replikatkammer zum Wiegen und zur Analyse auf die Prüfchemikalie gepoolt werden. ⁶⁷¹²Bei Arten mit höherem individuellem Gewicht (z. B. Branchiura sowerbyi) können Replikate mit jeweils einem Tier verwendet werden; in diesen Fällen ist jedoch die Anzahl der Replikate auf fünf pro Zeitpunkt der Probenahme zu erhöhen (11). Es ist jedoch zu beachten, dass B. sowerbyi im Ringtest nicht berücksichtigt wurde (12); dementsprechend wird diese Art für diese Methode nicht ausdrücklich empfohlen. |
| 40. | Im Test sind Würmer ähnlicher Größe zu verwenden (zu L. variegatus siehe Anlage 6). ⁶⁷¹⁵Es sollten adulte oder große Tiere identischer Herkunft und derselben Altersklasse sein (siehe Anlage 6). ⁶⁷¹⁶Das Gewicht und das Alter eines Tieres kann entscheidenden Einfluss auf die BAF-Werte haben (beispielsweise aufgrund unterschiedlicher Lipidgehalte und/oder weil Eier vorhanden sind). ⁶⁷¹⁷Diese Parameter sind genau zu protokollieren. ⁶⁷¹⁸Zur Feststellung der mittleren Feucht- und Trockenmasse wird vor Beginn des Tests eine Unterprobe der Würmer gewogen. |
| 41. | ⁶⁷¹⁹Bei Tubifex tubifex und Lumbriculus variegatus ist während der Dauer des Tests eine Vermehrung zu erwarten. ⁶⁷²⁰Eine fehlende Reproduktion bei einem Bioakkumulationstest ist zu protokollieren und bei der Interpretation der Testergebnisse zu berücksichtigen. |
Besatz | 42. | ⁶⁷²¹Um die Verringerung der Prüfstoffkonzentration im Sediment während der Aufnahmephase und einen Rückgang der Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu verhindern, ist ein hohes Verhältnis von Sedimenten zu Würmern und von Wasser zu Würmern erforderlich. ⁶⁷²²Die gewählte Besatzrate sollte auch den in der Natur gegebenen Populationsdichten der ausgewählten Art entsprechen (43). Bei Tubifex tubifex beispielsweise ist eine Besatzrate von 1-4 mg Wurmgewebe (Feuchtmasse) pro Gramm feuchtes Sediment zu empfehlen (8)(11). In den Quellen (1) und (6) wird für L. variegatus eine Besatzrate von ≤ 1 g Wurmgewebe (Trockenmasse) je 50 g organischer Kohlenstoff im Sediment empfohlen. |
| 43. | ⁶⁷²⁴Die in einem Test zu verwendenden Würmer werden durch Aussieben des Kultursediments aus der Kultur gewonnen. ⁶⁷²⁵Die Tiere (adulte oder große Tiere, die keine Anzeichen einer kürzlich erfolgten Teilung aufweisen) werden in Glasgefäße (z. B. Petrischalen) mit sauberem Wasser gesetzt. ⁶⁷²⁶Wenn sich die Testbedingungen von den Kulturbedingungen unterscheiden, ist eine Akklimatisierung vorzunehmen; eine Akklimatisierungsphase von 24Stunden dürfte ausreichend sein. ⁶⁷²⁷Vor dem Wiegen ist überschüssiges Wasser von den Würmern zu entfernen. ⁶⁷²⁸Dazu können die Würmer vorsichtig auf ein befeuchtetes Papiertuch gelegt werden. ⁶⁷²⁹Es wird nicht empfohlen, die Würmer mit saugendem Papier zu trocknen, da die Würmer dadurch eine Stressbelastung erfahren oder beschädigt werden könnten. ⁶⁷³⁰Brunson et al. ⁶⁷³¹(1998) empfehlen die Verwendung nicht trockengetupfter Würmer mit etwa dem 1,33-Fachen der gewünschten endgültigen Biomasse. ⁶⁷³²Die Zugabe von 33 % entspricht dem Unterschied zwischen der Masse trockengetupfter und nicht abgetrockneter Würmer (28). |
| 44. | ⁶⁷³³Zu Beginn der Aufnahmephase (Tag 0 des Tests) werden die Testorganismen aus dem Akklimatisierungsbecken genommen und randomisiert auf die Gefäße (z. B. Petrischalen) mit rekonstituiertem Wasser verteilt, indem jeweils zwei Würmer in die Gefäße gegeben werden, bis sich in jedem Gefäß zehn Würmer befinden. ⁶⁷³⁴Die Gruppen werden dann zufällig auf getrennte Prüfgefäße verteilt (z. B. mit einer weichen Stahlpinzette). ⁶⁷³⁵Danach werden die Prüfgefäße unter Testbedingungen inkubiert. |
Fütterung | 45. | ⁶⁷³⁶Angesichts des niedrigen Nährstoffgehalts des künstlichen Sediments ist das Sediment mit Futter anzureichern. ⁶⁷³⁷Damit die Exposition der Testorganismen nicht unterschätzt wird (indem beispielsweise selektiv nicht kontaminiertes Futter bereitgestellt wird), muss das zum Wachstum und zur Vermehrung der Testorganismen benötigte Futter mit einem Mal vor oder während der Applikation des Prüfstoffs bereitgestellt werden (siehe Anlage 5). |
Sediment-Wasser-Verhältnis | 46. | ⁶⁷³⁸Das empfohlene Sediment-Wasser-Verhältnis beträgt 1:4 (45). ⁶⁷³⁹Dieses Verhältnis wird als geeignet betrachtet, um geeignete Sauerstoffkonzentrationen aufrechtzuerhalten und um die Ammoniakbildung im Überstandswasser zu vermeiden. ⁶⁷⁴⁰Im Überstandswasser muss ein Sauerstoffgehalt von ≥ 40 % aufrechterhalten werden. ⁶⁷⁴¹Das Überstandswasser der Prüfgefäße ist vorsichtig zu belüften (z. B. mit 2-4 Blasen pro Sekunde); die dazu verwendete Pasteur-Pipette wird etwa 2 cm über der Oberfläche des Sediments angesetzt, um Trübungen des Sediments zu minimieren. |
Licht und Temperatur | 47. | ⁶⁷⁴²Die Fotoperiode für die Kultur und für den Versuch beträgt 16 Stunden (1)(6). ⁶⁷⁴³Die Lichtintensität im Prüfbereich soll etwa 500-1 000 lx betragen. ⁶⁷⁴⁴Die Prüftemperatur soll während des gesamten Tests bei 20 ± 2 °C liegen. |
Prüfkonzentrationen | 48. | ⁶⁷⁴⁵Die Bestimmung der Aufnahmekinetik erfolgt bei einer einzigen (möglichst niedrigen) Prüfkonzentration; es kann aber auch eine zweite (höhere) Konzentration verwendet werden (siehe z. B. (46)). ⁶⁷⁴⁶In diesem Fall werden im Gleichgewichtszustand oder nach 28 Tagen Proben entnommen, um die bei der niedrigeren Konzentration gemessenen BAF-Werte zu verifizieren (11). Die höhere Konzentration ist so zu wählen, dass Beeinträchtigungen ausgeschlossen werden können (beispielsweise indem eine Konzentration in Höhe von etwa 1 % der in maßgeblichen Untersuchungen der chronischen Toxizität ermittelten niedrigsten Konzentration mit bekannter chronischer Wirkung ECx verwendet wird). ⁶⁷⁴⁷Die niedrigere Prüfkonzentration muss erheblich über der Nachweisgrenze der verwendeten Methode zur Analyse von Sedimenten und biologischen Proben liegen). ⁶⁷⁴⁸Liegt die Wirkungskonzentration des Prüfstoffs in der Nähe der analytischen Nachweisgrenze, wird empfohlen, radioaktiv markierte Prüfstoffe mit hoher spezifischer Radioaktivität zu verwenden. |
Replikate mit dem Prüfstoff und Kontrollreplikate | 49. | ⁶⁷⁴⁹Für die kinetischen Messungen in der Aufnahme- und der Eliminationsphase sind pro Messzeitpunkt (11) mindestens drei behandelte Replikate vorzusehen. ⁶⁷⁵⁰Zusätzliche Replikate sind beispielsweise zu verwenden, wenn (optional) weitere Probendaten ermittelt werden sollen. ⁶⁷⁵¹Für die Eliminationsphase wird eine entsprechende Anzahl an Replikaten mit nicht dotiertem Sediment und mit Überstandswasser hergestellt, damit die dem Prüfstoff ausgesetzten Würmer aus den betreffenden Gefäßen mit dem Prüfstoff am Ende der Aufnahmephase in Gefäße ohne Prüfstoff gegeben werden können. ⁶⁷⁵²Die Gesamtzahl der behandelten Replikate mit dem Prüfstoff muss für die Aufnahme- und die Eliminationsphase ausreichend sein. |
| 50. | ⁶⁷⁵³Alternativ können die für die Probenahme während der Eliminationsphase vorgesehenen Würmer in einem großen Behältnis mit dotiertem Sediment aus derselben Charge wie bei der Ermittlung der Aufnahmekinetik des Prüfstoffs exponiert werden. ⁶⁷⁵⁴Es muss nachgewiesen werden, dass die Testbedingungen (Sedimenttiefe, Sediment-Wasser-Verhältnis, Besatz, Temperatur, Wasserqualität usw.) den entsprechenden Parametern der für die Aufnahmephase vorgesehenen Replikate vergleichbar sind. ⁶⁷⁵⁵Am Ende der Aufnahmephase sind Wasser-, Sediment- und Wurmproben aus diesem Behältnis zur Analyse zu entnehmen; außerdem muss eine hinreichende Anzahl großer Würmer, die keine Anzeichen einer kürzlich erfolgten Teilung aufweisen, vorsichtig entnommen und in die für die Eliminationsphase vorgesehenen Replikate gesetzt werden (z. B. zehn Organismen pro Replikatgefäß). |
| 51. | ⁶⁷⁵⁶Wenn ausschließlich Wasser als Lösungsmittel eingesetzt wird, sind mindestens 9 Replikate einer negativen Kontrolle (mindestens 3 Probenahmen zu Beginn, 3 am Ende der Aufnahmephase und 3 am Ende der Eliminationsphase) für biologische Analysen und für Analysen der Hintergrundkonzentrationen vorzusehen. ⁶⁷⁵⁷Wenn zur Applikation des Prüfstoffs ein Lösungsmittel verwendet wird, ist eine Lösungsmittelkontrolle herzustellen (Probenahmen bei mindestens 3 Replikaten zu Beginn, 3 Replikaten am Ende der Aufnahmephase und 3 Replikaten am Ende der Eliminationsphase). ⁶⁷⁵⁸In diesem Fall sind 4 Replikate einer negativen Kontrolle (ohne Lösungsmittel) zur Probennahme am Ende der Aufnahmephase vorzusehen. ⁶⁷⁵⁹Diese Replikate können biologisch mit der Lösungsmittelkontrolle verglichen werden, um Informationen über einen möglichen Einfluss des Lösungsmittels auf den Testorganismus zu erhalten. ⁶⁷⁶⁰Nähere Informationen sind Anlage 3 zu entnehmen. |
Häufigkeit der Messungen der Wasserqualität | 52. | Während der Aufnahmephase und der Eliminationsphase müssen mindestens folgende Parameter des Überstandswassers gemessen werden:| Temperatur | Messung in jeweils einem Gefäß pro Prüfkonzentration und Datum der Probenahme und in einem Kontrollgefäß einmal wöchentlich sowie zu Beginn und am Ende der Aufnahmephase und der Eliminationsphase; außerdem kann die Temperatur des umgebenden Mediums (Umgebungsluft oder Wasserbad) oder in einem repräsentativen Prüfgefäß protokolliert werden (beispielsweise kontinuierlich oder stündlich); | | Gehalt an gelöstem Sauerstoff | je Prüfkonzentration in einem Gefäß sowie in einem Kontrollgefäß pro Datum der Probenahme; ausgedrückt in mg/l und % Luftsauerstoff-Sättigungswert; | | Luftzufuhr | mindestens einmal täglich (an Werktagen) zu kontrollieren und erforderlichenfalls anzupassen; | | pH-Wert | in jeweils einem Gefäß pro Prüfkonzentration mit dem Prüfstoff pro Zeitpunkt der Probenahme und in einem Kontrollgefäß einmal wöchentlich sowie zu Beginn und am Ende der Aufnahmephase und der Eliminationsphase; | | Gesamt-Wasserhärte | in mindestens einem Gefäß mit dem Prüfstoff und in einem Kontrollprüfgefäß zu Beginn und am Ende der Aufnahmephase und der Eliminationsphase, ausgedrückt in mg/l CaCO3; | | Gesamt-Ammoniakgehalt | in mindestens einem Gefäß mit dem Prüfstoff und in einem Kontrollprüfgefäß am Anfang und am Ende der Aufnahmephase und der Eliminationsphase; ausgedrückt in mg/l NH4+ oder NH3 oder Ammoniak-N gesamt. |
|
Probenahme und Analyse der Wurm-, Sediment- und WasserprobenProbenahmeplan
| 53. | Anlage 3 enthält Beispiele von Probenahmeplänen für eine Aufnahmephase von 28 Tagen und eine Eliminationsphase von 10 Tagen. |
| 54. | ⁶⁷⁶³Vor dem Einsetzen der Würmer sowie in der Aufnahmephase und in der Eliminationsphase werden von dem Wasser und dem Sediment in den Prüfbecken Proben zur Bestimmung der Prüfstoffkonzentration entnommen. ⁶⁷⁶⁴Während des Tests werden die Konzentrationen des Prüfstoffs in den Würmern, im Sediment und im Wasser ermittelt, um die Verteilung des Prüfstoffs in den verschiedenen Kompartimenten des Prüfsystems zu überwachen. |
| 55. | Wurm-, Sediment- und Wasserproben werden jeweils in der Aufnahmephase und in der Eliminationsphase mindestens sechsmal entnommen. |
| 56. | ⁶⁷⁶⁶Die Probenahmen werden fortgesetzt, bis ein Plateau (Gleichgewichtszustand) erreicht wird (siehe Anlage 1) bzw. bis 28 Tage vergangen sind. ⁶⁷⁶⁷Auch wenn sich binnen 28 Tagen kein Plateau einstellt, wird mit der Eliminationsphase begonnen. ⁶⁷⁶⁸Zu Beginn der Eliminationsphase werden die vorgesehenen Würmer in die Replikatbecken mit unbehandeltem Sediment und Wasser gesetzt (siehe auch Nummern 17 und 18). |
Probenahme und Probenvorbereitung | 57. | Die Entnahme der Wasserproben erfolgt durch Dekantieren, Absaugen oder Pipettieren eines ausreichenden Volumens zur Quantifizierung des Prüfstoffs in den Proben. |
| 58. | ⁶⁷⁷⁰Das verbleibende Überstandswasser wird vorsichtig aus den Prüfbecken dekantiert oder abgesaugt. ⁶⁷⁷¹Sedimentproben sind vorsichtig zu entnehmen, damit die Würmer möglichst wenig gestört werden. |
| 59. | ⁶⁷⁷²Bei der Probenahme werden alle Würmer aus dem Replikat entnommen (beispielsweise indem das Sediment mit dem Überstandswasser suspendiert und der Inhalt der einzelnen Replikate auf einer flachen Schale verteilt wird, um die Würmer mit einer weichen Stahlpinzette aufnehmen zu können). ⁶⁷⁷³Anschließend werden die Würmer kurz in einer flachen Schale aus Glas oder Stahl mit Wasser gespült. ⁶⁷⁷⁴Anhaftendes Wasser ist zu entfernen. ⁶⁷⁷⁵Die Würmer vorsichtig in ein vorgewogenes Gefäß geben und wiegen. ⁶⁷⁷⁶Anschließend werden die Würmer durch Gefrieren (z. B. bei ≤ — 18 °C) getötet. ⁶⁷⁷⁷Das Vorhandensein und die Anzahl von Kokons und/oder juvenilen Tieren sind zu protokollieren. |
| 60. | Im Allgemeinen sind die Würmer unmittelbar nach der Probenahme ohne eine Phase der Darmentleerung zu wiegen und zu töten, um die BAF-Werte konservativ zu ermitteln und um Verluste von Rückständen im Gewebe während der Entleerung des Darminhalts nur in Wasser zu vermeiden. Bei log-Kow-Werten über 5 wird davon ausgegangen, dass die betreffenden Stoffe bei Entleerung des Darminhalts nur in Wasser nicht in erheblichem Umfang eliminiert werden; bei Stoffen mit log-Kow-Werten unter 4 hingegen können erhebliche Anteile verlorengehen (47). |
| 61. | ⁶⁷⁷⁹In der Eliminationsphase entleeren die Würmer ihren Darm in sauberes Sediment, Messungen unmittelbar vor der Eliminationsphase werden entsprechend an Sedimenten mit kontaminiertem Darminhalt vorgenommen. ⁶⁷⁸⁰Nach den ersten 4-24 h der Eliminationsphase kann dagegen davon ausgegangen werden, dass der kontaminierte Darminhalt weitgehend durch sauberes Sediment ersetzt wurde (11)(47). ⁶⁷⁸¹Die Konzentration in den Würmern der betreffenden Probe kann dann als Konzentration im Gewebe nach der Entleerung des Darminhalts betrachtet werden. ⁶⁷⁸²Um der Verdünnung der Prüfstoffkonzentration durch unkontaminiertes Sediment während der Eliminationsphase Rechnung zu tragen, kann das Gewicht des Darminhalts auf Basis des Verhältnisses Nassgewicht/Aschegewicht des Wurms oder des Verhältnisses Trockenmasse/Aschegewicht des Wurms geschätzt werden. |
| 62. | ⁶⁷⁸³Wenn bei einer Untersuchung die Bioverfügbarkeit und die tatsächlichen Rückstände im Gewebe der Testorganismen ermittelt werden sollen, muss mindestens eine Unterprobe exponierter Tiere (z. B. aus drei zusätzlichen Replikatgefäßen), die vorzugsweise im Gleichgewichtszustand entnommen wurde, gewogen, 6 Stunden mit sauberem Wasser gereinigt (47) und danach vor der Analyse nochmals gewogen werden. ⁶⁷⁸⁴Daten zum Gewicht der Würmer und zur Konzentration im Körpergewebe der betreffenden Unterprobe können dann mit Werten von Würmern mit Darminhalt verglichen werden. ⁶⁷⁸⁵Um die Tiere nicht einer zusätzlichen Stressbelastung auszusetzen, darf der Darm der für die Messung der Elimination vorgesehenen Würmer vor der Umsetzung in sauberes Sediment nicht geleert werden. |
| 63. | ⁶⁷⁸⁶Die Analyse der Wasser-, Sediment- und Wurmproben sollte vorzugsweise direkt nach der Probenahme (d. h. innerhalb von 1 bis 2 Tagen) erfolgen, um einen Abbau oder sonstige Verluste zu vermeiden und um bei laufendem Versuch die ungefähren Aufnahme- und Eliminationsraten zu ermitteln. ⁶⁷⁸⁷Durch eine umgehende Analyse werden auch Verzögerungen bei der Ermittlung des Zeitpunkts vermieden, bei dem ein Plateau einsetzt. |
| 64. | ⁶⁷⁸⁸Wenn die Analyse nicht umgehend vorgenommen wird, sind die Proben unter geeigneten Bedingungen zu lagern. ⁶⁷⁸⁹Vor Beginn der Untersuchung sind Informationen über die Stabilität des betreffenden Prüfstoffs und über geeignete Lagerbedingungen einzuholen (z. B. Haltbarkeit und Lagertemperatur oder Extraktionsverfahren). ⁶⁷⁹⁰Wenn diese Informationen nicht verfügbar sind, kann erforderlichenfalls gleichzeitig anhand dotierter Kontrollgewebe die Lagerfähigkeit ermittelt werden. |
Qualität der Analysemethode | 65. | ⁶⁷⁹¹Da Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Empfindlichkeit entscheidend für das gesamte Verfahren sind, muss experimentell sichergestellt werden, dass die Präzision und die Reproduzierbarkeit der chemischen Analysen sowie die Wiederfindung des Prüfstoffs aus Wasser-, Sediment- und Wurmproben für die jeweilige Methode mindestens bei der geringsten und bei der höchsten Prüfkonzentration ausreichend sind. ⁶⁷⁹²Außerdem muss gewährleistet werden, dass der Prüfstoff in den Kontrollbecken nicht in Konzentrationen oberhalb der Hintergrundkonzentration nachweisbar ist. Erforderlichenfalls werden die Cw-, Cs- und Ca-Werte entsprechend den Wiederfindungsraten und den Hintergrundkonzentrationen der Kontrollen korrigiert. ⁶⁷⁹³Alle Proben müssen während des Tests stets so behandelt werden, dass Verunreinigungen und Verluste (z. B. infolge von Adsorption des Prüfstoffs durch das Probenahmegerät) auf ein Minimum beschränkt werden. |
| 66. | Die Gesamtwiederfindungsrate und die Wiederfindung des Prüfstoffs in Würmern, Sedimenten, Wasser und (gegebenenfalls) verwendeten Abscheidern mit Adsorberstoffen zum Auffangen des verdampfenden Prüfstoffs müssen ermittelt und im Protokoll erfasst werden. |
| 67. | ⁶⁷⁹⁵Da die Verwendung radioaktiv markierter Stoffe empfohlen wird, kann die Gesamt-Radioaktivität (d. h. von Ausgangsstoff und seinen Abbauprodukten) ermittelt werden. ⁶⁷⁹⁶Wenn analysetechnisch möglich, können aus der Quantifizierung des Ausgangsstoffs und der Abbauprodukte im Gleichgewichtszustand oder am Ende der Aufnahmephase wichtige Informationen gewonnen werden. ⁶⁷⁹⁷Sind derartige Messungen beabsichtigt, müssen die Proben anschließend geeigneten Extraktionsverfahren unterzogen werden, damit der Ausgangsstoff separat quantifiziert werden kann. ⁶⁷⁹⁸Wenn ein wesentlicher Prozentanteil (z. B. > 10 %) der in den Testorganismen im Gleichgewichtszustand oder am Ende der Aufnahmephase gemessenen Radioaktivität auf ein nachgewiesenes Abbauprodukt entfällt, sollte dieses Abbauprodukt identifiziert werden (5). |
| 68. | ⁶⁷⁹⁹Wegen der geringen individuellen Biomasse kann die Konzentration des Prüfstoffs bei den einzelnen Würmern häufig nicht ermittelt werden, außer wenn der Test mit Branchiura sowerbyi (40-50 mg Feuchtmasse pro Wurm) durchgeführt wird (11). ⁶⁸⁰⁰Daher können die aus einem Prüfgefäß entnommenen Würmer gepoolt werden; die Daten können dann allerdings nur für gewisse statistische Verfahren verwendet werden. ⁶⁸⁰¹Wird auf ein spezielles statistisches Verfahren bzw. eine bestimmte statistische Aussagekraft Wert gelegt, muss der Test unter Berücksichtigung des Poolings, des Verfahrens und der gewünschten Aussagekraft eine angemessene Anzahl an Testtieren und/oder Replikatbecken umfassen. |
| 69. | ⁶⁸⁰²Der BAF sollte im Verhältnis zur gesamten Feuchtmasse und zur Trockenmasse sowie, falls erforderlich (z. B. bei hochlipophilen Stoffen), im Verhältnis zum Lipidgehalt und zum TOC des Sediments ausgedrückt werden. ⁶⁸⁰³Zur Bestimmung des Lipidgehalts sind geeignete Methoden zu verwenden (48)(49). ⁶⁸⁰⁴Als Standardmethode wird die Extraktion mit Chloroform/Methanol (50) empfohlen (48). ⁶⁸⁰⁵Um die Verwendung von gechlorten Lösungsmitteln zu vermeiden, kann jedoch eine in einem Ringtest geprüfte angepasste Version der Methode von Bligh and Dyer (50), wie in (51) beschrieben, verwendet werden. ⁶⁸⁰⁶Da die verschiedenen Methoden möglicherweise zu unterschiedlichen Werten führen (48), ist es wichtig, die verwendete Methode anzugeben. ⁶⁸⁰⁷Nach Möglichkeit, d. h., wenn genügend Wurmgewebe verfügbar ist, wird der Lipidgehalt an der Probe bzw. dem Extrakt gemessen, die bzw. der auch für die Ermittlung der Konzentration des Prüfstoffs verwendet wurde. ⁶⁸⁰⁸Die Lipide müssen nämlich häufig aus dem Extrakt entfernt werden, bevor eine chromatographische Analyse durchgeführt werden kann (5). ⁶⁸⁰⁹Aus praktischen Gründen empfiehlt sich allerdings, zumindest zu Beginn oder — vorzugsweise — am Ende der Aufnahmephase akklimatisierte Kontrolltiere zu verwenden, um den Lipidgehalt beispielsweise an drei Proben zu messen. |
DATEN UND BERICHTERSTATTUNGAuswertung der Ergebnisse
| 70. | Die Aufnahmekurve des Prüfstoffs ergibt sich, indem dessen Konzentration in/auf den Würmern in der Aufnahmephase gegen die Zeit auf einer arithmetischen Skala aufgetragen wird. Wenn die Kurve ein Plateau erreicht hat, wird der BAFss im Gleichgewichtszustand berechnet:
|
| 71. | ⁶⁸¹¹Bestimmung des kinetischen Bioakkumulationsfaktors (BAFK) als Quotient ks/ke. ⁶⁸¹²Die Eliminationskonstante (ke) wird in der Regel aus der Eliminationskurve abgeleitet (d. h. einer grafischen Darstellung der Prüfstoffkonzentration in den Würmern während der Eliminationsphase). ⁶⁸¹³Die Aufnahmekonstante ks wird dann anhand der Kinetik der Aufnahmekurve berechnet. ⁶⁸¹⁴Die bevorzugte Methode zur Berechnung des BAFK und der Konstanten ks und ke ist eine computergestützte nichtlineare Parameterschätzung (siehe Anlage 2). ⁶⁸¹⁵Wenn die Ausscheidungskinetik offensichtlich nicht erster Ordnung entspricht, sollten komplexere Modelle herangezogen werden (25)(27)(52). |
| 72. | Der Biota-Sediment-Akkumulationsfaktor (BSAF) wird durch Normalisierung des BAFK für den Lipidgehalt der Würmer und für den Gesamtgehalt des Sediments an organischem Kohlenstoff ermittelt. |
Interpretation der Ergebnisse | 73. | Die Prüfergebnisse sind mit Vorsicht zu bewerten, wenn die gemessenen Konzentrationen des Prüfstoffs in Testansätzen in der Nähe der Nachweisgrenze der jeweiligen Analysemethode liegen. |
| 74. | ⁶⁸¹⁸Klar definierte Aufnahme- und Eliminationskurven sind ein Anzeichen für die gute Qualität der Bioakkumulationsdaten. ⁶⁸¹⁹Im Allgemeinen sollten die Konfidenzintervalle der BAF-Werte bei gut konzeptionierten Untersuchungen nicht 25 % übersteigen (5). |
Prüfbericht | 75. | Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: | Prüfstoff- —
- physikalischer Zustand und physikalisch-chemische Eigenschaften, z. B. log Kow, Wasserlöslichkeit;
- —
- chemische Kenndaten; Herkunft des Prüfstoffs, Bezeichnung und Konzentration der verwendeten Lösungsmittel;
- —
- bei radioaktiv markierten Prüfstoffen: die genaue Position der markierten Atome, die spezifische Radioaktivität und der Prozentanteil der mit Verunreinigungen verbundenen Radioaktivität.
|
| Versuchstierart| — | wissenschaftlicher Name, Stamm, Bezugsquelle, eventuelle Vorbehandlungen, Akklimatisation, Alter, Größenbereich usw. |
|
| Prüfbedingungen- —
- verwendetes Prüfverfahren (z. B. statisch, semistatisch oder Durchfluss);
- —
- Art und Eigenschaften der verwendeten Beleuchtung und Photoperiode(n);
- —
- Versuchsaufbau (z. B. Anzahl, Material und Größe der Prüfbecken, Wasservolumen, Sedimentmasse und -volumen, Wasseraustausch (Volumen) (bei Durchflusssystemen und bei semistatischer Erneuerung), ggf. Belüftung vor und während des Tests, Anzahl der Replikate, Anzahl der Würmer pro Replikat, Anzahl der Prüfkonzentrationen, Dauer der Aufnahme- und Eliminationsphasen, Häufigkeit der Probenahme);
- —
- Methode für die Vorbereitung des Prüfstoffs und Applikationsmethode sowie Begründung der Wahl einer bestimmten Methode;
- —
- die nominalen Prüfkonzentrationen;
- —
- Herkunft der Bestandteile des künstlichen oder natürlichen Wassers und des künstlichen oder natürlichen Sediments, Beschreibung etwaiger Vorbehandlungen, Nachweise dafür, dass die Testtiere in den verwendeten Medien leben und/oder sich vermehren, Merkmale des Sediments (pH-Wert und Ammoniakgehalt des Porenwassers (natürliche Sedimente), Gehalt an organischem Kohlenstoff (TOC), Partikelgrößenverteilung (Prozent Sand, Schluff und Ton), prozentualer Wasseranteil und sonstige vorgenommene Messungen) sowie Merkmale des Wassers (pH-Wert, Härte, Leitfähigkeit, Temperatur, Konzentration des gelösten Sauerstoffs, Restchlorgehalt (wenn gemessen) und sonstige vorgenommene Messungen);
- —
- nominale und gemessene Trockenmasse in Prozent der Feuchtmasse (oder Verhältnis Trockenmasse/Feuchtmasse) des künstlichen Sediments; gemessene Trockenmasse in Prozent der Feuchtmasse (oder Verhältnis Trockenmasse/Feuchtmasse) bei Feldsedimenten;
- —
- Wasserqualität in den Prüfbecken (Temperatur, pH-Wert, Ammoniakgehalt, Gesamthärte und Konzentration des gelösten Sauerstoffs);
- —
- genaue Angaben zur Behandlung der Wasser-, Sediment- und Wurmproben, einschließlich aller Einzelheiten über Vorbereitung, Lagerung, Dotierungsverfahren und Extraktion, sowie zu Analyseverfahren (und -genauigkeit) in Bezug auf den Prüfstoff und den Lipidgehalt und Wiederauffindungsraten des Prüfstoffs.
|
| Ergebnisse- —
- Mortalität der Kontrollwürmer und der Würmer in den einzelnen Prüfbecken sowie festgestellte subletale Wirkungen einschließlich anomalen Verhaltens (z. B. Verlassen des Sediments, Vorhandensein oder Fehlen von Kotbällchen, fehlende Reproduktion);
- —
- gemessene Trockenmasse in Prozent der Feuchtmasse (oder Verhältnis Trockenmasse/Feuchtmasse) des Sediments und der Testorganismen (hilfreich für die Normalisierung);
- —
- Lipidgehalt der Würmer;
- —
- Kurven der Aufnahme- und Eliminationskinetiken des Prüfstoffs in den Würmern und die Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichtszustands;
- —
- Ca, Cs und Cw (gegebenenfalls mit Standardabweichung und Abweichungsbereich) für alle Probenahmen (wobei Ca in g kg– 1 Feucht- und Trockenmasse des Ganzkörpers und Cs in g kg– 1 Feucht- und Trockenmasse des Sediments und Cw in mg l– 1 ausgedrückt wird). Wird der Biota-Boden-Akkumulationsfaktor (BSAF, Begriffsbestimmung siehe Anlage 1) benötigt (z. B. für den Vergleich der Ergebnisse von zwei oder mehreren Tests, die mit Tieren mit unterschiedlichem Lipidgehalt durchgeführt wurden), so kann Ca zusätzlich als g kg– 1 Lipidgehalt des Organismus und Cs als g kg– 1 organischer Kohlenstoff (OC) des Sediments ausgedrückt werden;
- —
- BAF (ausgedrückt in kg Sediment (Feuchtmasse)·kg– 1 Wurm (Feuchtmasse)), Sediment-Aufnahmekonstante ks (ausgedrückt in g Sediment (Feuchtmasse) g– 1 Wurm (Feuchtmasse) d– 1) und Eliminationskonstante ke (ausgedrückt in d– 1); außerdem kann zusätzlich der BSAF (ausgedrückt in kg Sediment organischer Kohlenstoff kg– 1 Lipidgehalt des Wurms) angegeben werden;
- —
- nicht eliminierte Rückstände (NER) am Ende der Eliminationsphase;
- —
- falls gemessen: Prozentanteile des Ausgangsstoffs, Abbauprodukte und gebundener Rückstände (d. h. Gehalt an Prüfstoff, der sich nicht mit gewöhnlichen Extraktionsmethoden extrahieren lässt) in den Testtieren;
- —
- Methoden, die zur statistischen Datenanalyse verwendet wurden.
|
| Auswertung der Ergebnisse- —
- Übereinstimmung der Ergebnisse mit den Validitätskriterien gemäß Nummer 21;
- —
- unerwartete oder ungewöhnliche Ergebnisse, z. B. unvollständige Elimination des Prüfstoffs aus den Testtieren; in diesen Fällen können Ergebnisse aus Vorversuchen hilfreiche Informationen beinhalten.
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Anlage 1Begriffsbestimmungen und Einheiten
Künstliches Sediment oder formuliertes, rekonstituiertes oder synthetisches Sediment: ein Gemisch aus Stoffen, mit denen die physikalischen Bestandteile eines natürlichen Sediments nachgeahmt werden sollen.
Bioakkumulation: Konzentrationszunahme (Anreicherung) des Prüfstoffs in oder an einem Organismus bezogen auf die Prüfstoffkonzentration im umgebenden Medium; die Bioakkumulation ergibt sich aus Biokonzentrations- und Biomagnifikationsvorgängen (siehe unten).
Bioakkumulationsfaktor (BAF): zu jedem beliebigen Zeitpunkt während der Aufnahmephase dieses Bioakkumulationstests der Quotient aus der Konzentration des Prüfstoffs in/an dem Testorganismus (Ca in g·kg– 1 Feucht- oder Trockenmasse) und der Konzentration des Prüfstoffs im umgebenden Medium (Cs in g·kg– 1 Feucht- oder Trockenmasse des Sediments); entsprechend den Einheiten von Ca und Cs wird der BAF in kg Sediment kg– 1 Wurm angegeben (15).
Bioakkumulationsfaktoren: die direkt anhand des Verhältnisses der Sediment-Aufnahmekonstante zu den Eliminationskonstanten (ks und ke, siehe unten) berechnet werden; werden als kinetischer Bioakkumulationsfaktor (BAFK) bezeichnet.
Biokonzentration: Konzentrationszunahme (Anreicherung) des Prüfstoffs in oder an einem Organismus, ausschließlich aufgrund der Aufnahme über die Körperoberfläche, bezogen auf die Prüfstoffkonzentration im umgebenden Medium.
Biomagnifikation: die Konzentrationszunahme (Anreicherung) des Prüfstoffs in oder an einem Organismus, die hauptsächlich aus der Aufnahme des Prüfstoffs über kontaminiertes Futter oder kontaminierte Beute resultiert, bezogen auf die Prüfstoffkonzentration im Futter bzw. in der Beute; Biomagnifikation kann zum Transfer oder zur Anreicherung des Prüfstoffs in Nahrungsketten oder -netzen führen.
Biota-Sediment-Akkumulationsfaktor (BSAF): Quotient aus der auf den Lipidgehalt normierten Prüfstoffkonzentration in/an dem Testorganismus (Ca in g·kg-1 Lipidgehalt des Organismus) und der auf den organischen Kohlenstoffgehalt normierten Prüfstoffkonzentration im Sediment im Gleichgewichtszustand; Ca wird ausgedrückt in g·kg– 1 Lipidgehalt des Organismus; Cs wird in g·kg– 1 Gehalt des Sediments an organischen Bestandteilen angegeben.
Konditionierungsdauer: Zeitraum zur Stabilisierung der im Sediment vorhandenen Mikroorganismen und zur Abtrennung z. B. von Ammoniak, das aus Bestandteilen des Sediments erzeugt wurde; die Konditionierung erfolgt vor dem Dotieren des Sediments mit dem Prüfstoff. Gewöhnlich wird das Überstandswasser nach dem Konditionieren entsorgt.
Elimination eines Prüfstoffs: Ausscheidung des angereicherten Prüfstoffs aus dem Testorganismus durch aktive oder passive Prozesse, die unabhängig von An- oder Abwesenheit des Prüfstoffs im umgebenden Medium erfolgt.
Eliminationsphase: der Zeitraum, in dem nach Umsetzung der Testorganismen von kontaminiertem Medium in Prüfstofffreies Medium die Ausscheidung (oder der Nettoverlust) des Prüfstoffs durch die Testorganismen untersucht wird.
Eliminationskonstante (ke): der numerische Wert, der die Geschwindigkeit der Konzentrationsabnahme des Prüfstoffs in/an dem Testorganismus nach Umsetzung der Testorganismen aus einem mit dem Prüfstoff belasteten Medium in Prüfstofffreies Medium definiert; ke wird in Tag– 1 (d– 1) angegeben.
Ausgleichszeit: Zeit zur Verteilung des Prüfstoffs zwischen Festphase, Porenwasser und Überstandswasser; der Ausgleich erfolgt nach dem Dotieren des Sediments mit dem Prüfstoff und vor der Zugabe der Testorganismen.
Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (Kow): Verhältnis zwischen der Konzentration eines Stoffs in n-Oktanol und in Wasser im Gleichgewicht, auch als Pow-Wert ausgedrückt; der Logarithmus von Kow (log Kow) gilt als Maß für das Anreicherungspotenzial eines Stoffs in aquatischen Organismen.
Koeffizient für die Verteilung organischer Kohlenstoff/Wasser (Koc): Verhältnis der Gleichgewichtskonzentration der Chemikalie im/am organischen Kohlenstoffanteil im Sediment zu derjenigen im Wasser.
Überstandswasser: das im Prüfgefäß über dem Sediment stehende Wasser.
Plateau oder Gleichgewichtszustand (steady state): Gleichgewicht zwischen den während der Aufnahmephase simultan auftretenden Aufnahme- und Eliminationsvorgängen; der Gleichgewichtszustand in der grafischen Darstellung einer Probenahme des zeitbezogenen BAF ist erreicht, wenn die Kurve parallel zur Zeitachse verläuft und wenn drei aufeinander folgende BAF-Analysen an Proben, die im Abstand von mindestens zwei Tagen genommenen werden, um höchstens ± 20 % voneinander abweichen, bzw. wenn es keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitabständen der drei Probenahmen gibt. Für Prüfstoffe, die nur langsam aufgenommen werden, ist ein zeitlicher Abstand zwischen den Probenahmen von sieben Tagen geeigneter (5).
Porenwasser oder Interstitialwasser: das Wasser in den Zwischenräumen zwischen Sediment- oder Bodenpartikeln.
Sediment-Aufnahmekonstante (ks): numerischer Wert, der die Geschwindigkeitsrate der Zunahme der Prüfstoffkonzentration im/am Testorganismus bei Anreicherung des Stoffs aus dem Sediment definiert. ks wird in g Sediment g– 1 Wurm d– 1 ausgedrückt.
Dotiertes Sediment: Sediment, zu dem der Prüfstoff hinzugegeben wurde.
Bioakkumulationsfaktor im Gleichgewichtszustand (steady state) (BAFss): BAF im Gleichgewichtszustand; ändert sich über einen längeren Zeitraum nicht wesentlich; die Konzentration des Prüfstoffs im umgebenden Medium (Cs ausgedrückt als g·kg– 1 Feucht- oder Trockenmasse des Sediments) ist während dieser Zeit konstant.
Aufnahme- oder Expositionsphase: Zeitraum, in dem die Testorganismen dem Prüfstoff ausgesetzt sind.
Anlage 2
Berechnung der Aufnahme- und Eliminationsparameter
Hauptendpunkt eines Bioakkumulationstests ist der Bioakkumulationsfaktor (BAF). Zur Berechnung des gemessenen BAF bildet man den Quotienten aus der Konzentration des Prüfstoffs im Testorganismus (Ca) und der Konzentration des Prüfstoffs im Sediment (Cs) im Gleichgewichtszustand. Wenn der Gleichgewichtszustand in der Aufnahmephase nicht erreicht wird, ist der BAF auf die gleiche Weise für Tag 28 zu berechnen. Es ist allerdings anzugeben, ob der BAF auf Konzentrationen im steady state beruht, oder nicht.
Der kinetische Bioakkumulationsfaktor (BAFK), die Konstante der Sedimentaufnahme (ks) und die Eliminationskonstante (ke) sollten vorzugsweise mit Methoden zur nicht linearen Parameterabschätzung per Computer ermittelt werden. Ausgehend von den zeitbezogenen durchschnittlichen Akkumulationsfaktoren (Ca, Mittelwerte zu den einzelnen Zeitpunkten der Probenahme/Cs, Mittelwerte zu den einzelnen Zeitpunkten der Probenahme = AF) der Aufnahmephase bezogen auf die Feuchtmasse der Würmer und des Sediments und der Modellgleichung
| AF(t) = BAF × (1 – eke × t) | [Gleichung 1] |
wobei AF(t) = Verhältnis der Konzentration des Prüfstoffs in den Würmern und der Konzentration im Sediment zu einem beliebigen Zeitpunkt (t) während der Aufnahmephase ist, werden mit entsprechender Software die Werte für BAFK, ks und ke berechnet.Wird während der Aufnahmephase ein Gleichgewichtszustand erreicht (d. h. t = ∞), kann Gleichung 1 reduziert werden auf:
 | [Gleichung 2] |
Dabei sind:| ks | = | Aufnahmekonstante im Gewebe [g Sediment kg– 1 Wurm d– 1] | | ke | = | Eliminationskonstante [d– 1] |
Damit stellt ks/ke × Cs eine Annäherung an die Konzentration des Prüfstoffs im Wurmgewebe im Gleichgewichtszustand (Ca,ss) dar.Der Biota-Boden-Akkumulationsfaktor (BSAF) ist wie folgt zu berechnen:
Dabei sind:
foc= Fraktion des organischen Kohlenstoffs im Sediment wahlweise bezogen auf die Trocken- oder die Feuchtmasse;
flip= Lipidfraktion in den Würmern wahlweise bezogen auf die Trocken- oder die Feuchtmasse.
Ausgehend von einer Zeitreihe von Konzentrationswerten kann die Eliminationskinetik mit folgenden Gleichungen und einer Computer-Berechnung nach einer nicht linearen Methode zur Parameterabschätzung modelliert werden.
⁶⁸⁵⁵Als Standard-Ausgangspunkt wird der Mittelwert der gemessenen Rückstände im Gewebe am Ende der Aufnahmephase empfohlen. ⁶⁸⁵⁶Der aus der Aufnahmephase modellierte/geschätzte Wert sollte nur dann verwendet werden, wenn beispielsweise der gemessene Wert signifikant von dem im Modell bestimmten Rückstand im Gewebe abweicht. ⁶⁸⁵⁷Zur alternativen Vorexposition von zur Elimination vorgesehenen Würmern siehe auch Nummer 50. Bei diesem Ansatz wird davon ausgegangen, dass Proben der vorexponierten Würmer an Tag 0 der Eliminationsphase ein realistisches Bild von den Rückständen im Körper bieten, das als Grundlage für die Ermittlung der Eliminationskinetik dienen kann.
Weisen die gegen die Zeit aufgetragenen Messwerte auf eine konstante exponentielle Abnahme der Prüfstoffkonzentration in den Tieren hin, so lässt sich der Eliminationsverlauf mit einem Ein-Kompartiment-Modell (Gleichung 4) beschreiben.
 | [Gleichung 3] |
Die Elimination kann zuweilen biphasisch verlaufen, mit einer raschen Abnahme von Ca in den Anfangsphasen und einem langsameren Verlust an Prüfstoff in den letzten Phasen der Elimination, z. B. (8)(19)(25). ⁶⁸⁶⁰Erklären lassen sich die beiden Phasen mit der Annahme, dass es im Organismus zwei verschiedene Kompartimente gibt, aus denen der Prüfstoff mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten eliminiert wird. ⁶⁸⁶¹Für diese Fälle wird auf die einschlägige Literatur verwiesen (15)(16)(17)(25).Eine Elimination in zwei Kompartimenten wird z. B. mit der folgenden Gleichung beschrieben (25):
 | [Gleichung 4] |
A und B bezeichnen die Größe der Kompartimente (in Prozent der Summe der Rückstände im Gewebe), wobei sich der Stoffverlust in Kompartiment A rasch vollzieht und der Prüfstoff in Kompartiment B nur in geringem Umfang verloren geht. ⁶⁸⁶³Die Summe von A und B ergibt 100 % des Volumens des vollständigen tierischen Kompartiments im Gleichgewichtszustand. ka und kb stehen für die entsprechenden Eliminationskonstanten [d– 1]. ⁶⁸⁶⁴Wenn das Modell mit den beiden Kompartimenten auf die Ausscheidungsdaten übertragen wird, kann die Aufnahmekonstante ks wie folgt bestimmt werden (53)(54): | [Gleichung 5] |
Trotzdem sind diese Modellgleichungen mit Vorsicht zu verwenden, insbesondere wenn sich die Bioverfügbarkeit des Prüfstoffs während des Tests ändert (42).⁶⁸⁶⁵Alternativ zu den oben beschriebenen Modellgleichungen können die Kinetikparameter (ks und ke) auch in einem Durchlauf berechnet werden, indem die Kinetikmodellgleichung erster Ordnung auf alle Daten aus der Aufnahme- und der Eliminationsphase gemeinsam angewendet wird. ⁶⁸⁶⁶Für die Beschreibung einer Methode, die eine solche kombinierte Berechnung der Aufnahme- und Eliminationskonstanten ermöglicht, wird auf (55), (56) und (57) verwiesen.
Die nicht eliminierten Rückstände (NER) sind als ein weiterer Endpunkt zu berechnen, indem das Verhältnis der durchschnittlichen Konzentration in den Würmern (Ca) an Tag 10 der Eliminationsphase zur durchschnittlichen Konzentration in den Würmern (Ca) im Gleichgewichtszustand (bzw. an Tag 28 der Aufnahmephase) mit 100 multipliziert wird:
Anlage 3
Beispiel eines Probenahmeplans bei einem 28-Tägigen Bioakkumulationstest
a) Aufnahmephase (einschließlich einer 4-tägigen Equilibrierungsphase)
| Tag | Arbeitsschritte | | – 6 | Herstellung einer Torfsuspension für das Sediment; Konditionieren der Suspension für 48 h; | | – 4 | Dotieren des Sediments oder der Sedimentfraktion; Mischen aller Bestandteile des Sediments; Entnahme von Proben des Sediments mit dem Prüfstoff und des Sediments aus der Lösungsmittelkontrolle zur Bestimmung der Konzentration des Prüfstoffs; Zugabe von Überstandswasser; Inkubation unter Prüfbedingungen (Equilibrierungsphase); | | – 3/– 2 | Entnahme der Testorganismen aus der Anzuchtkultur zwecks Akklimatisierung; | | 0 | Messung der Wasserqualität (siehe Nummer 52); Entnahme von Replikaten zur Probenahme von Wasser- und Sedimentproben zur Ermittlung der Prüfstoffkonzentration; randomisierte Verteilung der Würmer auf die Prüfbecken; Aufbewahrung einer ausreichenden Anzahl an Unterproben der Würmer zur Bestimmung des analytischen Hintergrunds; Kontrolle der Luftzufuhr bei Verwendung eines geschlossenen Prüfsystems; | | 1 | Entnahme von Replikaten zur Probenahme; Kontrolle der Luftzufuhr, des Verhaltens der Würmer und der Wasserqualität (siehe Nummer 56); Entnahme von Wasser, Sediment- und Wurmproben zur Bestimmung der Prüfstoffkonzentration; | | 2 | Kontrolle von Luftzufuhr, Wurmverhalten und Temperatur; | | 3 | wie Tag 1; | | 4 - 6 | wie Tag 2; | | 7 | wie Tag 1; gegebenenfalls Nachfüllen von verdunstetem Wasser; | | 8 - 13 | wie Tag 2; | | 14 | wie Tag 1; gegebenenfalls Nachfüllen von verdunstetem Wasser; | | 15 - 20 | wie Tag 2; | | 21 | wie Tag 1; gegebenenfalls Nachfüllen von verdunstetem Wasser; | | 22 - 27 | wie Tag 2; | | 28 | wie Tag 1; Messung der Wasserqualität (siehe Nummer 52); Ende der Aufnahmephase; Reservieren einer ausreichenden Anzahl von Teilproben von Würmern zur Bestimmung von analytischen Hintergrundwerten, Feucht- und Trockenmasse sowie Lipidgehalt; Umsetzen der Würmer aus den verbleibenden exponierten Replikaten in Gefäße mit sauberem Sediment für die Eliminationsphase (ohne Entleerung des Darminhalts); Entnahme von Wasser-, Sediment- und Wurmproben aus den Lösungsmittelkontrollen; Entnahme von Abscheidelösungen (wenn Abscheider vorhanden). | | ⁶⁸⁶⁸Die Arbeitsschritte vor der Exponierung (Equilibrierungsphase) sind unter Berücksichtigung der Eigenschaften des Prüfstoffs zu planen. ⁶⁸⁶⁹Wenn erforderlich, wird das hergestellte Sediment unter dem Überstandswasser 7 Tage bei 20 ± 2 °C vorbehandelt. Das Sediment ist dann entsprechend früher herzustellen! | | Die für Tag 2 beschriebenen Arbeitsschritte sind täglich durchzuführen (mindestens an Werktagen). |
b) Eliminationsphase| Tag | Arbeitsschritte | | – 6 | Herstellung einer Torfsuspension für das Sediment; Konditionieren der Suspension für 48 h; | | – 4 | Mischen aller Bestandteile des Sediments; Entnahme von Proben des Sediments mit dem Prüfstoff und des Sediments aus der Lösungsmittelkontrolle zur Bestimmung der Konzentration des Prüfstoffs; Zugabe von Überstandswasser; Inkubation unter Prüfbedingungen; | | 0 (Tag 28 der Aufnahmephase) | Messung der Wasserqualität (siehe Nummer 52); Umsetzen der Würmer aus den verbleibenden exponierten Replikaten in Gefäße mit sauberem Sediment; nach 4-6 h Entnahme von Replikaten zur Probenahme von Wasser-, Sediment- und Wurmproben zur Ermittlung der Prüfstoffkonzentration; randomisierte Verteilung der Würmer auf die Becken; | | 1 | Entnahme von Replikaten zur Probenahme; Kontrolle der Luftzufuhr, des Verhaltens der Würmer und der Wasserqualität (siehe Nummer 52); Entnahme von Wasser, Sediment- und Wurmproben zur Bestimmung der Prüfsubstoffkonzentration; | | 2 | Kontrolle von Luftzufuhr, Wurmverhalten und Temperatur; | | 3 | wie Tag 1; | | 4 | wie Tag 2; | | 5 | wie Tag 1; | | 6 | wie Tag 2; | | 7 | wie Tag 1; gegebenenfalls Nachfüllen von verdunstetem Wasser; | | 8 - 9 | wie Tag 2; | | 10 | wie Tag 1; Ende der Eliminationsphase; Messung der Wasserqualität (siehe Nummer 52); Entnahme von Wasser-, Sediment- und Wurmproben aus den Lösungsmittelkontrollen; Entnahme von Abscheidelösungen (wenn Abscheider vorhanden). | | Das Sediment wird vor Beginn der Eliminationsphase auf dieselbe Weise zubereitet wie vor der Aufnahmephase. | | Die für Tag 2 beschriebenen Arbeitsschritte sind täglich durchzuführen (mindestens an Werktagen). |
Anlage 4Einige physikalisch-chemische Eigenschaften eines geeigneten Verdünnungswassers
| BESTANDTEILE | KONZENTRATION | | Partikelmaterial | < 20 mg/l | | Gesamtgehalt an organischen Kohlenstoffen | < 2μg/l | | Nichtionisiertes Ammonium | < 1 μg/l | | Restchlor | < 10 μg/l | | Gesamtanteil an organophosphorhaltigen Pestiziden | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden und polychlorierten Biphenylen | < 50 ng/l | | Gesamtgehalt an organischem Chlor | < 25 ng/l |
ZUSAMMENSETZUNG DES EMPFOHLENEN REKONSTITUIERTEN WASSERS| (a) | Calciumchloridlösung11,76 g CaCl2 2H2O werden in entionisiertem Wasser gelöst; anschließend wird entionisiertes Wasser bis zu einem Volumen von 1 l hinzugegeben.
|
| (b) | Magnesiumsulfatlösung4,93 g MgSO4 7H2O werden in entionisiertem Wasser gelöst; anschließend wird entionisiertes Wasser bis zu einem Volumen von 1 l hinzugegeben.
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| (c) | Natriumbicarbonatlösung2,59 g NaHCO3 werden in entionisiertem Wasser gelöst; anschließend wird entionisiertes Wasser bis zu einem Volumen von 1 l hinzugegeben.
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| (d) | Kaliumchloridlösung0,23 g KCl werden in entionisiertem Wasser gelöst; anschließend wird entionisiertes Wasser bis zu einem Volumen von 1 l hinzugegeben.
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Alle Chemikalien müssen Analysequalität haben.Die Leitfähigkeit des destillierten oder entionisierten Wassers darf höchstens 10 μScm– 1 betragen.
⁶⁸⁷⁹Von den Lösungen (a) bis (d) werden jeweils 25 ml gemischt; das Gesamtvolumen wird mit entionisiertem Wasser bis auf 1 l aufgefüllt. ⁶⁸⁸⁰Die Summe der Calcium- und der Magnesiumionen in dieser Lösung beträgt 2,5 mmol/l.
Der Anteil von Ca- zu Mg-Ionen liegt bei 4:1 und der Anteil der Na- zu K-Ionen bei 10:1. Die Säurekapazität KS4,3 dieser Lösung beträgt 0,8 mmol/l.
Das Verdünnungswasser wird bis zur Sauerstoffsättigung belüftet und anschließend ohne weitere Belüftung bis zur Verwendung zwei Tage gelagert.
Ein annehmbares Verdünnungswasser sollte einen pH-Wert von 6-9 aufweisen.
Anlage 5
Künstliches Sediment — Empfehlungen für die Herstellung und Lagerung
Anders als bei den Anforderungen der Prüfmethode C.8 (40) wird für das künstliche Sediment ein Torfgehalt von 2 % (statt 10 %) Trockenmasse empfohlen, damit ähnlich wie in natürlichen Sedimenten ein niedriger bis mäßiger Gehalt an organischen Bestandteilen gegeben ist (58).
Prozentanteil trockener Bestandteile des künstlichen Sediments:
| Bestandteile | Charakterisierung | % trockenes Sediment | | Torf | Torfmoos, Zersetzungsgrad: ‚mittel‘, luftgetrocknet, ohne sichtbare Pflanzenreste, fein gemahlen (Partikelgröße ≤ 0,5 mm). | 2 ± 0,5 | | Quarzsand | Partikelgröße: ≤ 2 mm, aber > 50 % der Partikel sollten eine Größe im Bereich 50-200 μm haben. | 76 | | Kaolin-Ton | Kaolinitgehalt ≤ 30 % | 22 ± 1 | | Futter | Folia urticae, gemahlene Blätter von Urtica sp.⁶⁸⁸⁸ (Brennnessel), fein gemahlen (Partikelgröße ≤ 0,5 mm) oder ein Gemisch aus gemahlenen Blättern von Urtica sp.⁶⁸⁸⁹ mit Alpha-Cellulose (1:1); nach Arzneimittelstandard, zum menschlichen Verzehr; zusätzlich zum trockenen Sediment | 0,4 - 0,5 | | Calciumcarbonat | CaCO3, in Pulverform, chemisch rein, zusätzlich zum trockenen Sediment | 0,05 - 1 | | Entionisiertes Wasser | Leitfähigkeit ≤ 10 μS/cm, zusätzlich zum trockenen Sediment | 30 - 50 |
Wenn erhöhte Ammoniakkonzentrationen erwartet werden (beispielsweise wenn bekannt ist, dass der Prüfstoff die Nitrifikation hemmt), kann es hilfreich sein, 50 % des stickstoffreichen Brennnesselpulvers durch Cellulose (z. B. α-Cellulosepulver, chemisch rein, Partikelgröße ≤ 0,5 mm) zu ersetzen.Zubereitung
Der Torf wird luftgetrocknet und zu einem feinen Pulver (Partikelgröße ≤ 0,5 mm, keine sichtbaren Pflanzenrückstände) gemahlen. ⁶⁸⁹¹Mit einem Teil des zum trockenen Sediment hinzuzufügenden entionisierten Wassers wird mit einer Hochleistungs-Homogenisierungseinrichtung eine Suspension aus der benötigten Menge des Torfpulvers hergestellt. ⁶⁸⁹²Zur Herstellung eines rührfähigen Torfschlamms hat sich ein Wasservolumen von 11,5 × Trockenmasse des Torfs bewährt (8).
⁶⁸⁹³Der pH-Wert dieser Suspension wird mit CaCO3 auf 5,5 ± 0,5 eingestellt. ⁶⁸⁹⁴Die Suspension wird mindestens zwei Tage unter sanftem Rühren bei 20 ± 2 °C vorbereitet, damit sich der pH-Wert stabilisieren und ein stabiler Gehalt an Mikroorganismen entwickeln kann. Danach wird der pH-Wert nochmals gemessen und erforderlichenfalls mit CaCO3 auf 6,0 ± 0,5 eingestellt. ⁶⁸⁹⁵Anschließend wird die gesamte Suspension mit den übrigen trockenen Bestandteilen gemischt; dabei sind die Dotierungsanteile zu beachten. ⁶⁸⁹⁶Unter Zugabe des übrigen entionisierten Wassers wird ein homogenes Sediment hergestellt. Danach wird erneut der pH-Wert gemessen und erforderlichenfalls mit CaCO3 auf 6,5-7,5 eingestellt. ⁶⁸⁹⁷Wenn davon ausgegangen wird, dass sich Ammoniak bildet, kann es hilfreich sein, den pH-Wert des Sediments unter 7,0 zu halten (z. B. zwischen 6,0 und 6,5). ⁶⁸⁹⁸Anhand von Sedimentproben werden die Trockenmasse und der Gehalt an organischem Kohlenstoff bestimmt. ⁶⁸⁹⁹Wenn eine Ammoniakbildung erwartet wird, kann das künstliche Sediment sieben Tage unter den Bedingungen des anschließenden Versuchs (z. B. Verhältnis Sediment:Wasser 1:4, Höhe der Sedimentschicht wie in den Prüfgefäßen) gelagert werden, bevor es mit dem Prüfstoff dotiert wird, d. h., das Sediment ist mit belüftetem Wasser aufzufüllen. ⁶⁹⁰⁰Nach dieser Konditionierung ist das Überstandswasser zu entfernen und zu entsorgen. ⁶⁹⁰¹Anhand von Sedimentproben werden die Trockenmasse und der Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff bestimmt (z. B. anhand von drei Proben).
⁶⁹⁰²Anschließend wird der dotierte Quarzsand mit dem Sediment in den verschiedenen Konzentrationen gemischt; das Sediment wird auf die als Replikate zu verwendenden Prüfgefäße verteilt und mit dem Testwasser aufgefüllt (z. B. in einem Sediment-Wasser-Verhältnis von 1:4, Höhe der Sedimentschicht wie in den Prüfgefäßen). ⁶⁹⁰³Danach werden die Gefäße unter den Bedingungen des durchzuführenden Versuchs konditioniert. ⁶⁹⁰⁴Nun beginnt die Ausgleichszeit. ⁶⁹⁰⁵Das Überstandswasser ist zu belüften.
⁶⁹⁰⁶Das ausgewählte Futter wird hinzugegeben, bevor oder während das Sediment mit dem Prüfstoff dotiert wird. ⁶⁹⁰⁷Es kann anfänglich mit der Torfsuspension gemischt werden (s. o.). ⁶⁹⁰⁸Ein übermäßiger Abbau des Futters vor der Zugabe der Testorganismen (z. B. bei langer Equilibrierungszeit) kann vermieden werden, indem der Zeitraum zwischen der Zugabe des Futters und dem Beginn der Exposition möglichst verkürzt wird. ⁶⁹⁰⁹Um sicherzustellen, dass das Futter ausreichend mit dem Prüfstoff in Berührung kommt, ist das Futter spätestens am Tag der Dotierung des Prüfstoffs in das Sediment mit dem Sediment zu mischen. ⁶⁹¹⁰Ausnahmen sind möglich, wenn es aufgrund der Dauer der Equilibrierungsphase zu einem übermäßigen Abbau des Futters durch Mikroorganismen kommt, bevor die Testorganismen eingesetzt werden. ⁶⁹¹¹Anhand von Sedimentproben werden die Trockenmasse und der Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff bestimmt (z. B. anhand von drei Proben des dotierten Sediments oder des Kontrollsediments).
Die Trockenmasse der Bestandteile (Torf, Sand und Kaolin) ist in g sowie als Prozentanteil der gesamten Trockenmasse anzugeben.
Das Volumen des bei der Herstellung des Sediments hinzuzugebenden Wassers ist ebenfalls in Prozent der gesamten Trockenmasse zu protokollieren. (Die Angabe 100 % Trockenmasse + 46 % Wasser beispielsweise bedeutet, dass auf 1 000 g (Trockenmasse) insgesamt 460 ml Wasser kommen; entsprechend ergibt sich eine Feuchtmasse des Sediments von 1 460 g.)
Lagerung
Die trockenen Bestandteile des künstlichen Sediments können an einem trockenen und kühlen Ort bei Raumtemperatur gelagert werden. Das hergestellte feuchte Sediment kann (zur späteren Verwendung ausschließlich in der Kultur) bei 4 ± 2 °C im Dunkeln über einen Zeitraum von 2-4 Wochen ab dem Tag der Herstellung aufbewahrt werden (8).
⁶⁹¹⁵Das Sediment ist unmittelbar nach dem Auftragen des Prüfstoffs zu gebrauchen, sofern keine Informationen darüber vorliegen, dass das betreffende Sediment gelagert werden kann, ohne dass die Toxizität und Bioverfügbarkeit des Prüfstoffs beeinflusst wird. ⁶⁹¹⁶In diesem Fall können Proben des dotierten Sediments bis zur Analyse unter den für den betreffenden Prüfstoff empfohlenen Bedingungen gelagert werden.
Anlage 6
Empfohlene Oligochaeten-Arten für Bioakkumulationstests
Tubifex tubifex (MÜLLER), Tubificidae, Oligochaeta
Der Schlammröhrenwurm (Tubificidae, Oligochaeta) Tubifex tubifex (Müller) bewohnt mit Schleim ausgekleidete Röhren in Süßwassersedimenten. ⁶⁹¹⁸In diesen Röhren leben die Würmer mit dem Kopf nach unten und nehmen Sedimentpartikel auf; verwertet werden die mit den Partikeln verbundenen Mikroorganismen sowie organische Abfälle. ⁶⁹¹⁹Der hintere Teil der Würmer treibt gewöhnlich im Überstandswasser, um die Tiere mit Sauerstoff zu versorgen. Tubifex tubifex bewohnt zwar vielfältige Sedimenttypen auf der gesamten nördlichen Halbkugel, bevorzugt aber verhältnismäßig feine Partikelgrößen (59). ⁶⁹²¹Die Eignung dieser Art für Ökotoxizitätsprüfungen wird beispielsweise in (8)(29)(31)(39)(60)(62)(63) bestätigt.
Kulturmethoden
Damit eine ausreichende Anzahl an Würmern (Tubifex tubifex) für die Bioakkumulationstests verfügbar ist, müssen die Würmer in einer Dauerkultur vorrätig gehalten werden. Für eine T.-tubifex-Kultur wird ein System mit einem künstlichen Sediment auf der Grundlage des künstlichen Bodens gemäß Prüfmethode C.8 (40) und mit rekonstituiertem Wasser nach Prüfmethode C.1 empfohlen (8).
⁶⁹²⁴Als Kulturgefäße können Glas- oder Edelstahlbehältnisse mit einer Höhe von 12-20 cm verwendet werden. ⁶⁹²⁵In die Kulturgefäße wird jeweils eine Schicht des feuchten künstlichen Sediments gefüllt, das wie in Anlage 5 beschrieben hergestellt wurde. Die Sedimentschicht muss so tief sich, dass die Würmer sich in natürlicher Weise eingraben können (bei T. tubifex mindestens 2 cm tief). ⁶⁹²⁷Zum System wird rekonstituiertes Wasser hinzugegeben. ⁶⁹²⁸Dabei ist darauf zu achten, dass das Sediment möglichst wenig gestört wird. ⁶⁹²⁹Der Wasserkörper ist mit einer Pasteur-Pipette, die etwa 2 cm über der Sedimentoberfläche angesetzt wird, schwach zu belüften (z. B. 2 Blasen mit 0,45 μm gefilterter Luft pro Sekunde). ⁶⁹³⁰Die Testtemperatur sollte 20 ± 2 °C betragen.
⁶⁹³¹Die Würmer werden bis zu einer Besatzdichte von maximal 20 000 Tieren/m2 Sedimentoberfläche eingesetzt. ⁶⁹³²Eine höhere Besatzdichte kann das Wachstum und die Vermehrung der Tiere beeinträchtigen (43).
⁶⁹³³In Kulturen mit künstlichen Sedimenten müssen die Würmer gefüttert werden. ⁶⁹³⁴Als Zusatzfutter kann fein gemahlenes Fischfutter (z. B. TetraMin®) angeboten werden (8); Klerks 1994, persönliche Auskunft. ⁶⁹³⁵Das Fütterungsprotokoll muss ein ausreichendes Wachstum und eine ausreichende Vermehrung ermöglichen und in der Kultur die Entstehung von Ammoniak und das Wachstum von Pilzenauf ein Minimum begrenzen. Das Futter kann zweimal wöchentlich bereitgestellt werden (z. B. 0,6-0,8 mg/cm2 Sedimentoberfläche). ⁶⁹³⁶Praktische Erfahrungen haben gezeigt, dass die Bereitstellung von in entionisiertem Wasser suspendiertem und homogenisiertem Futter eine homogene Verteilung des Futters auf der Sedimentoberfläche in den Kulturbehältnissen erleichtert.
⁶⁹³⁷Um eine Anreicherung von Ammoniak zu vermeiden, ist das Überstandswasser mit einem Durchflusssystem oder mindestens einmal wöchentlich manuell auszutauschen. ⁶⁹³⁸In den Stammkulturen ist das Sediment alle drei Monate zu wechseln.
⁶⁹³⁹Wenn ausschließlich adulte Würmer benötigt werden, kann die Entnahme aus der Kultur erfolgen, indem das Kultursediment durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm gesiebt wird. ⁶⁹⁴⁰Wenn Kokons ausgesiebt werden sollen, ist eine Maschenweite von 0,5 mm zu empfehlen; für juvenile Würmer ist eine Maschenweite von 0,25 mm geeignet. ⁶⁹⁴¹Die Siebe können nach dem Aussieben des Sediments in rekonstituiertes Wasser gestellt werden. ⁶⁹⁴²Die Würmer verlassen dann das Sieb und können mit einer weichen Stahlpinzette oder mit einer feuerpolierten Pipette aus dem Wasser aufgenommen werden.
⁶⁹⁴³Zur Durchführung eines Tests und zur Anlage neuer Kulturen dürfen ausschließlich unversehrte und eindeutig identifizierte Exemplare der Art Tubifex tubifex (z. B. (64)) verwendet werden. ⁶⁹⁴⁴Tote oder verletzte Würmer sowie von Pilzhyphen befallene Kokons sind zu entsorgen.
⁶⁹⁴⁵Aus einer synchronisierten Kultur können nach Bedarf in geeigneten Zeitabständen Würmer einer bestimmten Altersstufe entnommen werden. ⁶⁹⁴⁶In den ausgewählten Intervallen (z. B. alle zwei Wochen) werden neue Kulturgefäße mit Tieren einer bestimmten Altersstufe (z. B. in Kokons) angesetzt. ⁶⁹⁴⁷Bei den hier beschriebenen Kulturbedingungen haben die Würmer das adulte Stadium nach 8-10 Wochen erreicht. ⁶⁹⁴⁸Die Kulturen können entnommen werden, wenn die Würmer neue Kokons abgelegt haben (etwa nach 10 Wochen). ⁶⁹⁴⁹Die entnommenen adulten Tiere können für Tests verwendet werden, und mit den Kokons können neue Kulturen angelegt werden.
Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta
Lumbriculus variegatus, Lumbriculidae, Oligochaeta, lebt ebenfalls weltweit in Süßwassersedimenten und wird häufig in Ökotoxizitätsprüfungen verwendet. Informationen zur Biologie, zu Kulturbedingungen und zur Empfindlichkeit dieser Art sind den Quellen (1)(6)(9)(36) zu entnehmen. Lumbriculus variegatus kann in dem auch für T. tubifex empfohlenen künstlichen Sediment kultiviert werden; dabei sind allerdings gewisse Einschränkungen zu beachten (8). Da L. variegatus in der Natur gröbere Sedimente bevorzugt als T. tubifex (59), können Laborkulturen mit dem für T. tubifex verwendeten künstlichen Sediment nach 4-6 Monaten zum Erliegen kommen. Erfahrungsgemäß kann L. variegatus in einem sandigen Substrat (z. B. Quarzsand oder feiner Kies) in einem Durchflusssystem mit Fischfutter über mehrere Jahre gehalten werden, ohne dass das Substrat erneuert werden muss. Ein wichtiger Vorzug von L. variegatus gegenüber anderen aquatischen Oligochaeten ist die rasche Vermehrung mit entsprechend rascher Zunahme der Biomasse bei in Labors gezogenen Populationen ((1), (6), (9) und (10)).
Kulturmethoden
Die Kulturbedingungen für Lumbriculus variegatus werden eingehend in Phipps et al. ⁶⁹⁵⁷(1993) (10), Brunson et al. ⁶⁹⁵⁸(1998) (28), ASTM (2000) (1) und U.S. EPA (2000) (6) beschrieben. ⁶⁹⁵⁹Im Folgenden werden diese Bedingungen kurz zusammengefasst.
⁶⁹⁶⁰Die Würmer können in großen Aquarien (57-80 l) bei 23 °C mit einer Photoperiode von 16 L:8 D (100-1 000 lx) und täglichem Austausch des natürlichen Wassers (45 — 50 l pro Aquarium) gezogen werden. ⁶⁹⁶¹Das Substrat wird hergestellt, indem ungebleichte braune Papiertücher in Streifen geschnitten und einige Sekunden mit Kulturwasser befeuchtet werden, damit ein Substrat aus kleinen Papierteilchen entsteht. Dieses Substrat kann dann umgehend im Aquarium zur Zucht von Lumbriculus verwendet werden, indem der Boden des Aquariums bedeckt wird; es kann aber auch in entionisiertem Wasser bis zur Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt gefroren gelagert werden. ⁶⁹⁶²In einem Becken hält das frische Substrat etwa zwei Monate.
⁶⁹⁶³Jede Wurmkultur wird mit 500-1 000 Würmern begonnen; die Würmer werden dreimal wöchentlich mit 10 ml einer Suspension mit 6 g Forellen-Starterfutter gefüttert (bei Erneuerung oder Durchflussbedingungen). ⁶⁹⁶⁴Um der Ausbreitung von Bakterien und Pilzen entgegenzuwirken, werden statische und semistatische Kulturen seltener gefüttert. ⁶⁹⁶⁵Das Futter und das Papiersubstrat werden auf die in Bioakkumulationstests zu verwendenden Stoffe untersucht.
Unter diesen Bedingungen verdoppelt sich die Anzahl der Tiere in der Kultur gewöhnlich in 10-14 Tagen.
Lumbriculus variegatus kann aus den Kulturen entnommen werden, z. B. indem das Substrat durch ein feinmaschiges Sieb gegeben wird oder indem die Organismen mit einer feuerpolierten Glaspipette mit weiter Öffnung (ca. ⁶⁹⁶⁸5 mm Durchmesser) in ein separates Becherglas gegeben werden. ⁶⁹⁶⁹Wenn auch das Substrat in das Becherglas gegeben wird, ist das Glas mit den Würmern und dem Substrat über Nacht unter kontinuierlichem Durchfluss zu spülen; dabei wird das Substrat aus dem Glas abgetrennt, und die Würmer bleiben am Boden des Gefäßes zurück. ⁶⁹⁷⁰Anschließend können die Würmer in die neuen Kulturbehältnisse gesetzt oder weiter im Test verwendet werden, wie in (1) und (6) beschrieben. ⁶⁹⁷¹Verletzungen und die Provokation von Autotomieverhalten sind zu vermeiden, beispielsweise durch Handhabung der Würmer mit Pipetten mit feuerpolierten Kanten oder mit Edelstahl-Zahnstochern.
Als kritisch ist zu bewerten, wenn sich L. variegatus in Tests zur Bioakkumulation in Sedimenten in der Reproduktionsphase befindet (Architomie nach Morphallaxis). Diese geschlechtslose Vermehrung führt zur Entstehung von zwei Fragmenten, die eine bestimmte Zeit keine Nahrung mehr aufnehmen, bis sich das Kopf- bzw. Schwanzende regeneriert hat (z. B. (36), (37)). Anders als bei Tubificiden, die sich nicht durch Teilung vermehren, kann bei L. variegatus keine kontinuierliche Aufnahme von Sedimenten und Verunreinigungen durch Ingestion erfolgen.
⁶⁹⁷⁵Daher sollte eine Synchronisierung vorgenommen werden, um die unkontrollierte Reproduktion und Regeneration und anschließend entsprechend große Unterschiede in den Testergebnissen zu minimieren. ⁶⁹⁷⁶Diese Unterschiede können auftreten, wenn bei einigen einzelnen Tiere eine Fragmentierung stattgefunden hat und diese daher über einen bestimmten Zeitraum keine Nahrung aufnehmen und entsprechend weniger als andere Exemplare, die sich im Versuch nicht geteilt haben, durch den Prüfstoff belastet sind (38). ⁶⁹⁷⁷10-14 Tage vor Beginn der Exposition werden die Würmer manuell zerteilt (Synchronisierung) (65). ⁶⁹⁷⁸Für den Test sind große Würmer zu verwenden, die keine Anzeichen einer kürzlich erfolgten Teilung aufweisen sollten. ⁶⁹⁷⁹Diese Würmer können auf einen Glasträger in einen Tropfen Kulturwasser gesetzt und in der Mitte des Körpers mit einem Skalpell durchgeschnitten werden. ⁶⁹⁸⁰Dabei ist allerdings darauf zu achten, dass die hinteren Enden ähnlich groß sind. ⁶⁹⁸¹Danach wird abgewartet, bis die hinteren Enden in einem Kulturgefäß, welches das auch in der Testkultur verwendete Substrat sowie rekonstituiertes Wasser enthält, neue Kopfteile ausgebildet haben. ⁶⁹⁸²Erst dann kann mit der Exposition begonnen werden. ⁶⁹⁸³Die Kopfteile haben sich dann regeneriert, wenn die synchronisierten Würmer sich im Substrat eingraben. ⁶⁹⁸⁴(Dass sich Kopfteile regeneriert haben, kann zusätzlich durch Sichtprüfung einer repräsentativen Teilprobe unter einem binokularen Mikroskop festgestellt werden.) Danach kann davon ausgegangen werden, dass sich die Testorganismen in einem ähnlichen physiologischen Zustand befinden. ⁶⁹⁸⁵Wenn bei synchronisierten Würmern während des Versuchs eine Reproduktion durch Morphallaxis erfolgt, ist also anzunehmen, dass praktisch alle Tiere in gleichem Umfang dem dotierten Sediment ausgesetzt wurden. ⁶⁹⁸⁶Die synchronisierten Würmer werden gefüttert: wenn die Würmer beginnen, sich in das Substrat einzugraben, oder 7 Tage nach dem Zerteilen. ⁶⁹⁸⁷Die Fütterung sollte etwa der Fütterung der regulären Kulturen vergleichbar sein; es kann sich jedoch empfehlen, die synchronisierten Würmer mit Futter derselben Herkunft wie im eigentlichen Versuch zu versorgen. ⁶⁹⁸⁸Die Würmer sind bei der vorgesehenen Versuchstemperatur zu halten (d. h. bei 20 ± 2 °C). ⁶⁹⁸⁹Nach der Regeneration werden unversehrte vollständige Würmer ähnlicher Größe, die nach einem leichten mechanischen Reiz aktiv schwimmen oder zu kriechen beginnen, für den Versuch verwendet. ⁶⁹⁹⁰Verletzungen und die Provokation von Autotomieverhalten sind zu vermeiden, beispielsweise durch Handhabung der Würmer mit Pipetten mit feuerpolierten Kanten oder mit Edelstahl-Zahnstochern.
Wenn Lumbriculus variegatus verwendet wird, ist während des Tests unter angemessenen Bedingungen wegen der spezifischen Reproduktionsform bei dieser Art eine Erhöhung der Anzahl der Würmer zu erwarten (6). Eine fehlende Reproduktion bei einem Bioakkumulationstest mit L. variegatus ist zu protokollieren und bei der Interpretation der Testergebnisse zu berücksichtigen.
Branchiura sowerbyi (BEDDARD), Tubificidae, Oligochaeta (im Ringtest nicht validiert)
Branchiura sowerbyi lebt in verschiedenen Sedimenttypen (in Stauseen, Seen, Teichen und Flüssen), ursprünglich in tropischen Regionen. ⁶⁹⁹⁴Die Art ist aber auch in warmen Wasserkörpern in der nördlichen Hemisphäre anzutreffen. Häufiger kommt Branchiura sowerbyi allerdings in Schlamm-Ton-Sedimenten mit hohem Gehalt an organischen Bestandteilen vor. ⁶⁹⁹⁵Die Würmer leben in der Sedimentschicht. ⁶⁹⁹⁶Selbst das hintere Ende der Würmer ist gewöhnlich eingegraben. ⁶⁹⁹⁷Diese Art ist an den Kiemenfilamenten am hinteren Teil leicht zu erkennen. ⁶⁹⁹⁸Die adulten Tiere können eine Feuchtmasse von 40-50 mg und eine Länge von 9-11 cm erreichen. ⁶⁹⁹⁹Sie verfügen über eine hohe Reproduktionsrate; die Populationen verdoppeln sich unter den im Folgenden beschriebenen Temperatur- und Fütterungsbedingungen in weniger als 2 Wochen (Aston et al., 1982, (65)). B. sowerbyi wurde bereits sowohl in Toxizitätstests als auch in Untersuchungen zur Bioakkumulation verwendet (Marchese und Brinkhurst 1996 (31) bzw. Roghair et al. ⁷⁰⁰¹1996, (67)).
Kulturmethoden
Im Folgenden werden die Kulturbedingungen für Branchiura sowerbyi beschrieben (Angaben von Mercedes R. ⁷⁰⁰³Marchese, INALI, Argentinien, und Carla J. ⁷⁰⁰⁴Roghair, RIVM, Niederlande).
⁷⁰⁰⁵Die Testorganismen müssen nicht nach einem bestimmten Verfahren kultiviert werden. ⁷⁰⁰⁶Die Kultivierung kann in nicht kontaminiertem, natürlichem Sediment erfolgen (31). ⁷⁰⁰⁷Erfahrungsgemäß bietet ein aus natürlichem Sediment und Sand bestehendes Medium noch günstigere Lebensbedingungen für die Würmer als reines natürliches Sediment (32)(67). ⁷⁰⁰⁸Für die Kultur können 3-l-Bechergläser mit einem aus 1 500 ml Sediment und Wasser bestehenden Medium mit 375 ml natürlichem nicht kontaminiertem Sediment (ca. ⁷⁰⁰⁹10 % TOC, ca. ⁷⁰¹⁰17 % Partikel ≤ 63 μm), 375 ml sauberem Sand (M32) und 750 ml rekonstituiertem oder entchlortem Leitungswasser verwendet werden (31)(32)(67). ⁷⁰¹¹Papiertücher sind ebenfalls als Kultursubstrat geeignet; die Vermehrung erfolgt dann allerdings langsamer als in natürlichem Sediment. ⁷⁰¹²In semistatischen Systemen wird die Wasserschicht im Becherglas langsam belüftet, und das Überstandswasser ist wöchentlich zu erneuern.
⁷⁰¹³In jedes Becherglas werden zunächst 25 juvenile Würmer eingesetzt. ⁷⁰¹⁴Nach zwei Monaten werden die großen Würmer mit einer Pinzette aus dem Sediment genommen und in ein neues Becherglas mit frisch hergestelltem Sediment-Wasser-Medium eingesetzt. ⁷⁰¹⁵Das erste Becherglas enthält auch Kokons und juvenile Würmer. ⁷⁰¹⁶Auf diese Weise können bis zu 400 juvenile Würmer pro Becherglas gewonnen werden. ⁷⁰¹⁷Adulte Würmer können mindestens ein Jahr lang zur Vermehrung verwendet werden.
⁷⁰¹⁸Die Kulturen sind bei einer Temperatur von 21-25 °C zu halten. ⁷⁰¹⁹Die Temperatur darf maximal um ± 2 °C schwanken. ⁷⁰²⁰Die Entwicklung eines Embryos von der Eiablage bis zum Verlassen des Kokons dauert bei 25 °C gewöhnlich drei Wochen. Bei B. sowerbyi wurden bei einer Temperatur von 25 °C für jeden überlebenden Wurm im Schlamm 6,36 (31) bis 11,2 (30) Eier gezählt. ⁷⁰²²Die Anzahl der Eier pro Kokon schwankt von 1,8-2,8 (66)(69) bis zu 8 (68).
⁷⁰²³Der Anteil des gelösten Sauerstoffs sowie die Temperatur und der pH-Wert sind wöchentlich zu messen. ⁷⁰²⁴Fischfutter (z. B. TetraMin®) kann nach Bedarf zwei- bis dreimal wöchentlich als Suspension angeboten werden. ⁷⁰²⁵Alternativ können die Würmer auch mit aufgetautem Salat nach Bedarf gefüttert werden.
⁷⁰²⁶Ein wesentlicher Vorteil dieser Art ist die hohe individuelle Biomasse (bis zu 40-50 mg Feuchtmasse pro Tier). ⁷⁰²⁷Daher kann diese Art für Bioakkumulationstests mit nicht radioaktiv markierten Prüfstoffen verwendet werden. Die Exposition kann in den auch für T. tubifex oder L. variegatus verwendeten Systemen mit jeweils einem Tier pro Replikat erfolgen (11). ⁷⁰²⁹Wenn keine größeren Becken verwendet werden, ist die Anzahl der Replikate jedoch zu erhöhen (11). ⁷⁰³⁰Außerdem ist bei dieser Art eine Anpassung in Bezug auf das als Validitätskriterium berücksichtigte Eingrabungsverhalten vorzunehmen.
LITERATUR
| (1) | ASTM International (2000). ⁷⁰³²Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. ⁷⁰³³In ASTM International 2004 Annual Book of Standards. ⁷⁰³⁴Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ⁷⁰³⁵ASTM International, West Conshohocken, PA. |
| (2) | Europäische Kommission (2003). ⁷⁰³⁷Technical Guidance Document in support of Commission Directive 93/67/EEC on Risk Assessment for new notified substances, Commission Regulation (EC) No 1488/94 on Risk Assessment for existing substances and Directive 98/8/EC of the European Parliament and of the Council concerning the placing of biocidal products on the market; Part I — IV. ⁷⁰³⁸Amt für Veröffentlichungen der Europäischen Gemeinschaften), Luxemburg. |
| (3) | OECD (1992a). ⁷⁰⁴⁰Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. ⁷⁰⁴¹OECD Monographs No. 60. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris. |
| (4) | Ingersoll, C.G., Ankley, G.T., Benoit D.A., Brunson, E.L., Burton, G.A., Dwyer, F.J., Hoke, R.A., Landrum, P. F., Norberg-King, T. J., und Winger, P.V. (1995). ⁷⁰⁴³Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. ⁷⁰⁴⁴14, 1885-1894. |
| (5) | Kapitel C.13 dieses Anhangs, Biokonzentration: Durchfluss-Fischtest. |
| (6) | U.S. EPA (2000). ⁷⁰⁴⁷Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. ⁷⁰⁴⁸Second Edition. ⁷⁰⁴⁹EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000. |
| (7) | Kapitel C.27 dieses Anhangs, Chironomiden-Toxizitätstest in Sediment-Wasser-Systemen mit dotiertem Sediment |
| (8) | Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G. ⁷⁰⁵¹und Nagel, R. (1997). ⁷⁰⁵²Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. ⁷⁰⁵³Chemosphere 35, 835-852. |
| (9) | Ingersoll, C.G., Brunson, E.L., Wang N., Dwyer, F.J., Ankley, G.T., Mount D.R., Huckins J., Petty. J., und Landrum, P. F. (2003). ⁷⁰⁵⁵Uptake and depuration of nonionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. ⁷⁰⁵⁶Environmental Toxicology and Chemistry 22, 872-885. |
| (10) | Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A., und Mattson, V.R. (1993). ⁷⁰⁵⁸Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. ⁷⁰⁵⁹Environ.Toxicol. Chem. ⁷⁰⁶⁰12, 269-279. |
| (11) | Egeler, Ph., Römbke, J., Knacker, Th., Franke, C., und Studinger, G. (1999). ⁷⁰⁶²Workshop on ‚Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes‘, 26.-27.4.1999, Hochheim/Main, Deutschland. ⁷⁰⁶³Abschlussbericht zum F + E-Vorhaben 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin. |
| (12) | Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J., und Gilberg, D. (2006). ⁷⁰⁶⁵Validation of a sediment bioaccumulation test with endobenthic aquatic oligochaetes by an international ring test. ⁷⁰⁶⁶(Validierung einer Methode zur standardisierten Bioakkumulation mit endobenthischen aquatischen Oligochaeten) Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau), UBA-FB 202 67 437. |
| (13) | Kelly, J.R., Levine, S.N., Buttel, L.A., Kelly, A.C., Rudnick, D.T., und (1990). ⁷⁰⁶⁸Effects of tributyltin within a Thalassia seagrass ecosystem. ⁷⁰⁶⁹Estuaries 13, 301-310. |
| (14) | Nendza, M. (1991). ⁷⁰⁷¹QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations. In: R. ⁷⁰⁷²Nagel und R. ⁷⁰⁷³Loskill (Hrsg.): Bioaccumulation in aquatic systems. ⁷⁰⁷⁴Contributions to the assessment. ⁷⁰⁷⁵Zusammenfassung des internationalen Workshop, Berlin 1990. VCH, Weinheim |
| (15) | Landrum, P.F., Lee II, H., und Lydy, M.J. (1992). ⁷⁰⁷⁶Toxicokinetics in aquatic systems: Model comparisons and use in hazard assessment. Environ. Toxicol. Chem. ⁷⁰⁷⁷11, 1709-1725. |
| (16) | Markwell, R.D., Connell, D.W., und Gabric, A.J. (1989). ⁷⁰⁷⁹Bioaccumulation of lipophilic compounds from sediments by oligochaetes. Wat. Res. ⁷⁰⁸⁰23, 1443-1450. |
| (17) | Gabric, A.J., Connell, D.W., und Bell, P.R.F. (1990). ⁷⁰⁸²A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. ⁷⁰⁸³24, 1225-1231. |
| (18) | Kukkonen, J., und Landrum, P.F. (1994). ⁷⁰⁸⁵Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. ⁷⁰⁸⁶13, 1457-1468. |
| (19) | Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., Cohors-Fresenborg, D., und Jöhncke, U. (1994). ⁷⁰⁸⁸The assessment of bioaccumulation. ⁷⁰⁸⁹Chemosphere 29, 1501-1514. |
| (20) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. |
| (21) | U.S. EPA (1996). ⁷⁰⁹²Special Considerations for Conducting Aquatic Laboratory Studies. ⁷⁰⁹³Ecological effects test guidelines. ⁷⁰⁹⁴OPPTS 850.1000. ⁷⁰⁹⁵Public Draft. ⁷⁰⁹⁶EPA 712-C-96-113. U.S. Environmental Protection Agency. |
| (22) | Die folgenden Kapitel in diesem Anhang: | Kapitel A.5, Oberflächenspannung |
| Kapitel A.6, Wasserlöslichkeit |
| Kapitel A.8, Verteilungskoeffizient, Schüttelmethode |
| Kapitel A.24, Verteilungskoeffizient, HPLC-Methode |
| Kapitel C.7, Abbaubarkeit, Abiotischer Abbau: Hydrolyse in Abhängigkeit vom pH-Wert |
| Kapitel C.4 A-F, Bestimmung leichter biologischer Abbaubarkeit |
| Kapitel C.19, Schätzung des Adsorptionskoeffizienten (KOC) im Boden und in Klärschlamm mittels der Hochdruck-Flüssigchromatografie (HPLC). |
| Kapitel C.29, Leichte biologische Abbaubarkeit — Bestimmung von CO2 in geschlossenen Flaschen (Headspace-Test) |
|
| (23) | OECD (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. OECD-Veröffentlichungen zu Gesundheit und Arbeitsschutz, Reihe ‚Testing and Assessment‘, Nr. 3, OECD, Paris. |
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| (33) | Kapitel C.1 dieses Anhangs, Akute Toxizität für Fische. |
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Legende
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Der Verteilungskoeffizient (P) ist der Quotient zweier Konzentrationen. 
